ПОЛУЧЕНИЕ ОЧИЩЕННЫХ (ПОЛИ)ПЕПТИДОВ Российский патент 2002 года по МПК C07K1/00 C07K1/04 C07K1/16 

Изобретение относится к способу модификации, облегчающему получение очищенных (поли)пептидов и к способу очистки с применением этого способа модификации.

Уровень техники
В течение последних лет твердофазный пептидный синтез с использованием t-Boc- и F-moc-стратегий был в значительной степени усовершенствован. Изощренные протоколы синтеза позволили получать полипептиды из примерно 100 или более остатков [1-4]. Тем не менее, неполное связывание и терминация цепи, которые могут иметь место в любом цикле пептидной сборки, приводит к образованию делеции - и усеченных последовательностей.

Это и возможное присутствие побочных реакций, наблюдаемых в основном во время конечного отщепления от смолы, затрудняют прямое выделение желаемого пептида от других примесей. Очистка длинных синтетических полипептидов является главной проблемой в получении продуктов, применимых для биологических исследований и для использования для человека и животных, где высокий уровень чистоты является обязательным.

в частности, когда синтезируют последовательности, содержащие 30 или более остатков, различия в физических свойствах, таких как размер, заряд и гидрофобность, между желаемым продуктом и делетированными, усеченными или модифицированными пептидными примесями могут быть слишком малыми, чтобы позволить адекватную очистку. Кроме того, современные сильнодействующие способы разделения, т.е. обращенно-фазовая ВЖХ, часто ограничены низкими выходами и небольшой загружаемостью пробы, что отнимает много времени и является дорогостоящим.

Различные подходы уже были испытаны для преодоления этого ограничения. Были выполнены биотинилирование синтетического белка IL-1 [5] из 153 остатков и синтетического белка SIV-протеазы [6] из 99 остатков и биотинилированные цепи выделяли на авидин-агарозной колонке.

Ball et al. [7] недавно предложили процедуру очистки, основанную на присоединении обратимой защитной группы, несущей липофильную, кислотную или основную функциональную группу, к последнему остатку пептидной цепи.

Были оптимизированы более специфические хроматографические способы, эксплуатирующие присутствие определенных остатков в синтезированных последовательностях. Например, цистеинсодержащие пептиды были очищены реакцией с иммобилизованными производными ртути [8] или активированными тиолами [9], а также была успешно применена аффинная хроматография с иммобилизованным ионом металла (IMAC) [10] для очистки пептидов, содержащих гистидин или триптофан [11].

В рекомбинантных белках целенаправленно присоединяли гистидиновый хвост, В-клеточный эпитоп или GST-части молекулы. Эти хвосты можно было затем использовать в аффинной хроматографии.

В общем, протокол очистки, который основан на физико-химических свойствах синтезированного пептида, следует оптимизировать для каждой индивидуальной пробы, что является длительным и дорогостоящим занятием. По этим причинам был разработан ряд способов для придания процедурам очистки общей применимости [15]. Однако способы, описанные до сих пор, являются полностью неудовлетворительными и/или оставляют ковалентно дериватизованные пептиды в конечных очищенных продуктах, которые могут создавать некоторое беспокойство в отношении их биологических и физико-химических свойств и их конечного применения в животных и людях.

Сущность изобретения
Таким образом, целью данного изобретения является обеспечение усовершенствования известных способов для создания способа модификации (поли)пептидов для облегчения их очистки и способа очистки (поли)пептидов, которые являются универсально применимыми, приводя к высокому выходу извлечения, и простыми в выполнении.

Эта цель была достигнута в соответствии с данным изобретением при помощи способа модификации, который предусматривает встраивание по меньшей мере одной специфически расщепляемой аминокислоты в конце этой (поли)пептидной цепи во время ее синтеза и защиту той же самой аминокислоты (аминокислот) в (поли)пептиде, если они присутствуют, чтобы сделать возможным специфическое расщепление точно по специфически расщепляемой аминокислоте (аминокислотам).

Процесс очистки при помощи этого способа модификации предусматривает стадии:
a) синтеза желаемого (поли)пептида;
b) присоединения по меньшей мере одной специфически расщепляемой аминокислоты в конце этого (поли)пептида при защите той же самой аминокислоты (аминокислот) внутри (поли)пептида, если они присутствуют, от расщепления;
b) удлинения (поли)пептида и присоединенных к нему аминокислоты (аминокислот) последовательностью-меткой для получения удлиненного полипептида;
c) очистки удлиненного полипептид в посредством способа очистки, специфичного к метке, и
d) удаления последовательности-метки и дополнительной аминокислоты (аминокислот) из удлиненного (поли)пептида посредством способа расщепления, специфического для дополнительной аминокислоты (аминокислот), с получением очищенного полипетида.

Способ специфического расщепления представляет собой предпочтительно способ химического расщепления, как будет дополнительно объяснено здесь ниже.

Способ и процесс данного изобретения применимы для любого (поли)пептида, так как они не зависят от его аминокислотного состава. Кроме того, в некоторых предпочтительных вариантах осуществления этот способ и процесс являются недорогими и высокоэффективными.

Такой вариант представляет собой применение остатка метионина в качестве дополнительной аминокислоты перед присоединением аффинной метки (тэга) (например, отрезка из шести гестидиновых остатков, или других облегчающих очистку соединений). После подходящих стадий очистки, таких как специфическая к метке аффинная хроматография, гистидиновую метку можно отщепить расщеплением при помощи CNBr, недорогим и очень эффективным способом, который специфически расщепляет по остатку метионина.

В предпочтительном варианте осуществления эта метка (тэг) содержит, следовательно, по меньшей мере отрезок гистидиновых остатков, предпочтительно шести или более, и остаток метионина. Необязательно, могут быть включены одна или несколько других аминокислот.

Если последовательность желаемого полипептида содержит остатки метионина, они могли бы быть субъектом расщепления цианогенбромидом при удалении метки. Однако в соответствии с данным изобретением этого можно избежать путем использования модифицированных остатков метионина в синтезе (поли)пептида. Таким модифицированным остатком метионина является, например, метионинсульфоксид.

В альтернативном варианте осуществления способа и процесса данного изобретения меткой является большая молекула, такая как полиэтиленгликоль. В этом случае специфическим к метке способом очистки является гель-фильтрационная хроматография.

Способ и процесс данного изобретения равно хорошо применимы к плипептидам, продуцируемым способами рекомбинантных ДНК. В предпочтительном варианте остатки метионина, первоначально присутствующие в желаемом полипептиде, но не в метке (тэге), являются защищенными от расщепления, например, будучи замененными другой аминокислотой, такой как валин, глицин, или делетированными.

В данной заявке термин "метка" (тэг) используют, чтобы указать удаляемую молекулу, присоединенную к целевому полипептиду, во время синтеза или после синтеза. "Меткой" может быть аминокислотная последовательность, присоединенная во время синтеза полипептида, но может быть также другая молекула, которая может быть легко очищена из смеси компонентов. Примером последней является полиэтиленгликоль (ПЭГ).

В этой заявке термины "пептид", "полипептид" и " (поли) пептид" используются взаимозаменяемо.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

Следующий далее пример приведен для иллюстрации данного изобретения. Ясно, что специалисту с квалификацией в данной области этот пример даст достаточную рекомендацию для разработки дальнейших способов, которые также входят в объем данного изобретения. В примере описана процедура очистки общей применимости, основанная на комбинации 1) протокола "кэпирования" (блокирования на конце), 2) применения метионинсульфоксида в качестве защищенного остатка метионина и 3) удлинения (наращивания) желаемого пептида отрезком из 6 гистидинов, который будет использоваться для аффинной хроматографии. После адекватных стадий очистки выполняли расщепление цианогенбромидом гистидиновой метки с последующим конечным восстановлением метионинсульфоксида до метионина. Эта простая, прямая стратегия сделала возможной очистку до гомогенности полипептида из 69 остатков "PbCS 242-310", охватывающего концевой район белка CS Plasmodium berghei, с высоким выходом и за короткое время с применением общепринятых хроматографических процедур.

Пример
1. Материалы и методы
1.1 Реагенты и растворители
Химические реагенты и растворители, используемые для пептидного синтеза, приобретали из Calbiochem-Novabiochem AG (Laufelfingen, Switzerland) и Fluka (Buchs, Switzerland).

1.2. Синтез и анализ пептидов
Для иллюстрации данного изобретения полипептид, обозначенный "PbCS 242-310", охватывающий концевой район белка CS Plasmodium berghei [12], химически синтезировали с применением F-Moc-химии в твердой фазе в синтезаторе пептидов 431А Applied Biosystems. Этот полипептид получали на смоле с F-moc-Ser (трет-бутил)-п-алкоксибензиловым спиртом (смоле Wang) со степенью замещения 0,43 ммоль/г при шкале 0,1 ммоль. Синтез проводили с применением 5-кратного избытка F-тос-аминокислотных производных, DCCI и HOBt в качестве активирующих агентов, 60 минутах времени связывания для первых 34 аминокислот и двойного связывания для следующих остатков. Блокирование ("копирование") уксусным ангидридом выполняли в конце каждого цикла. Защитные группы боковых цепей включали в себя: пентаметилхромансульфонильную группу для Arg; -S-трет-бутил для Суз; трифенилметильную группу для Asn, Gin и His; трет-бутоксикарбонильную группу для Lys и Туг; трет-бутильную группу для Asp, Glu, Ser, Thr и Туг. Met 306 встраивали в виде Fmoc-Met-сульфоксида для защиты его от более позднего расщепления цианогенбромидом.

Затем пептид удлиняли на N-конце последовательностью His-His-His-His-His-His-Gly-Gly-Met с применением условий, описанных выше, но не проводили "кэпирования" после связывания второго Gly. Полученный таким образом полипептид был обозначен "His tag PbCS 242-310" (где tag обозначает метку).

Неочищенный пептид получали обработкой содержащей пептид смолы 2,5% H₂O, 5% триэтилсиланом в ТФА в течение 2 часов при комнатной температуре. Синтетический пептид очищали гель-фильтрационной жидкостной хроматографией (колонка Sephadex G50 70•2,5 см с применением смеси 50% уксусная кислота/Н₂О в качестве подвижной фазы). Чистоту пептида анализировали ОФ-ВЖХ с применением колонки С4 W-Porex 250•4,6 мм и градиента 10-90% СН₃СN в смеси 0,1% ТФА/Н₂О в течение 60 минут со скоростью потока 1,0 мл/мин. Состав аминокислот определяли согласно Knecht и Chann [13].

1.3. Аффинная хроматография с иммобилизованным ионом металла (IMAC) и расщепление с применением CNBr.

Полипептид сначала очищали аффинной хроматографией на основе гистидиновой метки. Затем метку удаляли цианогенбромидом.

Ni-колонку готовили с Ni-NTA-агарозной смолой (Qiagen Inc., Chatsworth, USA) и уравновешивали буфером А (8М мочевина, 0,1 М Na₂HPO₄, 0,01 М Трис, рН, доведенный до 8,0 при помощи Н₃РO₄). Очищенный гель-фильтрацией полипептид "His tag PbCS 242-310" растворяли в буфере А и наносили на колонку со скоростью тока 15 мл/ч. Колонку промывали буфером А (скорость тока 15 мл/ч) и буфером В (8 М мочевина, 0,1 М Na₂HPO₄, 0,01 М Трис, рН, доведенный до 6,3 при помощи Н₃РO₄), содержащим 50 мМ имидазол, при скорости тока 30 мл/час. Затем полипептид "His tag PbCS 242-310" элюировали (скорость тока 30 мл/час) буфером, содержащим 250 мМ имидазол.

Элюированный материал обессоливали при помощи колонки Sephadex G25 (50•2,5 см с применением смеси 50% уксусная кислота/Н₂О в качестве подвижной фазы) и лиофилизировали. Для удаления гистидиновой метки полученный таким образом материал обрабатывали в течение 8 часов при комнатной температуре при концентрации 20 мг/мл в 70% ТФА с использованием 100-кратного молярного избытка CNBr.

Расщепленный таким образом материал лиофилизировали, солюбилизировали в буфере А и наносили опять на Ni-NTA-агарозную колонку. Гистидиновая метка удерживается на Ni-колонке и протекающий через колонку раствор содержит полипептид "PbCS 242-310". Протекающий через колонку раствор обессоливали при помощи колонки Sephadex G25 (50•2,5 см с применением смеси 50% уксусная кислота/H₂O в качестве подвижной фазы) и лиофилизировали.

1.4. Восстановление Met-сульфоксида
Обработанный CNBr и IMAC очищенный материал обрабатывали 10% меркаптоэтанолом при рН 8,0 для превращения метионинсульфоксида в метионин и Cys-S-трет-бутила в Cys и затем дополнительно очищали гель-фильтрацией (колонка Sephadex G25 250•4,4 мм).

1.5. Масс-спектрометрия
Масс-спектрометрический анализ проводили с использованием времяпролетного масс-спектрометра LDI 1700 Mass Monitor (Linear Scientific Inc., Reno, NV, USA). Пять мкл раствора 1 мг/мл полипептида смешивали с 5 мкл транс-3,5-диметокси-4-гидроксикоричной кислоты (синап(ин)овой кислоты)) (20 мг/мл в ацетонитриле (Linear Scientific Inc. , Reno, NV, USA)) и 1,0 мкл этого раствора помещали на кончик зонда масс-спектрометра и сушили осторожным вакуумом. Пробу освещали 3-нс-лазерными импульсами (длина волны 337 нм) из N₂-лазера. Время пролета измеряли цифровым осциллографом (series 9304; Le Croy Research Systems, Corp. , Spring Valley, NY), которое превращали в масс-спектр с применением калибровочного стандарта Peptide MALDI-TOFMS (Linear Scientific Inc., Reno, NV, USA).

2. Результаты
Полипептид из 69 остатков "PbCS 242-310" соответствует С-району белка CS P. berghei [12]. Синтез "His tag PbCS 242-310" проводили с применением автоматизированного протокола, в котором стадию "кэпирования" включали после каждого связывания, как описано в разделе "Материалы и методы".

Более 150 мг неочищенного полипептида получали обработкой 600 мг соответствующей пептидной смолы смесью Н₂О/триэтилсилан/ТФА.

Масс-спектральный анализ неочищенного полипептида показал присутствие представляющих интерес молекулярных частиц с молекулярной массой (MW) 9301 среди других компонентов с низкой молекулярной массой (MW)(фиг.1).

90 мг неочищенного полипептида очищали аффинной хроматографией с иммобилизованным ионом металла (IMAC) на колонке с объемом 25 мл Ni-NTA-агарозы (фиг. 2). После обессоливания посредством гель-фильтрационной жидкостной хроматографии получали 35 мг "His tag PbCS 242-310". Измерение поглощения при 280 нм элюированного материала (35 мг) и прошедшего через колонку раствора (55 мг) показало, что выход этого протокола очистки был 100%.

Затем очищенный на Ni-колонке материал расщепляли CNBr для элиминации 6•НIS-метки.

Расщепленный материал повторно наносили на Ni-колонку для элиминации нерасщепленного пептида и обрабатывали 10% меркаптоэтанолом при рН 8,0 для восстановления метионинсульфоксида, встроенного во время синтеза, и защитных групп остатков Суs. Полное восстановление метионинсульфоксида подтверждали повторной обработкой материала CNBr и проверкой эффективности расщепления масс-спектрометрией.

Дополнительная очистка гель-фильрационной хроматографией приводила к 19 мг очищенного PbCS 242-310.

На фиг. 3 показан масс-спектр полученного материала, а на фиг.4 сравниваются аналитические хроматографические профили неочищенного и очищенного пептида. Различия времени удерживания между двумя разделениями обусловлено отсутствием высокозаряженной метки His в очищенном материале. Было обнаружено, что очищенный "PbCS 242-310" имеет чистоту около 95%, на основе интегрирования площадей пиков при анализе при 214 нм. Аминокислотный состав полипептида CS согласовался с составом, ожидаемым для этого пептида (таблица).

Химический синтез биоактивных пептидов стал широко распространенным и быстро растущим способом для автоматизации и эффективных протоколов для сборки цепей. Для большинства применений неочищенный синтетический продукт должен быть очищен для удаления остаточных реагентов, неудавшихся последовательностей и химически модифицированных пептидных молекул. Обычно это достигается обращенно-фазовой ВЖХ с использованием подвижных фаз трифторуксусной кислоты/ацетонитрила. Хотя пептидный синтез стал высоко автоматизированным, очистка все еще в значительной степени является процессом, выполняемым вручную и, следовательно, занимающим много времени, дорогим и не очень эффективным.

Этот пример показал, что способ данного изобретения приводит к высокой чистоте, как это следует из фиг.3, и является легким в выполнении и универсально применимым.

Проблема специфического расщепления, обусловленная присутствием остатков Met в целевой последовательности, как в описанном здесь случае, в соответствии с данным изобретением легко преодолевается использованием Met-сульфоксидных остатков, которые устойчивы к обработке CNBr и количественно восстанавливаются меркаптоуксусной кислотой [14].

Из сказанного выше следует, что способ данного изобретения был успешно применен для очистки полипептида "PbCS 242-310", цепи из 69 остатков, соответствующей С-концевому району белка CS Р. berghei [12]. Хотя в неочищенном материале после отщепления от колонки присутствуют многие пептидные примеси, как показано масс-спектральным анализом, показанным на фиг.1, авторы изобретения были способны очистить целевой пептид до гомогенности с высоким выходом за относительно короткое время. Полный протокол очистки дал 19 мг очищенного РbСS 242-310, что соответствует около 20% неочищенного материала.

В заключение, было продемонстрировано, что расщепление CNBr и защита релевантных остатков Met в виде сульфоксидов, связанных с эффективной аффинной меткой (тэгом), может представлять собой эффективный и общий инструмент для очистки химически синтезированных длинноцепочечных пептидов.

Подписи к рисункам
Фиг.1 - масс-спектр неочищенного пептида
Фиг.2 - хроматографический профиль IMAC-очистки
Фиг.3 - масс-спектр очищенного пептида
Фиг.4 - хроматографические профили неочищенного и очищенного пептида.

Источники информации
1. Chong, P., Sia, С., Tam, Е., Kandil, A. & Klein, М. International Journal of Peptide & Protein Research 41, 21-27 (1993).

2. Haaheim, L.R., Maskell, J.P., Mascagni, P. & Coates, A.R. Scandinavian Journal of Immunology 34, 341-350 (1991).

3. Roggero, M.A., et al. Molecular Immunology 32, 1301-1309 (1995).

4. Smith, D.D., et al. International Journal of Pep-tide & Protein Research 44, 183-191 (1994).

5. Lobl, T. J. , Deibel, M.J. & Yem, A.W. Analytical Biochemistry 170, 502-511 (1988).

6. Tomasselli, A. G. , et al. Journal of Biological Chemistry 267, 10232-10237 (1992).

7. Ball, H.L. & Mascagni, P. International Journal of Peptide & Protein Research 40, 370-379 (1992).

8. Krieger, D.E., Erickson, B.W. & Merrifield, R.B. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 73, 3160-3164 (1976).

9. Lindeberg, G., Tengborn, J., Bennich, H. & Ragnarsson, U.J. Chromatography 156, 366-369 (1978).

10. Porath, J. , Carlsson, J., Olsson, I. & Belfrage, G. Nature 258, 598-599 (1975).

11. Lindeberg, G., Bennich, H. & Engstrom, A. International Journal of Peptide & Protein Research 38, 253-259 (1991).

12. Lanar, D.E. Mol. Biochem. Parasitol. 39, 151-154 (1990).

13. Knecht, R. & Chang, J.Y. Analyt. Chem. 58, 2375-2379 (1986).

14. Houghten, R.A. & Li, C.H. Methods in enzymology 91, 549-559 (1991).

15. Barany, G. & Merrifield, R.B. Peptides, analysis, synthesis, biology 1-163-165 (Academic Press, London, 1980).

Описывается способ модификации(поли)пептидов, включающий встраивание по меньшей мере одного специфически расщепляемого метионина и метки (тэга), которая является His-меткой, в конце (поли)пептидной цепи во время ее синтеза и защиту остатков метионина в этом (поли)пептиде, от расщепления путем защиты их сульфоксидной группой, а также описывается способ получения очищенных (поли)пептидов, предусматривающий стадии: а) синтеза целевого пептида, б) присоединения по меньшей мере одного специфически расщепляемого метионина на конце этого (поли)пептида, в то время как метионин (метионины) в (поли)пептиде являются защищенными против расщепления посредством защиты сульфоксидной группой, в) удлинения этого (поли)пептида и метионина(метионинов), присоединенных к нему, меткой с получением удлиненного полипептида, г) очистки удлиненного (поли)пептида при помощи способа очистки, специфического к метке, д) удаления метки и дополнительного метионина (метионинов) из удлиненного (поли)полипептида при помощи расщепления цианоцианоцианогенбромидом, с получением очищенного (поли)пептида, причем метка представляет собой His-последовательность His-His-His-His-His-His-Gly-Gly-. 2 с. и 4 з.п. ф-лы, 1 табл., 4 ил.

1. Способ модификации (поли)пептидов для облегчения их очистки, включающий встраивание по меньшей мере одного специфически расщепляемого метионина и метки (тэга) в конце (поли)пептидной цепи во время их синтеза и защиту остатков метионина в этом (поли)пептиде, если они присутствуют, от расщепления путем защиты их сульфоксидной группой, отличающийся тем, что эта метка (тэг) является His-меткой. 2. Способ получения очищенных (поли)пептидов при помощи способа модификации по п. 1, предусматривающий стадии: a) синтеза целевого (поли)пептида; b) присоединения по меньшей мере одного специфически расщепляемого метионина на конце этого (поли)пептида, в то время как метионин (метионины) в (поли)пептиде, если они присутствуют, являются защищенными против расщепления посредством защиты сульфоксидной группой; c) удлинения этого (поли)пептида и метионина (метионинов), присоединенных к нему меткой с получением удлиненного полипептида; d) очистки удлиненного (поли)пептида при помощи способа очистки, специфического к метке; e) удаления метки и дополнительного метионина (метионинов) из удлиненного (поли)пептида при помощи способа расщепления, основанного на цианогенбромиде, с получением очищенного (поли)пептида, отличающийся тем, что метка представляет собой His- последовательность-метку. 3. Способ по п. 2, где His-последовательность - метка состоит из His-His-His-His-His-His-Gly-Gly. 4. Способ по п. 2 или 3, где способ очистки, специфический к метке, представляет собой хроматографию, основанную на аффинности в отношении последовательности-метки. 5. Способ по пп. 2-4, где целевой (поли)пептид получают способами рекомбинантных ДНК в живом хозяине и вместо защиты сульфоксидной группой метионины в (поли)пептиде делегированы или заменены другой аминокислотой, такой, как валин, глицин или модифицированный метионин. 6. Способ по п. 5, где живой хозяин является эукариотическим хозяином или прокариотическим хозяином, таким, как Escherichia coli.

Приоритета по пунктам:
09.09.1996 - по пп. 1-4;
02.05.1997 - пo пп. 5 и 6.