СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ВЕЩЕСТВ, ОБЛАДАЮЩИХ АДАПТОГЕННЫМИ СВОЙСТВАМИ, IN VITRO Российский патент 2002 года по МПК G01N33/68 G01N33/15 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано, в частности, в фармакологии.

Разработка современных эффективных экспресс-методов для скрининга веществ, обладающих адаптогенной активностью, является актуальной в связи с необходимостью сокращения сроков исследования веществ, обладающих различной биологической активностью. Эта задача может быть решена путем разработки молекулярных тест-систем с использованием ферментов в качестве тест-объектов.

Адаптогенную активность оценивают на различных моделях с использованием в качестве тест-объекта подопытных животных, в частности крыс и мышей.

Известен способ выявления веществ, обладающих адаптогенной активностью, заключающийся в определении физической работоспособности животных (патент РФ 2135198). Опыты проводили на белых беспородных крысах, одной группе которых вводили внутрижелудочно в эксперементально-терапевтической дозе исследуемое вещество, а другой группе препарат сравнения, один раз в день в течение 10 суток. Влияние вещества на выносливость животных определяли по длительности бега в третбане до полного утомления.

Известен способ выявления веществ, обладающих адаптогенной активностью, заключающийся в определении иммунного статуса (патент РФ 2108108). Исследования проводили на мышах линии BDF₁ и BALB/c. Известно, что защита организма от вредного воздействия окружающей среды во многом зависит от состояния иммунной системы, базирующейся на клеточном и гуморальном уровнях. Влияние изучаемого средства на иммунный статус оценивали по изменению активности НК-клеток и пролиферативной активности спленоцитов, стимулированных in vitro митогеном, а также по пролиферативной и цитолитической активности Т-киллеров в смешенной культуре лимфоцитов.

Наиболее близким способом к заявляемому относится известный физиологический метод определения адаптогенной активности с использованием в качестве тест-объекта мышей или крыс. Метод заключается в определении физической работоспособности, выносливости, устойчивости к экстремальным температурам, к гипоксии [Razbun W.B., Bovis M.G.., Holle Sahau A.M. Curr. Eye Res., 1986. V.5 - P.195-199].

Недостатком известных способов выявления веществ, обладающих адаптогенной активностью, является большая трудоемкость и необходимость использования большого количества лабораторных животных, длительность эксперемента, что значительно увеличивает экономические и временные затраты на первичный скрининг.

Цель данного изобретения - создание способа, обладающего высокой специфичностью и чувствительностью, хорошей воспроизводимостью, меньшей трудоемкостью, более высокой экономичностью, чем известные способы.

Поставленная цель достигается за счет использования в качестве тест-объектов ферментов глутатионредуктазы или супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы или каталазы, определения скорости ферментативной реакции веществ на тест-объектах, при этом соотношение скорости ферментативной реакции на тест-объекте глутатионредуктазе или супероксиддисмутазе после добавления вещества и скорости ферментативной реакции до добавления вещества должно быть больше 1, а соотношение скорости ферментативной реакции на тест-объекте каталазе или глутатионпероксидазе после добавления вещества и скорости ферментативной реакции до добавления вещества должно быть меньше 1.

Фермент глутатионредуктаза (далее ГР) катализирует восстановление дисульфида глутатиона (окисленного глутатиона) в глутатион (восстановленный глутатион) [Классификатор ферментов. М., 1995 г., 1.6.4.2.].

Фермент супероксиддисмутаза (далее СОД) катализирует реакцию дисмутации супероксидного аниона (О₂) [Классификатор ферментов. М., 1995 г., 1.15.11.].

Фермент глутатионпероксидаза (далее ГП) катализирует окисление восстановленной формы глутатиона в присутствии гидропероксида (Н₂О₂) или липидного пероксида (LOOH) [Классификатор ферментов. М.,1995 г., 1.11.1.9.].

Фермент каталаза расщепляет перекись водорода и присутствует во всех животных и растительных клетках и органах [Классификатор ферментов. M., 1995 г., 1.11.1.6.].

Для доказательства специфичности заявляемого способа выявления веществ, обладающих адаптогенной активностью, in vitro, с применением заявляемых ферментов были изучены вещества:
- с установленной адаптогенной активностью, принадлежащие к различным химическим классам;
- с неизвестной биологической активностью;
- вещества, относящиеся к другим фармакологическим группам и не обладающие искомыми свойствами.

Изученные вещества и их характеристика приведены в таблицах 1 и 3.

Изучали влияние веществ, указанных в таблице 1 на скорость реакций, катализируемых ферментами ГР, СОД, ГП, и КАТ in vitro. Скорости реакций, катализируемых заявляемыми ферментами, определяли спектрофотометрически известными методами. Скорость ГП и ГР реакций определяли по убыли НАДФН (никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный ) при длине волны 340 нм. Скорость СОД-реакции определяли в присутствии тетразолия нитросинего и феназинметасульфата по приросту НАДН (никотинамидадениндинуклеотид восстановленный) при длине волны 540 нм. Скорость КАТ-реакции определяли по убыли субстрата (Н₂О₂), которую измеряли в виде комплекса с молибдатом аммония по поглощению при длине волны 410 нм. Измеряли скорость ферментативной реакции без добавления изучаемого вещества (контроль) и после добавления изучаемого вещества (опыт). Полученные результаты представлены в таблице 2. В таблице 2 приводятся средние арифметические значения из 2-3-х параллельных определений и стандартные отклонения среднего результата (М±m). В примерах приведены результаты, полученные при оптимальных концентрациях вещества в пробе. Из представленных примеров видно, что вещества с адаптогенной активностью активизируют ферменты ГР, СОД и угнетают ферменты ГП, КАТ.

Из представленных примеров видно, что вещества, обладающие адаптогенной активностью, при непосредственном взаимодействии с ферментами повышают скорость глутатионредуктазной и супероксиддисмутазной реакций, снижая при этом скорость каталазной и глутатионпероксидазной реакций ( 1-7). Вещества, не обладающие адаптогенными свойствами, влияют на эти скорости иным способом. Например, активируют оба фермента ( 10), ингибируют оба фермента ( 8, 9).

Способ выявления веществ, обладающих адаптогенной активностью, на заявляемых четырех ферментах позволяет добиться высокой степени точности при определении искомой активности.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано, в частности, в фармакологии. При этом в качестве тест-объектов используют ферменты глутатионредуктазу или супероксиддисмутазу и глутатионпероксидазу или катализу, определяют скорости ферментативной реакции веществ на тест-объектах, при этом соотношение скорости ферментативной реакции на тест-объекте глутатионредуктазе или супероксиддисмутазе после добавления вещества и скорости ферментативной реакции до добавления вещества должно быть больше 1, а соотношение скорости ферментативной реакции на тест-объекте каталазе или глутатионпероксидазе после добавления вещества и скорости ферментативной реакции до добавления вещества должно быть меньше 1. Изобретение позволяет определять вещества с высокой точностью. 3 табл.

Способ выявления веществ, обладающих адаптогенными свойствами, in vitro, заключающийся в использовании тест-объектов, отличающийся тем, что в качестве тест-объекта используют ферменты глутатионредуктазу или супероксиддисмутазу и каталазу или глутатионпероксидазу, определяют скорость ферментативной реакции веществ на тест-объектах, при этом соотношение скорости ферментативной реакции на тест-объекте глутатионредуктазе и супероксиддисмутазе после добавления вещества и скорости ферментативной реакции до добавления вещества должно быть больше 1, а соотношение скорости ферментативной реакции на тест-объекте каталазе и глутатионпероксидазе после добавления вещества и скорости ферментативной реакции до добавления вещества должно быть меньше 1.