СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ОБСЛЕДУЕМЫХ К ИНФИЦИРОВАНИЮ ВИРУСОМ ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА ПЕРВОГО ТИПА (ВИЧ-1) Российский патент 1999 года по МПК C12N15/48 C12Q1/68 A61K39/21 

Изобретение относится к области биотехнологии, генетической инженерии и медицинской генетики и может найти применение в медицине при диагностике генетической наследственной устойчивости индивида к инфицированию вирусом иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) и развитию синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД).

Известно, что вирус ВИЧ-1 инфицирует CD4+ клетки. В механизм инфицирования вовлечены корецепторы и при их недостаточности вирус ВИЧ-1 не способен проникать в CD4+ клетки и размножаться в организме лиц с нарушением функции корецепторов. Наиболее важным для проникновения вируса ВИЧ-1 в клетки является корецептор ССК-5 (Science, 1996, V. 273, N 5283, p. 1797) [1].

Известно, что структурный ген рецептора CCR5 расположен на хромосоме 3р21. Описана делеционная мутация в этом гене размером 32 пары оснований (п. о. ), приводящая к нарушению развития ВИЧ-1 вируса в CD4+ клетках (Science, 1996, V. 273, N 5283, p. 1856-1862) [2]. Известно, что гомозиготность по этой делеции приводит к полной генетической устойчивости к вирусу ВИЧ-1, а гетерозиготность по делеции в гене CRC5 рецептора приводит к более медленному развитию ВИЧ-1 инфекции и к более легкому клиническому течению СПИДа у лиц, инфицированных вирусом ВИЧ-1 (Nature. 1996, V.382. р. 722-725) [3].

Известен способ определения генетической устойчивости обследуемого к инфицированию вирусом ВИЧ-1 путем выявления делеционной мутации в структурном гене рецептора CCR5, включающий выделение ДНК обследуемого, амплификацию фрагментов структурного гена путем проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием двух праймеров, комплементарных двум участкам структурного гена, расположенным со стороны соответственно 5' и 3' концов выявляемой делеционной мутации, рестриктирование амплифицированных фрагментов ДНК ферментом Eco RI и определение длины полученных амплифицированных фрагментов и выявление делеционной мутации по полученным результатам определения [3].

Однако в данном известном способе используют праймеры, которые комплементарны таким участкам ДНК гена CCR5, которые расположены на значительном расстоянии от выявляемой делеционной мутации. Следствием этого является то, что в результате проведения ПЦР получают фрагменты амплифицированной ДНК значительной длины (около 800 п.н.). В результате этого амплифицированные фрагменты ДНК должны быть подвергнуты перед электрофорезом рестрикции, что повышает трудозатраты и расход реактивов. Результатом рестрикции является получение достаточно больших по размеру фрагментов ДНК размером 371-403 п.н. Точность выявления короткого участка делеции размером 32 п.н. в таких крупных фрагментах низкая. Кроме того, при проведении анализа по методу прототипа используют изотопномеченые соединения, что приводит к увеличению продолжительности анализа и повышает риск облучения персонала и загрязнения окружающей среды радиоактивными изотопами.

Техническим результатом, получаемым при реализации настоящего изобретения, является упрощение и ускорение определения у обследуемых гомозиготности или гетерозиготности по делеции 32 п.о. в гене CCR5 корецептора, повышение его достоверности, отказ от использования изотопномеченых соединений.

Достигается это тем, что в способе определения генетической устойчивости обследуемого к инфицированию вирусом ВИЧ-1 путем выявления делеционной мутации в структурном гене корецептора CCR5, включающем выделение ДНК обследуемого, амплификацию фрагмента структурного гена путем проведения ПЦР с использованием двух праймеров, комплементарных двум участкам структурного гена, расположенным со стороны 5' и 3' концов выявляемой делеционной мутации, определение размера полученных амплифицированных фрагментов и выявление делеционной мутации по полученным результатам определения.

Отличительной особенностью является то, что используют праймеры:
5' GGGTGGCTGTGTTTGCG 3' (Пр1)
5' ACCATGACAAGCGGCAGT 3' (Пр2)
В конкретном исполнении проводят предварительную обработку ДНК обследуемого путем нагревания в течение 4,5-5,5 минут при 94-96^oC, а затем проводят 25-35 циклов ПЦР. Каждый цикл состоит из последовательной термической обработки в течение 45-70 секунд при температуре 93-96^oC, 63-66^oC и 70-73^oC, после чего цикл повторяется. Длину амплифицированных фрагментов рекомендуется определять электрофорезом в 4-6% полиакриламидном геле с последующим окрашиванием зон локализации амплифицированных фрагментов ДНК бромистым этидием или нитратом серебра.

В отличие от прототипа [3] в новом способе впервые использованы новые праймеры, комплементарные тем участкам структурного гена корецептора CCR5, которые расположены на незначительном расстоянии от выявляемой делеционной мутации. Это позволяет получать при ПЦР короткие амплифицированные фрагменты структурного гена, что не требует проведения их рестрикции в дальнейшем - а значит отпадает необходимость в использовании дорогостоящей рестриктазы и необходимость трудозатрат на проведение данного этапа определения. Небольшой размер амплифицированных фрагментов структурного гена позволяет ускорить и упростить процесс определения их размеров и отказаться от использования изотопномеченых соединений.

На фиг. 1 представлена структура гена CCR5 в области делеционной мутации с локализацией относительного участка делеции новых предложенных в данном способе праймеров.

На фиг. 2 представлены результаты выявления у обследуемых лиц делеционной мутации в структурном гене CCR5.

Ниже приведены примеры реализации нового способа.

Пример 1.

Для определения генотипа по делеции в структурном гене CCR5 рецептора используют ДНК, выделенную из периферической крови или из клеток эпителия слизистой оболочки ротовой полости обследуемых.

Для выделения ДНК из крови 20 мкл крови, полученной из пальца, лизировали в 500 мкл бидистиллированной воды и ядра лимфоцитов периферической крови собирали центрифугированием при 12000 g в течение 10 минут. Супернатант отсасывали, осадок ресуспендировали в 100 мкл 5% раствора смолы Chelex-100 (Bio-Rad), прогревали 30 минут при 56^oC и 8 минут - при 95^oC. После этого проводили центрифугирование в течение 5 минут при 12000 g и 5 мкл супернатанта (выделенной ДНК) вносили в пробирку с 15 мкл буфера для полимеразной цепной реакции для термической денатурации ДНК и полимеразной цепной реакции.

Для выделения ДНК из клеток эпителия ротовой полости рот ополаскивали 20 мл дистиллированной воды и 1,5 мл полученного смыва центрифугировали в течение 10 минут при 12000 g. Супернатант отбирали, осадок клеток промывали дважды в 1 мл буфера ТЕ (pH 8,0) и после этого добавляли к осадку 100 мкл 5% раствора Chelex-100. Далее ДНК выделяли так же, как из клеток периферической крови.

Пример 2.

После начальной термической денатурации выделенной ДНК в течение 5 минут при 94^oC добавляли 1 ед. Taq ДНК полимеразы (производства Института молекулярной генетики РАН, Россия) и проводили 30 циклов полимеразной цепной реакции в следующем режиме: 1 минута при 95^oC, 1 минута при 64^oC и 1 минута при 72^oC.

Для амплификации несущего делецию размером 32 п.о. участка структурного гена CCR5 рецептора были использованы новые праймеры GGGTGGCTGTGTTTGCG (Пр1) и ACCATGACAAGCGGCAGT (Пр2), которые комплементарны участкам структурного гена, расположенным соответственно с 5' и 3' стороны области делеции на расстоянии 76 п.о. и 27 п.о.

После окончания 30 циклов полимеразной цепной реакции реакционную смесь инкубировали 10 минут при 72^oC и охлаждали до 4^oC.

Пример 3.

Полученные в процессе полимеразной цепной реакции амплифицированные фрагменты структурного гена CCR5 человека анализировали без какой-либо дополнительной обработки методом электрофореза в 5%-ном полиакриламидном неденатурирующем геле размером 200 мм х 160 мм x 0,5 мм. После проведения электофрореза гель окрашивали раствором бромистого этидия в дистиллированной воде с концентрацией 10 мкг/мл. Установили, что в случае гена CCR5 рецептора без делеции амплифицированный фрагмент имеет размер 175 п.о., в случае гена CCR5 рецептора с делецией амплифицированный фрагмент имеет размер 143 п.о.

Пример 4.

По методике примеров 1-3 проведен анализ образцов периферической крови у группы обследуемых из 9 человек на устойчивость к ВИЧ-1 инфекции. Результаты представлены на фиг. 2. Обнаружено 2 человека с частичной устойчивостью к ВИЧ-1 инфекции, 7 чувствительных к ВИЧ инфекции человек. У чувствительных к ВИЧ-1 инфекции выявляется только фрагмент размером 175 п.о. У лиц с частичной резистетностью к ВИЧ-1 инфекции выявляется два фрагмента - размером 175 и 143 п.о.

Все определение новым способом занимает 6 часов рабочего времени, тогда как определение по известному способу требует два рабочих дня.

Способ предназначен для определения генетической устойчивости обследуемых к инфицированию вирусом иммунодефицита человека. Способ включает выделение ДНК обследуемого, амплификацию структурного гена корецептора CCR 5 и проведение полимеразной цепной реакции. Далее проводят определение размера полученных амплифицированных фрагментов и выявление делеционной мутации. При этом используют праймеры следующей структуры:
5' GGGTGGCTGTGTTTGCG3'
5' ACCATGACAAGCGGCAGT3'.

Предложенный способ позволяет ускорить и упростить процесс определения устойчивости обследуемых к инфицированию. 2 з.п.ф-лы, 2 ил.

1. Способ определения генетической устойчивости обследуемых к инфицированию вирусом иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) путем выявления делеционной мутации в структурном гене корецептора CCR5, включающий выделение ДНК обследуемого, амплификацию структурного гена корецептора CCR5 путем проведения термической денатурации ДНК и последующей полимеразной цепной реакции с использованием двух праймеров, комплементарных двум участкам структурного гена, расположенным со стороны соответственно с 5' и 3' стороны выявляемой делеционной мутации, определение размера полученных амплифицированных фрагментов и выявление делеционной мутации по полученным результатам определения, отличающийся тем, что используют праймеры следующей структуры:
5'GGGTGGСTGTGTTTGСG3'
ACCATGACAAGCGGCAGT3'. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что предварительную термическую обработку ДНК обследуемого проводят путем нагревания в течение 4,5 - 5,5 мин при 94 - 96^oC, а затем проводят 25 - 35 циклов ПЦР, причем каждый цикл состоит из последовательной термической обработки в течение 45 - 70 с при температуре 93 - 96^oC, 63 - 66^oC и 70 - 73^oC, после чего цикл повторяется. 3. Способ по любому из пп. 1 и 2, отличающийся тем, что длину амплифицированных фрагментов определяют электрофорезом в 4 - 6% полиакриламидном геле с последующим окрашиванием зон локализации амплифицированных фрагментов ДНК бромистым этидием или нитратом серебра.