СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ГЛЮКОАМИЛАЗЫ Российский патент 2002 года по МПК C12N11/08 C12N9/34 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения иммобилизованной глюкоамилазы, и может быть использовано в пищевой промышленности с целью получения глюкозы в процессе гидролиза крахмала.

Известны способы иммобилизации глюкоамилазы на ионообменных материалах: КМ-сефадексе, ДЭАЭ-целлюлозе, ДЭАЭ - сефадексе, амберлите CG-50 [1, 2].

Наиболее близким аналогом является получение иммобилизованной глюкоамилазы на анионите АВ-17-2П, отработанном в сахарно-рафинадном производстве, отмытым от слабосвязанных красящих веществ кислотно-щелочной обработкой и выдержанным в ацетатном буфере (рН 4,5-4,7) в течение 14 ч при 20^oС. Процесс иммобилизации проводят при 40^oС с последующей отмывкой носителя от несвязавшегося белка. Полученный препарат обладает активностью 2,2 ед/г носителя (52% от активности свободного фермента) [3].

Недостатками этого способа являются необходимость предварительного активирования носителя, проведение процесса при повышенной температуре, невысокая активность полученных препаратов.

Заявляемое изобретение предназначено для расширения числа носителей, используемых для получения иммобилизованной глюкоамилазы. Их применение позволит получить продукт с большей активностью и упростить процесс (сорбция ведется при комнатной температуре).

Вышеуказанная задача решается за счет того, что в известном способе получения иммобилизованной глюкоамилазы, заключающемся в адсорбции фермента на органических носителях и отмывании от несвязавшегося белка, согласно изобретению, в качестве носителя используют неионогенный сорбент Стиросорб МХДЭ-100, полученный сшиванием полистирольных цепей монохлордиэтиловым эфиром, или макросетчатые комплексообразующие ионообменники АНКБ-2 и АНКБ-35.

Неионогенный сорбент Стиросорб МХДЭ-100 получен сшиванием полистирольных цепей монохлордиэтиловым эфиром, имеет 100% сшивки и относится к типу сверхсшитых сорбентов. Полистирольная сетка получается сшиванием цепей полистирола в набухшем состоянии и при высушивании обладает небольшой плотностью. Сорбент стремится увеличить свой объем до первоначального набухшего состояния, что приводит к интенсивному поглощению органических веществ. Внутренняя удельная поверхность Стиросорба МХДЭ-100 составляет 440 м²/г.

АНКБ-2 представляет собой окисленный сополимер 2-метил-5-винилпиридина и дивинилбензола (ДВБ). В качестве функциональных групп содержит амино- и карбоксильные группы.

АНКБ-35 получен карбоксиметилированием и аминированием химически модифицированного сополимера (ХМС) стирола и ДВБ и имеет в качестве функциональных амино- и карбоксильные группы.

Эти носители обладают высокой механической прочностью, значительной устойчивостью к сжатию, не подвержены действию микроорганизмов. Матрица при условиях технологического процесса не выделяет токсичных веществ.

Сорбцию проводят из раствора глюкоамилазы с рН 4,7±0,1, т.е. в области максимальной активности фермента, что обуславливает высокий выход по активности и получаемого биокатализатора. Вследствие макросетчатой структуры полимерного каркаса сорбента иммобилизованные молекулы фермента хорошо доступны для молекул субстрата. Препараты иммобилизованной глюкоамилазы имеют высокую активность (67-86% от активности свободного фермента), более термостабильны, чем нативный фермент, и могут быть неоднократно использованы в циклах расщепления углеводов.

Пример 1. Для подготовки Стиросорба МХДЭ-100 к работе его заливают ацетоном до полного набухания. Набухший сорбент отмывают дистиллированной водой до отсутствия ацетона в промывных водах. Сорбцию проводят в статических условиях при периодическом перемешивании. В колбу вместимостью 100 мл вносят навеску воздушно-сухого сорбента в количестве 0,5 г и заливают 50 мл раствора глюкоамилазы (рН 4,7±0,1) с удельной активностью 4,50 ед/мг белка. Иммобилизацию проводят в течение 24 ч. Количество иммобилизованного фермента определяют по уменьшению концентрации контактного раствора. После достижения равновесия носитель отделяют от раствора глюкоамилазы фильтрованием, промывают буферным раствором до полного исчезновения глюкоамилазной активности в промывных водах. Количество сорбированного белка - 12,0 мг/г сорбента. Удельная активность иммобилизованной глюкоамилазы в реакции гидролиза крахмала при рН 4,5-5,5 составляет 3,87 ед/мг белка или 86% от активности свободного фермента. Иммобилизованная глюкоамилаза характеризуется максимальной каталитической активностью при 65^oС.

Пример 2. Для удаления органических и неорганических примесей, содержащихся в товарных образцах, ионообменники АНКБ-2 и АНКБ-35 подвергают кондиционированию согласно ГОСТ 10896-72. Сорбционные опыты проводят аналогично примеру 1, используя в качестве носителя амфолит АНКБ-2. Количество сорбированного белка составляет 6,8 мг/г, глюкоамилазная активность - 3,63 ед/мг белка.

Пример 3. Аналогично 1, 2 в качестве сорбента применяют АНКБ-35. Препарат иммобилизованной глюкоамилазы обладает активностью 3,02 ед/мг белка, величина адсорбции - 4,7 мг/г носителя.

Источники информации
1. Иммобилизованные ферменты. // Под ред. И.В.Березина. - М.: 1976, т. 1,2.

2. Микробные ферменты и биотехнология // Под ред. В.М.Фогарти, К.Бек, К. Т.Кели и др. - М.: Агропромиздат, 1986, - с. 317.

3. Ковалева Т.А. Физико-химические и кинетико-термодинамические аспекты катализа свободными и иммобилизованными амилазами.: Автореф. дис.... докт. биол. наук. - Воронеж, 1998. - 269 с. (Прототип).

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в пищевой промышленности с целью получения глюкозы в процессе гидролиза крахмала. В предложенном способе в качестве носителя для иммобилизации используют Стиросорб МХДЭ-100 или макросетчатые комплексообразующие ионообменники АНКБ-2, АНКБ-35. Способ позволяет получить продукт с большей активностью и упростить процесс (сорбция ведется при комнатной температуре).

Способ получения иммобилизованной глюкоамилазы, заключающийся в адсорбции фермента на органическом носителе и отмывании от несвязавшегося белка, отличающийся тем, что в качестве носителя используют неионогенный сорбент Стиросорб МХДЭ-100, полученный сшиванием полистирольных цепей монохлордиэтиловым эфиром, или макросетчатые аминокарбоксильные ионообменники АНКБ-2, АНКБ-35.