СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ГЛЮКОАМИЛАЗЫ Российский патент 2003 года по МПК C12N11/08 C12N9/34 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения иммобилизованной глюкоамилазы, и может быть использовано в пищевой промышленности с целью получения глюкозы в процессе гидролиза крахмала.

Известны способы иммобилизации глюкоамилазы на следующих носителях: цеолите, коллагене, глиноземе, кремнеземе, КМ-целлюлозе, ДЭАЭ-целлюлозе, ДЭАЭ-сефадексе, амберлите IR-45 [1, 2].

Наиболее близким аналогом является получение иммобилизованной глюкоамилазы на волокнистом носителе ВИОН-КН 1 [3]. 5 г смолы в Н-форме оставляют на 16 часов при комнатной температуре в 25,6 мл ацетатного буфера (рН 4,5), далее добавляют 5 мл раствора глюкоамилазы (4•10^-5 моль/л) и перемешивают в течение 1,5 часов при температуре 40^oС, осадок промывают ацетатным буфером (10 мл, рН 4,5) и дистиллированной водой до отсутствия белка в промывных водах. Количество связанного белка составляет 13,3 мг/г, удельная активность - 46 ед/мг или 1% от активности нативной глюкоамилазы.

Недостатками этого способа является необходимость проведения процесса при повышенной температуре, низкая активность полученных препаратов.

Заявляемое изобретение предназначено для расширения числа носителей, используемых для получения иммобилизованной глюкоамилазы. Их применение позволит получить биокатализатор с большей активностью и упростить процесс (сорбция ведется при комнатной температуре).

Вышеуказанная задача решается за счет того, что в известном способе получения иммобилизованной глюкоамилазы, заключающемся в адсорбции фермента на органических носителях и отмывании от несвязавшегося белка, согласно изобретению в качестве носителей используют волокнистые сорбенты ФИБАН АК-22 и АК-22-1, содержащие звенья N-(2-аминоэтил)-2-имидазолина и акриловой кислоты.

Волокно АК-22 - полифункциональный анионит, содержащий карбоксильные группы. Статическая обменная емкость по кислотным группам составляет 1,2 мг-экв/г, по основным группам - 3,5-4,5 мг-экв/г. Диаметр моноволокон равняется 21 мкм [4, 5].

Волокно АК-22-1 имеет обменную емкость по кислотным группам 1,5 мг-экв/г, по основным - 4,0-5,0 мг-экв/г. Диаметр моноволокон составляет 30 мкм, отличается пониженным набуханием в щелочных растворах [6].

Предлагаемые волокнистые иониты имеют промышленную марку ФИБАН АК - 22 и АК-22-1, что позволяет упростить технологию процесса. Прочность волокон (170 МПа) достаточна для переработки их в нетканые материалы, что дает возможность изменять конструкционное оформление процесса. Волокна устойчивы в агрессивных средах, имеют хорошие гидравлические характеристики. Метод иммобилизации прост в исполнении, не требует химической модификации полимера-носителя. Физическая форма и свойства получаемого биокатализатора позволяют использовать его в непрерывных процессах. Количество адсорбированной глюкоамилазы в зависимости от типа волокна, концентрации фермента в растворе и времени адсорбции составляет 1,6-18,0 мг/г носителя. Благодаря макропористой структуре волокон иммобилизованные ферменты легко доступны для молекул субстрата. Активность биокатализаторов - 38-91% от нативной величины. Включенные в структуру волокна молекулы глюкоамилазы защищены от инактивирующего воздействия микроорганизмов и протеиназ. Препараты иммобилизованной глюкоамилазы имеют высокую активность, термостабильны и могут быть многократно использованы в циклах расщепления углеводов.

Пример 1.

0,5 г волокна АК-22 заливают 50 мл раствора глюкоамилазы (2,0•10^-6 моль/л) с удельной активностью 4500 ед/мг белка, приготовленного на основе ацетатного буфера (рН 4,7). Адсорбционную иммобилизацию фермента проводят в статических условиях при температуре 18-20^oС и периодическом перемешивании контактирующего буферного раствора фермента с носителем до установления равновесия в течение 24 ч. Количество иммобилизованного фермента определяют по разности количества белка в растворе до и после проведения процесса адсорбции. После достижения равновесия сорбент с иммобилизованным ферментом отделяют от раствора фильтрованием, промывают буферным раствором до исчезновения глюкоамилазной активности в промывных водах. Количество адсорбированной глюкоамилазы составляет 18,0 мг/г носителя. Активность иммобилизованной глюкоамилазы в реакции гидролиза крахмала равняется 1710 ед/мг белка.

Пример 2.

Сорбционные опыты проводят аналогично примеру 1, используя в качестве носителя волокнистый ионит АК-22-1. Количество адсорбированного белка - 16,9 мг/г сорбента, каталитическая активность - 4095 ед/мг белка или 91% от активности свободного фермента. Иммобилизованная глюкоамилаза проявляет максимальную каталитическую активность в диапазоне значений рН субстрата 4,0-5,0, температурный оптимум составляет 63-65^oС.

Источники информации
1. Иммобилизованные ферменты. / Под ред. Березина И.В. - М.: Изд-во МГУ, 1976, т. 1, 2.

2. Микробные ферменты и биотехнология. / Под ред. Фогарти В.М., Бек К., Кели К.Т. - М.: Агропромиздат, 1986, с.318.

3. Ковалева Т.А. Физико-химические и кинетко-термодинамические аспекты катализа свободными и иммобилизованными амилазами.: Автореф. дис.... докт. биол. наук. - Воронеж, 1998, 48 с. (прототип).

4. Солдатов B.C., Сергеев Г.И., Марцинкевич Р.В., Покровская А.И. Кислотно-основные и сорбционные свойства нового волокнистого ионита с группами замещенного имидазолина. // Журнал прикладной химии. - 1988, т.61, 1, с. 46-50.

5. Солдатов B. C. , Марцинкевич Р.В., Покровская А.И., Шункевич А.А. Влияние щелочной обработки на физико-химические свойства волокнистого ионита ФИБАН АК-22. // Журнал прикладной химии. - 1988, т.61, 10, с.2271-2275.

6. Солдатов B.C., Марцинкевич Р.В., Покровская А.И., Шункевич А.А. Гидролитическая устойчивость, набухание и потенциометрическое титрование аминокарбоксильного ионита АК-22-1. // Журнал прикладной химии. - 1994, т.67, 10, с.1644-1647.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в пищевой промышленности с целью получения глюкозы в процессе гидролиза крахмала. В предлагаемом способе иммобилизации глюкоамилазы в качестве носителя используются волокнистые иониты АК-22 и АК-22-1, содержащие звенья N-(2-аминоэтил)-2-имидазолина и акриловой кислоты. Способ прост в исполнении, не требует предварительной активации носителя, а иммобилизованный фермент сохраняет высокую активность и стабильность.

Способ получения иммобилизованной глюкоамилазы, заключающийся в адсорбции фермента на органическом носителе и отмывании от несвязавшегося белка, отличающийся тем, что в качестве носителя используют волокнистые сорбенты АК-22 и АК-22-1, содержащие в качестве функциональных групп звенья замещенных 2-имидазолинов.