ШТАММ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОК ПОЧКИ ПОРОСЕНКА SUS SCROFA РК-15/А11, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ Российский патент 2003 года по МПК C12N5/06 C12N7/00 

Изобретение относится к вирусологии, в частности к культивированию клеток и тканей с целью наработки и изучения вирусов.

Известна перевиваемая линия клеток почки поросенка РК-15, изолированная в 1957 году М. Harris из культуры клеток РК-2а почки взрослой свиньи Sus scrofa (АТСС, CCL 33) [1, 2].

Штамм перевиваемых клеток РК-15 из-за того, что его культивировали в лабораториях мира при нестандартных режимах и в различных по составу питательных средах, стал нестабильным по культуральным, морфологическим, цитогенетическим характеристикам и чувствительности к вирусу классической чумы свиней.

Биотехнологическое использование линии клеток РК-15 лимитирует необходимость включения в состав ростовой среды фетальной сыворотки крови или сыворотки крови новорожденных телят, что неприемлемо по экономическим соображениям в биотехнологии производства вакцинных препаратов.

Целью изобретения является получение штамма перевиваемых клеток почки поросенка РК-15/А11, стабильного по биотехнологическим характеристикам, обеспечивающего высокий уровень репродукции вируса классической чумы свиней, пригодного для научно-исследовательской работы и производства вакцин против КЧС.

Штамм клеток РК-15/А11 получен из перевиваемой линии клеток почки поросенка РК-15, клонированной методом предельных разведений в питательной среде Игла MEM, содержащей 20% фетальной сыворотки крови телят с отбором и селекцией высокочувствительного к вирусу классической чумы свиней и генетически однородного клона клеток, и дальнейшей трофической адаптацией клеток в течение 5 пассажей к культивированию в среде Игла MEM с 5% сыворотки крови крупного рогатого скота, обработанной полиэтиленгликолем.

Штамм РК-15/А11 характеризуется следующими признаками.

Культуральные свойства. Жизненный цикл штамма, при котором сохраняются основные биологические показатели клеток, составляет 50±5 пассажей. При посевной дозе 80-110 тыс. клеток/мл монослой формируется на 2-3 сутки культивирования и сохраняется без смены среды в течение 10-12 дней. В литровом матрасе накапливается 75-80 млн. клеток. Коэффициент пересева -1:3-1:5
Штамм РК-15/А11 культивируют в монослойных культурах в среде Игла MEM с 5% сыворотки крови крупного рогатого скота, обработанной полиэтиленгликолем с молекулярной массой 6000, в конечной концентрации 7-10% от объема сыворотки. Для диспергирования клеточного пласта при пересевах используют смесь 0,02% раствора версена и 0,25% раствора трипсина в соотношении 3:1 при температуре 37^oС.

Для криоконсервирования при -196^oС применяют смесь, состоящую из 85% среды Игла MEM, 5% сыворотки крови крупного рогатого скота, обработанной ПЭГ и 10% диметилсульфоксида, при концентрации клеток 8-12•10⁶ в мл. Жизнеспособность клеток по тесту витального окрашивания трипановой синью после хранения в жидком азоте составляет 80-90%. Клетки восстанавливают исходные ростовые и морфологические свойства в течение 2-3 пассажей.

Создан банк рабочих клеток изготовителя (БРКИ) в количестве 300 млн. клеток. Клетки криоконсервированы в жидком азоте на уровне 11, 15, и 16 пассажах во ВНИИВВиМ (регистрационный 2.11).

Морфологические признаки. Культура клеток представлена мелкими эпителиоподобными клетками с умеренно зернистой цитоплазмой и четко очерченными границами. Ядро округлой формы с 1-2 ядрышками.

Кариологическая характеристика. Популяция гетероплоидная. Варьирование хромосомных наборов от 28 до 50. Модальный класс (58%) составляют клетки, содержащие 31 хромосому.

Гистохимическим методом азосочетания (с использованием в качестве субстрата α-нафтилацетата) установлена высокая активность неспецифических эстераз.

Видовая идентичность подтверждена кариологическими методами.

Прививаемость изогенным животным отсутствует.

Контроль штамма РК-15/А11 на посторонние контаминанты. При обследовании клеток штамма РК-15/А11 на стерильность (наличие бактерий, грибов, микоплазм) получены отрицательные результаты.

Чувствительность к вирусам. Клетки штамма РК-15/А11 чувствительны к различным штаммам вируса классической чумы свиней (таблица)
Штамм перевиваемых клеток РК-15/A11 предназначен для использования в производстве вакцинных препаратов против классической чумы свиней.

Штамм перевиваемых клеток почки поросенка Sus scrofa PK-15/A11 депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических культур клеток сельскохозяйственных и промысловых животных Российской коллекции культур клеток при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии (СХЖ РАСХН) под 54.

Источники информации
1. Pirtle EC and Woods LK. Cytogenetic alterations in swine kidney cells persistenty infected with hog cholera virus and propagated with and without antiserum in the medium // Am. J. Vet. Res., 1968, 29, 153-164;
2. Armstrong JA et al. C-type virus particles in pig kidney cell lines // J. Genet. Virol., 1971, 10, 195-198.

Изобретение относится к вирусологии, в частности к области культивирования клеток и тканей для наработки и изучения вирусов. Штамм клеток РК-15/А11 получают путем клонирования линии клеток почки поросенка РК-15 методом предельных разведений и пассирования в среде Игла МЕМ с 5% фетальной сыворотки крови телят или новорожденных телят и дальнейшей трофической адаптацией в течение 5 пассажей к культивированию в среде Игла МЕМ с 5% сыворотки крови крупного рогатого скота, обработанной ПЭГ. Кариотип стабилен на протяжении 50 пассажей. Модальный класс представлен клетками, содержащими 31 хромосому (58%). Культура клеток РК-15/А11 чувствительна к различным штаммам вируса классической чумы свиней и является производственным штаммом для изготовления вакцины против классической чумы свиней. Изобретение позволяет получить штамм перевиваемых клеток почки поросенка, стабильный по биологическим характеристикам, в производстве вакцин против КЧС. 1 табл.

Штамм перевиваемых клеток почки поросенка Sus scrofa РК-15/А11 депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических культур клеток сельскохозяйственных и промысловых животных Российской коллекции культур клеток при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии (СХЖ РАСХН) под 54, используемый для вирусологических исследований.