Изобретение относится к медицине, и может быть использовано, в частности, в фармакологии.
Разработка современных эффективных экспресс-методов для скрининга веществ, обладающих антиоксидантной активностью, является актуальной в связи с необходимостью сокращения сроков исследования веществ, обладающих различной биологической активностью. Эта задача может быть решена путем разработки молекулярных тест-систем с использованием ферментов в качестве тест-объектов.
Антиоксидантную активность оценивают на различных моделях.
Известен стандартный микробиологический метод хемолюминесценции, позволяющий выявлять вещества, обладающие антиоксидантной активностью, с помощью тест-объекта, в качестве которого используют перитонеальные макрофаги [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармокологических веществ, Минздрав РФ, 2000 г.].
Наиболее близким способом к заявляемому относится известный метод определения антиоксидантной активности с использованием в качестве тест-объекта нейтрофилов крови. Ингибировался зимозаном процесс кислородного взрыва и исследовался процесс его ингибирования исследуемым препаратом [патент РФ 2115425].
Исследование в известном способе проводились на цельной крови донора. Гепаринизированная кровь, полученная из локтевой вены, в количестве 0,1 мл добавлялась в анализатор хемолюминометра, затем добавлялось по 0,1 мл раствора люминола и зимозана (для индуцированного кислородного взрыва в нейтрофилах крови). В клетках крови нарастал кислородный взрыв, что регистрировалось по увеличению хемолюминесценции. На пике кислородного взрыва в анализатор вводился препарат и измерялось изменение люминесценции. Контролем служила кровь, к которой не добавлялся препарат.
Недостатком этих способов выявления веществ, обладающих антиоксидантной активностью, является большая трудоемкость и необходимость постоянного контроля за сохранностью и чистотой стандартных тест-объектов, что значительно увеличивает экономические и временные затраты на первичный скрининг.
Цель данного изобретения - создание способа, обладающего высокой специфичностью и чувствительностью, хорошей воспроизводимостью, меньшей трудоемкостью, более высокой экономичностью, чем известные способы.
Поставленная цель достигается за счет использования в качестве тест-объектов ферментов глутатионредуктазы, супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы и каталазы, определяют скорость ферментативной реакции веществ на тест-объектах, при этом соотношение скорости ферментативной реакции на тест-объекте после добавления вещества и скорости ферментативной реакции до добавления вещества должно быть больше 1.
Фермент глутатионредуктаза (далее ГР) катализирует восстановление дисульфида глутатиона (окисленного глутатиона) в глутатион (восстановленный глутатион) [Классификатор ферментов. - М., 1995 г., 1.6.4.2.].
Фермент супероксиддисмутаза (далее СОД) катализирует реакцию дисмутации супероксидного аниона (O2 -) [Классификатор ферментов. - М. , 1995 г., 1.15.11.].
Фермент глутатионпероксидаза (далее ГП) катализирует окисление восстановленной формы глутатиона в присутствии гидропероксида (Н2O2) или липидного пероксида (LOOH) [Классификатор ферментов. - М., 1995 г., 1.11.1.9.].
Фермент каталаза расщепляет перекись водорода и присутствует во всех животных и растительных клетках и органах [Классификатор ферментов. - M., 1995 г., 1.11.1.6.].
Для доказательства специфичности заявляемого способа выявления веществ, обладающих антиоксидантной активностью, in vitro с применением заявляемых ферментов были изучены вещества:
- с установленной антиоксидантной активностью, принадлежащие к различным химическим классам;
- с неизвестной биологической активностью;
- вещества, относящиеся к другим фармакологическим группам и не обладающие искомыми свойствами.
Изученные вещества и их характеристика приведены в таблицах 1 и 3.
Изучали влияние веществ, указанных в таблице 1, на скорость реакций, катализируемых ферментами ГР, СОД, ГП, и КАТ in vitro. Скорости реакций, катализируемых заявляемыми ферментами, определяли спектрофотометрически известными методами. Скорость ГП и ГР реакций определяли по убыли НАДФН (никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный) при длине волны 340 нм. Скорость СОД-реакции определяли в присутствии тетразолия нитросинего и феназинметасульфата по приросту НАДН (никотинамидадениндинуклеотид восстановленный) при длине волны 540 нм. Скорость КАТ-реакции определяли по убыли субстрата (Н2O2), которую измеряли в виде комплекса с молибдатом аммония по поглощению при длине волны 410 нм. Измеряли скорость ферментативной реакции без добавления изучаемого вещества (контроль) и после добавления изучаемого вещества (опыт). Полученные результаты представлены в таблице 2. В таблице 2 приводятся средние арифметические значения из 2-3 параллельных определений и стандартные отклонения среднего результата (M±m). В примерах приведены результаты, полученные при оптимальных концентрациях вещества в пробе. Из представленных примеров видно, что вещества с антиоксидантной активностью активизируют ферменты ГР, СОД, ГП, КАТ. Вещества, не обладающие антиоксидантной активностью, угнетают заявляемые ферменты.
Исследуемые вещества 5 и 6 обладают антиоксидантной активностью, а исследуемое вещество 7 не обладает антиоксидантной активностью.
Способ выявления веществ, обладающих антиоксидантными свойствами, на заявляемых четырех ферментах позволяет добиться высокой степени точности при определении искомой активности.
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ВЕЩЕСТВ, ОБЛАДАЮЩИХ ПРОТИВОМИКРОБНЫМИ И ПРОТИВОВИРУСНЫМИ СВОЙСТВАМИ, IN VITRO | 2001 |
|
RU2181891C1 |
СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ВЕЩЕСТВ, ОБЛАДАЮЩИХ АДАПТОГЕННЫМИ СВОЙСТВАМИ, IN VITRO | 2001 |
|
RU2181890C1 |
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ ЭФИРНОГО МАСЛА РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ in vitro | 2013 |
|
RU2526125C1 |
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИРАДИКАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ВЕЩЕСТВ IN VITRO | 2003 |
|
RU2238979C1 |
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ГОМЕОПАТИЧЕСКОГО ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА | 2010 |
|
RU2455650C2 |
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ IN VITRO ОСТЕОИНТЕГРАТИВНЫХ СВОЙСТВ МАТЕРИАЛОВ ДЛЯ КОСТНЫХ ИМПЛАНТАТОВ | 2001 |
|
RU2182018C1 |
СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТОКСИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ | 2006 |
|
RU2316597C1 |
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА И РОСТСТИМУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ВЕЩЕСТВ ДЛЯ ДОКЛИНИЧЕСКИХ ИСПЫТАНИЙ | 2002 |
|
RU2226275C2 |
СПОСОБ ОЦЕНКИ НЕГАТИВНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ БЕНЗОЛА И ФЕНОЛА, ПОСТУПАЮЩИХ С АТМОСФЕРНЫМ ВОЗДУХОМ, НА НАРУШЕНИЕ ФУНКЦИЙ ГЛУТАТИОНОВОЙ СИСТЕМЫ ДЕТСКОГО ОРГАНИЗМА | 2011 |
|
RU2473907C1 |
СПОСОБ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ ДОБРОКАЧЕСТВЕННЫХ ГИПЕРПЛАСТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ ЭНДОМЕТРИЯ | 2000 |
|
RU2190221C2 |
Изобретение относится к медицине и может быть использовано, в частности, в фармакологии. Способ выявления веществ, обладающих антиоксидантными свойствами, in vitro заключается в использовании тест-объектов. При этом в качестве тест-объекта используют ферменты глутатионредуктазы, супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы и каталазу, определяют скорость ферментативной реакции веществ на тест-объектах, при этом соотношение ферментативной реакции на тест-объекте после добавления вещества и скорости ферментативной реакции до добавления вещества должно быть больше 1. Способ обладает высокой специфичностью и чувствительностью. 3 табл.
Способ выявления веществ, обладающих антиоксидантными свойствами, in vitro, заключающийся в использовании тест-объектов, отличающийся тем, что в качестве тест-объекта используют ферменты глутатионредуктазу, супероксиддисмутазу, глутатионпероксидазу и каталазу, определяют скорость ферментативной реакции веществ на тест-объектах, при этом соотношение скорости ферментативной реакции на тест-объекте после добавления вещества и скорости ферментативной реакции до добавления вещества должно быть больше 1.
ВОДНЫЙ ЭКСТРАКТ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ, ОБЛАДАЮЩИЙ ПРОТИВОМИКРОБНОЙ, ФАГОЦИТАРНОЙ, МИТОТИЧЕСКОЙ И АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТЬЮ | 1993 |
|
RU2115425C1 |
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ И ХИМИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ | 1999 |
|
RU2144674C1 |
СПОСОБ СКРИНИНГА ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ | 1999 |
|
RU2150700C1 |
Способ определения антиоксидантной активности химических соединений | 1987 |
|
SU1532869A1 |
Способ определения антиоксидантной активности лекарственных веществ | 1990 |
|
SU1778689A1 |
US 5434085 А, 18.07.1995. |
Авторы
Даты
2002-04-27—Публикация
2001-06-06—Подача