Способ твердофазного синтеза пептидов Советский патент 1976 года по МПК C07K1/04 C07K7/06 A61K38/08 

1

Предлагается улучшенный твердофазный способ получения пептидов, который может найти применение в синтезе биологически активных пептидов, например гормонов.

В химии пептидов известны твердофазные методы синтеза пептидов, которые состоят в том, что исходную аминокислоту ковалентно связывают с полимерным носителем с последующим наращиванием пептидной цепи путем конденсации аминокислотных остатков 1 - 3 и 5. Готовые пептидные цепи снимаются с полимерного носителя только после заверщения всего процесса с помощью реагентов, разрущающих ковалентную связь пептида с носителем.

Однако при осуществлении известного способа невозможно выделять продукт на отдельных этапах синтеза и очищать его.

При снятии готового пептида с полимерного носителя кроме расщепления ковалентной связи пептид-носитель могут протекать другие побочные реакции, ведущие к загрязнению конечного продукта 4.

Целью изобретения являются упрощение процесса за счет использования легкодоступного, дещевого носителя - силикагеля - и улучщение качества целевого продукта благодаря тому, что на любом этапе синтеза продукт может быть выделен, очищен и проанализирован. При этом для образования пептидной связи можно использовать любые из существующих методов. Наиболее подходящим является метод активированных эфиров 5.

Предлагаемый способ твердофазного синтеза пептидов путем конденсации аминокислотных остатков на твердом носителе отличается тем, что в качестве твердого носителя используют силикагель, пропитанный полярным растворителем и суспендированный в неполярном жидком предельном углеводороде.

В качестве полярного растворителя используют растворители, не смещивающиеся с жидкими углеводородами, например диметилформамид, ацетонитрил, гексаметилтриамид фосфорной кислоты.

В качестве неполярных растворителей применяют гексан, петролейный эфир, гептан, октан.

Количество силикагеля, необходимое для синтеза полимера, определяется размером конечного полимера.

Количество силикагеля зависит от размера конечного пептида, например для дипептидов достаточно брать 1-2 г силикагеля на 1 ммоль пептида, для декапептпдов 5-10 г, другими словами п граммов силикагеля на 1 ммоль пептида, состоящего из я аминокислотных остатков.

Паносят исходные вещества на силикагель следующим образом. 1 ммоль аминокомпонента (эфира или амида аминокислоты или пеитида) растворяют в спирте, в раствор добавляют силикагель (из расчета п граммов для синтеза пептида, состоящего из п аминокислотных остатков), тщательно перемешивают до образования однородной массы, затем растворитель удаляют в вакууме. Примеры. А. Z-Вал-вал-OBzl. 0,75 г (2 ммоль) толуолсульфоната бензилового эфира валина наносят на 5 г силикагеля, как указано выше. Полученную массу добавляют к раствору 0,9 г (2,16 ммоль) Z-Вал- OCsFs в смеси 2,5 мл диметилформамида н 40 мл гексана и при энергичном перемешивании доводят рН до 8-8,5, добавляя 0,6 мл триэтиламина. Реакционную смесь перемешивают 1 час, затем силикагель отфильтровывают и промывают несколько раз гексаном. Продукт реакции элюируют этилацетатом, полученный раствор промывают 5%-ной соляной кислотой, насыщеным раствором бикарбоната натрия, водой. После отгонки растворителя получают хроматографически чистый дипептид с выходом 0,82 г (93%), т. пл. 115- 116,5°С (по литературным данным т. пл. 111 - 112°С). Б. Z-АСН-Сер-ОСНз. Подготовку и синтез проводят аналогично пункту А. После синтеза силикагель промывают эфиром и этилацетатом, продукт реакции элюируют диметилформамидом, растворитель отгоняют в вакууме, остаток заливают водой и выдерживают в холодильнике несколько часов. Выпавшие кристаллы отфильтровывают, тщательно промывают эфиром, сушат до поАминокислотный

составЦис(В21) Тир Иле Глю Асп Про Лей Гли

Вычислено2 1111111

Найдено2,08 1,0& 1,06 1,24 1,15 1,01 1,08 1,0

Д. Вос-Цис(Вг1)-Про-Лей-Гли-ЫН2.

К 0,32 г (1 ммоль) ПС1-Про-Лей-Гли- КН2, нанесенного на 5 г силикагеля, добавляют 40 мл гексана, затем при перемешивании приливают раствор 1 г (2,1 ммоль) Вос-Цис(Вг1)OCeFs в 2 мл ацетонитрила (или гексаметилтриамида фосфорной кислоты), рН раствора доводят до 8,5-9 добавляя триэтиламин. Смесь перемешивают 1 час при комнатной температуре. Силикагель отфильтровывают, промывают эфиром (3X50 мл). Пептид элюируют тремя порциями этанола (по 50 мл). Этанол отноняют, остаток обрабатывают водой, выпавший осадок отфильтровывают, промывают эфиром и сушат над фосфорным ангидридом. Получают указанное соединение. При использовании в качестве полярного растворителя ацетонитрила выход 0,53 г (92%), т. пл. 172-174°С, при применении гексаметилтриамИда фосфорной кислоты выход 0,54 г (93,5%), т. пл. 175-176°С.

Е. В синтезе указанного в пункте Д тетрапептида с одинаковым успехом применяют петролейный эфир, гептан и октан. Во всех случаях выход тетрапептида практически одинаков (90%).

Формула изобретения

1.Способ твердофазного синтеза пептидов путем конденсации аминокислотных остатков на твердом носителе, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и улучшения качества целевого продукта, в качестве твердого носителя используют силикагель, пропитанный полярным растворителем и суспенднрованный в неполярном жидком предельном углеводороде.

2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве полярного растворителя исстоянного веса над фосфорным ангидридом. Выход хроматографнчески однородного дипептида 97%, т. пл. 199-202°С (по литературным данным т. пл. 195-196°С). В. Вое-Трп-Мет-Асп(ОН)-Фе-,NH2. Указанный тетрапептид синтезируют, исходя из 0,16 г (1 ммоль) Н-Фе-NH2. Синтезированный тетрапептид элюируют диметилформамидом, растворитель удаляют почти полностью в вакууме, остаток растворяют в этилацетате и промывают 5%-ным KHSO4 н водой, содержащими диметилформамида. Затем этилацетат отгоняют, остаток промывают эфиром и кипятят с абсолютным этилацетатом. Остаток отфильтровывают и промывают этилацетатом. Выход хроматографически чистого тетрапентида 0,51 г (71%, т. е. в среднем 95% на стадию), т. пл. 205- 210°С (но литературным данным т. нл. 209- 210°С). Г. Н-Цис (Bzl) -Тир-Иле-Глн-Асн-Цис (Bzl) Про-Лей-Гли-МНг. Указанный нонапентид синтезируют, исходя из 0,32 г (1 ммоль) НС1-Про-Лей-Гли-НН2. Конечный продукт элюируют горячим диметилформамидом, растворитель удаляют в вакууме, остаток промывают водой, эфиром и сушат над фосфорным ангидридом. Выход составляет 0,41 г (29%). Полученный продукт обрабатывают НВг в уксусной кислоте (5,5 н.), высаживают в эфир и перекристаллизовывают из воды. Выход электрофоретически и хроматографически чистого продукта 0,25 г (19%, считая на исходный НСЬП-ПроЛей-Гли-МН2).

пользуют растворители, не смешивающиеся с жидкими предельными углеводородами, например диметилформамид, ацетонитрил, гексаметилтриамид фосфорной кислоты.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве неполярных растворителей используют гексан, петролейный эфир, гептан, октан.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Патент СССР № 250153, М. Кл. С 07С 103/52, 12.08.69.

2.Патент Швейцарии № 512439, класс С 07С 103/52, 29.10.71.

3.Стюарт Д., Янг Д., «Твердофазный синтез пептидов, М., «Мир, 1971.

4. Feinberg R. S., Merrifield R. В., «Modification of Peptides Containing Glutamic Acid by Hydrogen Fluoride-Anisole Mixtures, 7-Acylation of Anisole or the Glutamyl Nitrogen, J. Amer, Chem. Soc., 97, № 12, 3485,

1975.

5. Шредер Э., Любке К., «Пептиды, т. 1, стр. 116-190, М., «Мир, 1969.