Способ иммобилизации ферментов Советский патент 1982 года по МПК C07G7/02 

(54) СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ ФЕРМЕНТОВ

1

Изобретение офнооится к мш робиолопической промышленнаст1И, а им-енно к техниже получйни-я ферменттов, -ковалентло овязалных с 1юоите./1ем.

Известен сиособ иммобилизации ферментов,. включающий обр.аботку ««однфищированного у-аминотрогаилтриэтакоиаиланом кремнеземоодержащело нооителя сшивающим агенто,м и (связывание фермента с полученным иосителем II. В качестве ощивающего агента Используют диальдешды, нап)ример глута.ровый иди -малоновый диальделид, обычно в щиде 25% нOlГO раствора.

Связывание ферментов с обработаниьгм носителем 1ведут известными опособами в кнерпнюй (обычно водной) среде, отри температуре и рН, не вызьшаюпдах инактиваЦИ1И фермелта.

Однако глутаровый двальдегид, Используемый в .известном опосо бе в (Качестве сшивающего агента, при «ранении изменяет свои свойства, быст1ро -полгимеризуясь ва свету ;и .дри действии веществ основного характера; в процессе peaiKiffiTH глутаровый диальдегид поЛ(И мер1Изуется ла поверхности ам1ИНок1ремлезема, образуя продукты неусталовленноро Строения, что с одной стороны затрудняет ирощеоса модифнка ции носителя и И:Ммабил;иза-ци1и фермента, а с другой стороны, приводит к снижению активности полученлых иммобилизованных лрепаратов за счет уменьшения числа активных функциональных групп на

noBepxiHocTH носителя; активность п-олучен5 ных иммобилизованных ферментов колеблется в Щ|И рок1их пределах в зав1И;симости от степени очистки и qpoKa Х1ранения глутарового диальдегида.

Целью изобретения является повышение

10 активности иммобилизованных ферментов, улучшение их .качества, т. е. достижение стандартности получаемых препаратов.

Указаллая цель достигается тем, что в качестве Сшивающеюо агента используют

15 ащетали диальдегидрв, а обработку ими носителя осуществляют в присутствии кислоты. Причем в качестве кремнеземсодержащего носителя обычло используют оилохром, пористое стекло или -оиликагель, в

20 качестве ацеталей ди.альдеглдо1В-тетрамеТИЛ-, тетраэттил-, тетрабутилацетали глутарового |Или малонового диальделида; причем ацеталл используют обычно IB виде 1- 10%-ных рлстворов.

25 В отллч1ие от исходных карбанилыных соединений ацетали более устойчивы к действию щелочных и окисляющих агентов. Также как и исходные альдегады ацетали легко реаги(руют с азотисты;ми 1Оановал1ия30 ми, лалример с а1минами. Эти свойства ацеталей оозйоляют .успешно щрюводить MMIMOбидизац.ию фермйнтов, достигать сталдартных результатов с получаиие;м высо-коактивных ,им1М1об:илизо;в.аНных ферментов. Пример 1. Иммобилизация глюкоамилазы из Asp. niger с помощью тетраметилацеталя м:ал1онового диальдегида. К 1 г Силохрюма С-80, обработаиаого у-ам,иНО|Прогаилтр1Иэто«си:аил аном и содержащему 0,6 мг экв aiMHHonpynin иа 1 г, прибавляют 10 мл 2%Чноро раствора тетрлметилацеталя малоноеого диальдегида в 50%-№ом водном этаноле и 1 мл канщйнтрированлой соляной мислоты, шаремешивают 2 ч, .промывают 1спиртом, ао.дой. К активированному носителю пр:и.ба.вляют 10 мл раствора глюкоамилазы ие Asp. niger с Иммобилизация глюкоам на различных ; осителях, обраб малонового

Содержание

Носитель

Пористое стекло МПС-1100 (пористость 1,2 смз/г, пор 1100 А)

Спликагель МСА-750 (пористость 0,37 смз/г, пор 750 А)

Пр И м ер 2. Иммобилизация глюкоамилазы 1из Asp. niger с помощью тетраэтилацеталя глутарового альдепида.

К 1 г аилолрОма С-80, обработанного тет1раэтила;цеталем глутарового диальдегида согласно npHM-eipy 1, прибавляют 10 мл раствора глюкоамилазы .из Asp. niger с общей акти1вностью 200 ед в 0,1 н ацетатном буфере (рН 4,7). Реакционную смесь перемешивают в течение 5 ч при 25° С,

Иммобилизация глюкоамилазы из Asp. niger

на различных; носителях, обработанных тетраэтилацеталем

глутарового диальдегида 5 10 15

Количество

NH2 связанного белка, мг экв/г мг/г

96,120,4

64,3

после чего иммо1билизованный препарат промьшают 1 л субстрата (1%-иый раствор

растворимого крахмала), 1 л 0,1 н ацетатного буфера (рН 4,7) и затем 1 л воды. Активность 1И:Ммобиля13|Ова1нной глюкоамилазы 72 ед/г, .количество связанного белка 10,1 мг/г. Аналогично примеру 2 проводят

иммобилизацию глюкоамилазы на пористом стекл-е МПС-1100 и .аиликагеле МСА750. Полученные данные приведены в табл. 2.

Таблица 2 общей активностью 200 ед в 0,1 н ацетатном буфере (рН 4,7). Реакционную смесь перемешивают при 25° С в течение 5 ч, после чего иммобилизованный препарат промывают 1 л 1%-ното раствора растворимого крахмала для удаления хи1М ИЧбски несвязанного фермента, зате-м 1 л 0,1 и ацетатного буфера (рН 4,7) и 1 л воды. Активность иммо|билизо1В,анной глюкоамилазы 74,8 ед/г (определяют ло глюкозооксидазной методике «а приборе фирмы «Бекм.ан), количество связанного белка 18,7 мг/г. Аналопично .примеру 1 проводят иммобилизацию глюкоамилазы на ло.ристом стекле МПС-1100 и оиликагеле МСА750. Полученные данные приведены в табл. 1. Таблица 1 лазы из Asp. niger танных тетраметилацеталем ьдегида

Пример 3. Иммобилизация К1ислой протеииазы с помощью тетрабутилацеталя глутарового диальдегида.

К1 г силохрома С-80, обработаниого

30 тетрабутилацеталем глутарового диальдешда Согласно примеру 1, приливают расTBOip фарментного ярепа;рата (лротоаваморин Г25х) с общей активностью 132 едПС и содержанием белка 120 мг в 0,1 М универсальном буфере (рН 4,1). Реакционную смесь :И№куб:И|руют В течение 3 ч щя 5° С и перем1аш.и,за|Ним. По окончании реакции иммобилизованный лрепарат отмывают на фильт|ре 1 л воды, 1М |растваром хлористого натрия и опять водой до полного отсутстзия белка в шромьгвиых водах. Активность иммобилизованной «ислой протеиназы 132 едПС/1г, содержа1ние бел.ка 30 мг/г. (Протеол1итическую активность яативного и иммобилизованного препаратов кислой протеиназы определяют по казеинату натрия модифицярованным 1методом Ансона).

Аналогично описанию примера 3 проведена им.мо билизащия ;ки1слой протеиназы на аилох/рочме С-80 с помощью тетраметилацеталя :малонового диальделида. Акпивность иммобилизованной .кислой протеиназы 144 ед/г, количество связанного белка : 30 .мг/г.

Пример 4. Иммобиливащия нейтральной протеиназы с помощью тетраметилацеталя мало.нового диальдегида.

К 1 г аило;хрО1ма С-80, обработанному тетраметилацеталем :малонового диальдегида согласно гаримбру 1, приливаютраствор нейтральной протеиназы (протосубтилин ГЗх) с общей активностью ПО едПС и содерл-санием белка 50 мг в 0,1М универсальном буфере (рН 7,0); Реажщионную смесь инкубируют в течен1И1е 3 ч при 5° С и непрерывном перемещивании. По окончании реа ЮЦ:ии иМ.мобилизованный препарат отмывают 1 л 1ВОДЫ, l,OiM |растворО:М хларистого Н(атрия и ои.ять водой до полного отсутствия белка в npiOMbiBiHbix 1вод,ах. Активность н ммо билизованвой нейтральной протеиназы 14,3 едПС/г, содержание белка 14,0 мг/г.

Аналогичво прИ1меру 4 проводят иммобилизацию .нейтральной протеиназы с ломощью тетраэтиладеталя глутарового диальдепида. Активность иммобилизованной нейтральной шротеиназы 6,0 едПС/г, количество связанного белка 9,5 мг/г.

Пористое стекло AVnC-110-Э (порпс-I

гость 1,2 , пор 1100 А);0,36

Силикагсль Л СЛ-750 {пор;1Стост :

0,37 смз/г, пор 750 А).0,4

Пример 5. И.м,мОбилиза;ц«я инвертазы с (ПОМОЩЬЮ тетраэтилацеталя глутарового диальдегида.

К 1 г аилохрома С-80, обработанного тет1раэтилацеталем глутароволо диальдегида согласно примеру 1, прибавляют 10 мл раствора дрожжевой инвертазы с общей активностью 2000 ед в 0,1М а.цетатном буферв (рН 4,7). Реакционную смесь перемешивают в течение б ч при 25° С, после чего иммобилизованный препарат промывают 1 л 1М раствора хлористого натрия и затем 1 л воды. Активность иммобилизованной инвертазы 1050 ед/г, (Количество Связанного

белка 12 кг/г. (Активность натавноох) н иммобилизоваштого препаратов ин1Ве1ртазы определяют глюкозоок;сидаз1ным .методом .на .п.рибаре фи;рмы «Бекман).

Приме.р 6. (Контроль) ИмМОбилизация .глюкоа.милазы из Asp. niger с помощью глутарового днальдепида.

К 1 г силохрома С-80, обработанного уаминопропилтриэтокСисилаиам и содержащего 0,6 Mir экв аминогрупп на 1 г носителя, прибавляют 2%-ный раствор глута-Роваго диальдегида фирмы «Реанал в 0,5 М фосфатном буф.ере (рН 7,0) и перемещивают при 25° С в течени-е 1 ч, затем носитель прЬмывают 2 л воды для удаления непрореагировавШего глутарового диальдегида и к носителю приливают 10 мл раствора :глюкоамилазы из Asp. niger IB 0,1 М ацетатном буфе|ре (рН 4,7) с общей активностью 200 .ед. Реакцию связывания

глю.коамилазы с носителем продолжают в течение 3 ч n;pvn 25° С при постоянном Перемещиванми, по окончании реакции им.мобилизОВанный фе1рмент промывают 1 л 1%HODO раствара ра1створ.имого :крах|Мала для

удаления нековалентно связанного белка, 1 л 0,1М ацетатно го буфера (рН 4,7) и 1 л воды. Активность иммобилизованного препарата 40,4 ед/г, количество связанного белка 9,3 мг/г.

Аналопично примеру 6 проведена иммобилизация глюкоамилазы иа пористом стекле МПС-1100 и силикагеле МСА-750. Полученные данные представлены в табл.3.

Таблица 3

Количеетво связанного белка,

мг/г

45,6

42,3

Пример 7 (1« нт1роль). Им)маб.ил1изация нейтралыной дротеииазы с помощью глутарового диальдегида.

К 1 г оил10Хрома С-:80, абр-аботанному 7-ам.иво1П1рол1ИЛт.р:иэЮ каисил. и содержащему 0,6 М)г aiMiHHiOirpynin на 1 г иооителя прибавляют 2%-1ный расивор глутаipOBoro диальдепида юогл асно шримеру 6, прибавляют раств ар нейтральнрй Л1ротеиназы с общей активностью 110 ед и содержанием бел:ка 50 мг в 0,1М униве рсальном буфере рН 7,0. Дальнейшую Обра ботку проводят согл.асно upHMieipy 4. Получают препарат иммобил,изованной протаийазы с активностью 3 едПС/г и соде,ржан.ибм связанного белка 6,0 мг/г.

Пример 8. (Контроль). Иммобилизация кислой протея1На:зы с по;мощью глутарового диальдегада.

К 1 г юилохрома С-80 с содержанием амнногрупп 0,6 мг зкв/г, обработан/но-го 2%-.ным раствором глутарового диальдегида согласно лрямеру 6, прибавляют раствор жислой рротеиназы с общей активностью 132 ед и содержанием белка 1,20 мг в 0,1М универсальном буфере (рП 4,1). Дальнейщую Обработку проводят согласно прим ару 3. Активность полученного препарата иммобилизование и кислой протеиназы 29 бдПС/г, количество связангао го белка

32 :МТ/Г.

Пример 9 (|коят1роль). Иммобилизация дрожжевой инвертазы с помощью глуTapOiBorO диальдегида.

К 1 г силохрома С-80, обработан1ного 2%-ным раСтворОМ глутарового альдешда согласно примеру 6, прибавляют 10 мл раствора инвертазы с общей а1КТ И вностью 2000 ед в 0,1М ацетатном буфере (рН 6,5). Реакцию связывания инвертазы с носителем продолжают 6 ч при 25° С при перемешивании. По окончанни 1реак1ции IHMJMOбилИ|ЗОванный фермент промывают 1л 1М раствора хлористого натрия для удаления нековаленпно связанного фермента и 1 л воды. Активность иммобилизованного препарата 760 ед/г,,количество связанного белка 9,8 мг/г.

Таким образом описываемый /опасоб иммобилизации фер1ментов с помощью ащета5 лей диальдепидов да1ет возможность получать препараты и1М1мобиЛ|Изованных фер-меитов, активность которых выше, чем активность фар)ме1нтов, иммобилизованных с помощью диальдепидов, напри-мф глутаро10 ВО1ГО диальдегида (например для глюкоа|Милазы в случае онлохрома С-80 активность выше на 46%, пористого стекла МПС 1100-53%, оиликагеля МСА-750-на 3,9%). KipoMe того при иммОбилиза.ции с ломо15 щ.ью ацета.тей д иальдепидав получают стандартные по актнвнасии препараты.

Формула изобретения

0 1 Спо1соб и.здмобилизании ферментов путем обработки модифящированного у-амнноцролилтриэтаксисиланом кремн1езем:Содержащего носителя сшивающим реагентом с по:следующим связыванием фермен5 та, отличающийся тем, что, с целью повышения активности и улучщения качества целевого продукта, в качестве сшивак щего агента используют ацетали диальдегидов, а обработку ттн носителя осу-0 ЩвСТВЛЯЮТ в ПрИ|СуТСТВ1И1И ИВСЛОТЫ.

5 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ацетали диальдеюидов исп ользуют в виде 1-10%-ных рас-шора.

Источник информации, принятый во-: внимание при экспертизе:

1. Патент США № 3669841, кл. 195-63,. опублик. 1972 (прототип).