СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ВЕЩЕСТВ, ОБЛАДАЮЩИХ ПРОТИВОМИКРОБНЫМИ И ПРОТИВОВИРУСНЫМИ СВОЙСТВАМИ, IN VITRO Российский патент 2002 года по МПК G01N33/68 G01N33/15 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано, в частности, в фармакологии.

Разработка современных эффективных экспресс-методов для скрининга веществ, обладающих противомикробной и противовирусной активностью, является актуальной в связи с необходимостью сокращения сроков исследования веществ, обладающих различной биологической активностью. Эта задача может быть решена путем разработки молекулярных тест-систем с использованием ферментов в качестве тест-объектов.

Противомикробную и противовирусную активность оценивают на различных моделях.

Так известно определение противовирусной активности испытуемого соединения методом скрининга по отношению к следующим тест-вирусам: а) РНК-содержащим КА 13 (Flores), KB 3 (Nancy), ECHO 11 (Upsala), ВВС (Indiana), б) ДНК-содержащему ВПГ-1 (патент РФ 2072865).

Известно определение противовирусной активности с использованием в качестве тест-объекта микроорганизмов, при этом определялась полная задержка роста микроорганизмов с добавлением исследуемого вещества по сравнению с контролем (без добавления исследуемого вещества) (патент РФ 2105564).

Известны стандартные микробиологические методы, позволяющие выявлять вещества, обладающие противомикробной активностью, с помощью тест-объекта, в качестве которого используется набор штаммов, и позволяющие выявлять вещества, обладающие противовирусной активностью с помощью тест-объекта, в качестве которого используются культуры клеток /Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармокологических веществ, Минздрав РФ, 2000г/. Данный метод выбран нами в качестве прототипа.

Недостатком этих способов выявления веществ, обладающих противомикробными и противовирусными свойствами, является большая трудоемкость и необходимость постоянного поддерживания клеточной популяции в условиях длительного перевиваемого культивирования и контроля за сохранностью и чистотой стандартных штаммов микроорганизмов, что значительно увеличивает экономические и временные затраты на первичный скрининг.

Цель данного изобретения - создание способа, обладающего высокой специфичностью и чувствительностью, хорошей воспроизводимостью, меньшей трудоемкостью, более высокой экономичностью, чем известные способы.

Поставленная цель достигается за счет использования в качестве тест-объектов фермента глутатионредуктазы и одного из антиоксидантных ферментов супероксиддисмутазы, или глутатионпероксидазы, или каталазы, определяют скорость ферментативной реакции веществ на тест-объектах, при этом соотношение скорости ферментативной реакции на тест-объекте после добавления вещества и скорости ферментативной реакции до добавления вещества должно быть меньше 1.

Фермент глутатионредуктаза (далее ГР) катализирует восстановление дисульфида глутатиона (окисленного глутатиона) в глутатион (восстановленный глутатион) /Классификатор ферментов, М., 1995 год, 1.6.4.2./.

Фермент супероксиддисмутаза (далее СОД) катализирует реакцию дисмутации супероксидного аниона (0₂ ^-) /Классификатор ферментов, М., 1995 год, 1.15.11. /.

Фермент глутатионпероксидаза (далее ГП) катализирует окисление восстановленной формы глутатиона в присутствии гидропероксида (Н₂O₂) или липидного пероксида (LOOH) /Классификатор ферментов, М., 1995 год, 1.11.1.9./.

Фермент каталаза расщепляет перекись водорода и присутствует во всех животных и растительных клетках и органах /Классификатор ферментов, М., 1995 год, 1.11.1.6./.

Для доказательства специфичности заявляемого способа выявления веществ, обладающих противомикробными и противовирусными свойствами in vitro, с применением заявляемых ферментов были изучены препараты:
- с установленной противомикробной и противовирусной активностью, принадлежащие к различным химическим классам;
- с неизвестной биологической активностью;
- вещества, относящиеся к другим фармакологическим группам и не обладающие искомыми свойствами.

Изученные вещества и их характеристика приведены в таблице 1 и 3.

Изучали влияние веществ, указанных в таблице 1, на скорость реакций, катализируемых ферментами ГР, СОД, ГП и КАТ in vitro. Скорости реакций, катализируемых заявляемыми ферментами, определяли спектрофотометрически известными методами. Скорость ГП и ГР реакций определяли по убыли НАДФН (никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный) при длине волны 340 нм. Скорость СОД-реакции определяли в присутствии тетразолия нитросинего и фенозинмета сульфата по приросту НАДН (никотинамидадениндинуклеотид восстановленный) при длине волны 540 нм. Скорость КАТ-реакции определяли по убыли субстрата (H₂O₂), которую измеряли в виде комплекса с молибдатом аммония по поглощению при длине волны 410 нм. Измеряли скорость ферментативной реакции без добавления изучаемого вещества (контроль) и после добавления изучаемого вещества (опыт). Полученные результаты представлены в таблице 2. В таблице 2 приводятся средние арифметические значения из 2-3-х параллельных определений и стандартные отклонения среднего результата (М±m). В примерах приведены результаты, полученные при оптимальных концентрациях вещества в пробе. Из представленных примеров видно, что вещества с противомикробными и противовирусными свойствами угнетают ферменты ГР, СОД, ГП, КАТ. Вещества, не обладающие противомикробными и противовирусными свойствами, не угнетают заявляемые ферменты.

Выводы: Заявляемый способ выявления веществ, обладающих противомикробной и противовирусной активностью, подтвердил наличие у объектов 1-7 известной противомикробной и противовирусной активности. У изучаемого объекта 8 и 9 была определена заявляемым способом противомикробная и противовирусная активность. У объекта 10, обладающего другими фармакологическими свойствами, не обнаружена противомикробная и противовирусная активности.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано, в частности, в фармакологии. Способ выявления веществ, обладающих противомикробными и противовирусными свойствами, in vitro заключается в использовании тест-объектов. При этом в качестве тест-объекта используют фермент глутатионредуктазу и один из антиоксидантных ферментов супероксиддисмутазу, или глутатионпероксидазу, или каталазу, определяют скорость ферментативной реакции веществ на тест-объектах, при этом соотношение скорости ферментативной реакции на тест-объекте после добавления вещества и скорости ферментативной реакции до добавления вещества должно быть меньше 1. Способ обладает высокой специфичностью и чувствительностью. 3 табл.

Способ выявления веществ, обладающих противомикробными и противовирусными свойствами, in vitro, заключающийся в использовании тест-объектов, отличающийся тем, что в качестве тест-объекта используют фермент глутатионредуктазу и один из антиоксидантных ферментов супероксиддисмутазу, или глутатионпероксидазу, или каталазу, определяют скорость ферментативной реакции веществ на тест-объектах, при этом соотношение скорости ферментативной реакции на тест-объекте после добавления вещества и скорости ферментативной реакции до добавления вещества должно быть меньше 1.