Радиолюминесцентный препарат на основе аддукта хлорина Е6 и европия для фотодинамической терапии глубоких опухолей Российский патент 2025 года по МПК A61K41/00 A61K31/409 A61N5/06 A61N5/10 A61P35/00 

Изобретение относится к области фармакологии и биотехнологии, и направлено на решение задачи усиления фотодинамического повреждения клеток-мишеней с помощью биологически активных соединений хлоринового ряда, в частности производных хлорина Е6, и может быть использовано в клеточной и молекулярной биологии, в разработке методов, применимых в экспериментальной медицине и фармакологии в качестве высокоэффективного фотосенсибилизатора (ФС) для фотодинамической терапии (ФДТ) рака и других новообразований различного генезиса, а также флуоресцентной диагностики раковых клеток.

В настоящее время в клинической практике при ФДТ применяется целый ряд ФС, созданных на основе соединений различных химических классов. Однако наряду с ныне используемыми препаратами продолжаются активные поиски и исследования новых, более эффективных ФС. Так в течение последних двух десятилетий особый интерес в качестве ФС представляют производные природных хлорофиллов - хлорины. Установлено, что ФС хлоринового ряда быстро накапливаются в опухолевой ткани с высоким градиентом контрастности опухоль/здоровая ткань, обладают высокой фотодинамической активностью и терапевтической эффективностью. Кроме того, хлорины быстро выводятся из организма, что полностью решает проблему длительной кожной фототоксичности, являющейся основным недостатком почти всех применяющихся в клинике ФС. Не смотря на все преимущества ФДТ, в ряде случаев ее использование связано с невозможностью создания достаточной концентрации фотосенсибилизатора в опухоли или невозможностью эффективной доставки лазерного излучения при некоторых локализациях злокачественных новообразований. Целый ряд нозологических форм первичной опухоли и ее метастазов недоступны для воздействия света, что ограничивает возможности применения ФДТ. Одним из решений данной проблемы считается создание фармакологических препаратов для ФДТ на основе комплексов органических фотосенсибилизаторов с наночастицами, которые помимо доставки фотосенсибилизатора в опухоль могут выполнять роль эффективного донора энергии фотовозбуждения. Одним из перспективных типов таких наночастиц на данный момент является использование нанолюминофоров.

Одним из таких известных ФС является препарат, который наряду с фотосенсибилизатором включает коллоидный раствор нанолюминофора Ва₃(PO₄)₂:Eu²⁺ [В. Бахметьев и др. Нанолюминофоры для рентгенофотодинамической терапии онкологических заболеваний / Наноиндустрия. 2013. №8. С. 46.]. Авторами данного изобретения разработана технология, позволяющая получать нанолюминофоры на основе ортофосфатов осаждением из водных растворов золь-гель-методом. Синтезирован ряд соединений с различными катионами, в частности, состава Ва₃(PO₄)₂:Eu²⁺, обладающих наиболее высокой интенсивностью свечения при возбуждении жестким рентгеновским излучением с длинами волн 0,12-0,31 А, что соответствует излучению медицинских терапевтических установок.

К недостаткам известного препарата относится необходимость использования жесткого рентгеновского излучения, которое оказывает пагубное влияние на здоровые клетки, кроме того, продуцируемый фотосенсибилизатором активный кислород неизбежно должен расходоваться помимо прямого назначения на окисление Eu²⁺ до более устойчивого состояния Eu³⁺, и, следовательно, эффективность фотосенсибилизатора будет снижаться.

Еще одним аналогичным изобретением является препарат для ФДТ, содержащий фотосенсибилизатор «Радахлорин» основу которого составляет смесь натриевых солей хлорина е6, хлорина р6 и пурпурина 5 и нанолюминофоры (NaGdF₄:Eu³⁺), (YF₃:Yb³⁺,Er³⁺) [В.В. Бахметьев др. Нанолюминофоры на основе смешанных фторидов для фотодинамической терапии онкологических заболеваний / Известия СПбГТИ(ТУ). 2018. №42 С. 26-51]. Авторами показано, что люминофор NaGdF₄:Eu³⁺ является наиболее подходящим для ФДТ с использованием рентгеновского излучения, а люминофор YF₃:Yb³⁺,Er³⁺ - для ФДТ с использованием инфракрасного излучения. Исследована эффективность генерации активного кислорода препаратом, содержащим наноломинофор YF₃:Yb³⁺,Er³⁺ и фотосенсибилизатор «Радахлорин», под воздействием инфракрасного лазера с длиной волны 980 нм. В частности, был приготовлен препарат на основе бидистиллированной воды, содержащий нанолюминофор YF₃:Yb³⁺,Er³⁺ в концентрации 2,0 г/л и фотосенсибилизатор «Радахлорин» в концентрации 8,75 мг/л. В качестве стабилизатора коллоидного раствора использовался лаурилсульфат натрия.

К недостаткам данного препарата относится низкая эффективность генерации активного кислорода, обусловленная тем, что люминофор и фотосенсибилизатор непосредственно не связаны между собой, что затрудняет передачу энергии от люминофора.

Известен [О.В. Шевченко и др. Молекулярные комплексы хлорина е6 и европия для радиофотодинамической терапии / Вестник ДВО РАН. 2020. №2. С. 103-107] фотосенсибилизатор и способ его получения представляющий собой мультимодальный комплекс на основе полиэтиленимина (PEI) с молекулярной массой 25 тыс. дальтон, который синтезировали поэтапным связыванием компонентов с аминогруппами. Для активации карбоксильных групп хлорина е6 (Е6), диэтилентриаминпентауксусной (DTPA) и фолиевой кислот (FA) использовали 1,2 М водорастворимого карбодиимида, 1,2 моль N-оксисукцинимида и 0,12 М 4-диметиламинопиридина в каждом случае. Фолиевую кислоту присоединяли для целевой доставки комплекса к раковым клеткам. В растворе полученное вещество состава PEI/E6/DTPA/FA (мольное соотношение 1:1:1:1) насыщали EuCl₃ при рН 6,5. Данный препарат эффективно генерирует активные формы кислорода при воздействии гаммаизлучением.

Недостатком этого препарата является его положительный заряд, обусловленный свободными амино-группами и вызывающий неспецифическое ионное связывание с клетками.

Известен [патент РФ 2797948, опубликован 13.06.2023] фотосенсибилизатор на основе комплекса хлорина е6 и европия. Для получения фотосенсибилизатора к раствору Хлорина е6 (Е6) добавляют раствор водорастворимого карбодиимида (WSC), N-гидроксисукцинимида (NHS), 4-диметиламинопиридина (DMAP). Далее к полученному раствору добавляют раствор полиэтиленимина (PEI) в дистиллированной воде. На следующем этапе к этому раствору добавляют натриевую соль диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTPA) в 0,01 М NaHCO₃ с предварительной активацией WSC, NHS, DMAP в дистиллированной воде. На следующем этапе вносят фолиевую кислоту (FA), карбоксильные группы которой активируют WSC, NHS и DMAP в дистиллированной воде. К полученному раствору добавляют EuCl₃. На завершающем этапе свободные аминогруппы ацилируют избытком лимонной кислоты, активированной WSC, NHS и DMAP в дистиллированной воды. В результате получают конъюгат PEI/E6/DTPA/FA/CA/Eu. Так как все клетки заряжены отрицательно для усиления адресной доставки препарата раковым клеткам его положительный заряд, вызывающий неспецифическое ионное взаимодействие со свободными положительно заряженными группами полиэтиленимина, подавляется на последнем этапе получения конъюгата их ацилированием избытком лимонной кислоты. Все активные элементы препарата, такие как Хлорин е6, фолиевая кислота, хелатор европия и лимонная кислота связаны ковалентными связями с полиэтиленимином.

К недостаткам данного препарата относится большой размер коньюгата сформированный на полимерной матрице полиэтиленимина, что затрудняет его таргетную доставку и проникновение в раковую клетку. В частности, в результате исследования поглощения ФС клетками асцитной аденокарциномы Эрлиха, которое оценивались методом флуоресцентной микроскопии при облучении красным светом с λ=645 нм. было установлено, что во всех случаях наибольшее поглощение наблюдалось для фотосенсибилизатора Хлорина е6 в сравнении с его конъюгированной формой, что объясняется трудностью проникновения в клетку полимера полиэтиленимина.

В качестве прототипа выбрана композиция [US 2016271251, опубликован 22.09.2016], в которой радиолюминесцентное соединение для лучевой терапии и фотодинамической терапии глубоких опухолей, включает молекулярный конъюгат, состоящий из радиолюминесцентной молекулы и один фотосенсибилизатор, причем радиолюминесцентная молекула подходит для поглощения рентгеновских лучей с энергией выше порога поглощения и для излучения люминесцентного излучения в видимой области и фотосенсибилизатор, подходящий для поглощения люминесцентного радиации и получения синглетного кислорода. Радиолюминесцентная молекула представляет собой хлорид лантаноида, например, EuCl₃, а фотосенсибилизатор выбирается из числа следующих: фталоцианин Al(III), mTHPC, хлорин е6, гиперицин, гипокреллин, нильский синий, оксазин 170, Оксазин 1, Протопорфирин IX, 7-метоксикумарин-4-уксусная кислота, бактериохлорофилл и аурамин.

Недостатком данного препарата является то, что образующийся комплекс европия с хлорином е6 не растворим в воде, в результате чего возникают проблемы доставки препарата к опухоли. Авторы патента приводят данные по люминесценции хлорида европия и фотосенсибилизатора гиперицина в растворе диметилсульфоксида, однако этот растворитель в отличие от воды весьма токсичен.

Задачей изобретения является создание водорастворимого радиолюминесцентного препарата, содержащего в качестве радиолюминесцентной молекулы соединение европия (3+) и в качестве фотосенсибилизатора хлорин Е6 для фотодинамической терапии глубоких опухолей.

Технический результат заявляемого изобретения заключается минимизации токсичности препарата для фотодинамической терапии за счет получения водорастворимого радиолюминесцентного препарата и увеличении эффективности фотосенсибилизатора за счет получения комплекса небольшого размера, позволяющего проникать препарату прямо в клетку.

Технический результат предлагаемого изобретения достигается созданием водорастворимого аддукта на основе нитратного комплекса европия и хлорина Е6.

Поставленная задача решается следующим образом.

Для получения водорастворимого радиолюминесцентного препарата к водному раствору, содержащему хлорид европия, добавляют цитрат натрия перемешивают и доводят дистиллированной водой до необходимого объема с pH = 7, получая водорастворимый комплекс цитрата европия (мольное соотношение Eu:cit=1:3). Затем раствор димеглюмина хлорина Е6 с исходным pH = 8.9 разбавляют в 10 раз дистиллированной водой и доводят до pH = 7,0 разбавленным раствором соляной кислоты. На завершающем этапе к разбавленному раствору димеглюмина хлорина Е6 прибавляют соответствующее количество полученного раствора цитрата европия (мольное соотношение аддукт хлорина E6:Eu:cit=1:1:3), водой доводят до нужного объема и перемешивают 4 часа.

В результате получают водорастворимый радиолюминесцентный препарат, содержащий радиолюминесцентную молекулу цитрата европия и фотосенсибилизатор хлорин Е6, и обладающий небольшим размером.

Возможность конкретного осуществления изобретения подтверждается следующим примером.

Для получения фотосенсибилизатора изначально готовят исходный раствор хлорида европия с цитратом натрия (мольное соотношение Eu:cit=1:3), с концентрацией европия 3,29⋅10^-3 моль/л. Для этого в колбу на 100 мл добавляют 0,1206 г EuCl₃⋅6Н₂О и 0,3527 г цитрата натрия C₆H₅O₇Na₃⋅5,5Н₂О, перемешивают, доводят до 100 мл дистиллированной водой, pH полученного раствора 7,0.

Далее раствор димеглюмина хлорина Е6 (Фотодитазина) с концентрацией 5,065⋅10^-3 моль/л (pH исходного раствора 8,9) разбавляют в 10 раз дистилированной водой и доводят до pH = 7,0 разбавленным раствором соляной кислоты (конц 1 моль/л).

На завершающем этапе готовят аддукт хлорин Е6-Eu-cit с мольным соотношением 1:1:3. В колбу на 10 мл прибавляют 1 мл разбавленного в 10 раз димеглюмина хлорина Е6 и 0.15 мл раствора европия, доводят объем до 10 мл водой и перемешивают на магнитной мешалке 4 часа.

Исследование жизнеспособности клеток асцитной карциномы Эрлиха проводили через 1 сутки контакта клеток с растворами Eu-Фотодитазин в диапазоне вносимых концентраций 12,5-400 мкг/мл с разведением в 2 раза, в условиях отсутствия светового воздействия. Определено, что при таких условиях для раствора 100-400 мкг/мл Eu-Фотодитазин жизнеспособность клеток менее 10%, в то время как концентрации от 50 мкг/мл и ниже высокая жизнеспособность сохраняется. Для интактных контрольных клеток без воздействия фотосенсибилизатора отмечено 99,97±4,99% жизнеспособности.

Изобретение относится к области фармакологии и биотехнологии и может быть использовано в качестве высокоэффективного фотосенсибилизатора для фотодинамической терапии рака и других новообразований различного генезиса, а также флуоресцентной диагностики раковых клеток. Предложен способ получения радиолюминесцентного препарата на основе аддукта хлорина Е6, содержащего в качестве люминофора соединение европия. К разбавленному водному раствору димеглюмина хлорина Е6 добавляют водорастворимый комплекс цитрата европия при мольном соотношении димеглюмин хлорина E6:Eu:cit=1:1:3 с рН=7. Комплекс цитрата европия получают добавлением к водному раствору хлорида европия цитрата натрия при мольном соотношении Eu:cit=1:3. Изобретение позволяет минимизировать токсичность препарата для фотодинамической терапии глубоких опухолей и увеличить эффективность фотосенсибилизатора за счет получения комплекса небольшого размера, позволяющего проникать препарату прямо в клетку. 1 пр.

Способ получения радиолюминесцентного препарата для фотодинамической терапии глубоких опухолей на основе аддукта хлорина Е6, содержащего в качестве люминофора соединение европия, отличающийся тем, что к разбавленному водному раствору димеглюмина хлорина Е6, доведенного до рН=7 0,1 М раствором соляной кислоты, добавляют водорастворимый комплекс цитрата европия при мольном соотношении димеглюмин хлорина E6:Eu:cit=1:1:3 с рН=7, полученный добавлением к водному раствору хлорида европия цитрата натрия при мольном соотношении Eu:cit=1:3.