СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ РЕПРОДУКТИВНО-РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА СВИНЕЙ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/53 A61K39/12 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к способам дифференциальной диагностики репродуктивно-респираторного синдрома свиней путем выявления специфических антител гистохимическим вариантом иммуноферментного анализа, и может быть использовано в научно-исследовательских институтах и в ветеринарных лабораториях.

Известно, что при диагностике репродуктивно-респираторного синдрома свиней применяют комплекс методов, направленных на выделение вируса; выявление его антигенов, а так же антител к вирусу: реакция иммунофлуоресценции (Fichtner D., Beyer L., Ltopoldt D., Schirrmeir H., Bergmann S., Fischner U. Experimentelle reproduktion der respiretorischen verlaufsform der infektion mit dem erreger des seuchenhaften spatabortes der scweine// Mh. Vet. Med., 1993, Bd. 106, s. 145-149; Fichtner D., Bergmann S., Schirrmeier H. Einsatz des indirekten immunoflureszebztestes zum nachweis von antikorpern gegen das virus des porcine reproduktive abd respiratory syndrom (RRSS).// Mh. Vet. Med., 1994, Bd. 49, Im Druck.), твердофазный иммуноферментный анализ (Albina E. , Zeforban Y., Baron T., Duran J Plana, Vannier P. An enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) of the detection of antibodies to the porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus.// Ann Rech Vet., 1992, v. 23 p. 167-176).

Известен так же гистохимический вариант иммуноферментного анализа (ГХ ИФА), разработанный G. Wensvoort и сотр. (G. Wensvoort, C. Terpstra, J.M.A. Pol and all. Mystery swine disease in the Netherlands: the isolation of Lelystad virus.// The Veterinary Quarterly, v. 13, N 3, July 1991) и V.F.Ohlinger (P.O. box 1149 D-7400. Tubingen FRG, 1991, p. 1 - 4).

G. Wensvoort и др. использовали альвеолярные макрофаги свиней, которые после посадки в ленки 96-луночных полистироловых панелей инфицировали вирусом репродуктивно-респираторного синдрома свиней, фиксировали формальдегидом, инкубировали с разведениями сывороток в течение 1 ч при 37^oC. Все разведения сывороток делали на забуференном физиологическом растворе (ЗФР) с добавлением 0,1% Твина-80 и 4% сыворотки лошади. Лунки панели отмывали, вносили в них кроличьи антисвиные иммуноглобулины, коньюгированные с пероксидазой хрена, и инкубировали в течение 1 ч при 37^oC. Лунки панели отмывали и вносили в них субстрат, содержащий 3-амино-9-этилкарбазол в Na-ацетатном буфере.

Ohlinger V. F. тоже использовал альвеолярные макрофаги свиней, которые после посадки в лунки панели инфицировал вирусом репродуктивно-респираторного синдрома свиней, фиксировал этанолом и инкубировал в 20% метаноле на физиологическом растворе. Затем в лунки панели вносил на 5 мин перекись водорода, разведенную в физиологическом растворе (1:192), отмывал лунки панели и вносил в них сыворотки, разведенные на 2% казеине на ЗФР с добавлением Твина-80, а затем инкубировал 1 ч при комнатной температуре. После отмывки лунок панели вносил в них антисвиные иммуноглобулины G, коньюгированные пероксидазой хрена, которые разводил в 5% нормальной сыворотке лошади в ЗФР-Твине-80 и инкубировал при комнатной температуре в течение часа. Лунки панели отмывал и вносил в них субстрат, содержащий 3-амино-9-этилкарбазол в Na-ацетатном буфере.

Однако предложенный Wensvoort и сотр. метод, предполагает использование альвеолярных макрофагов свиней, фиксацию макрофагов ядовитым веществом - формальдегидом. Метод, предложенный Ohliпger V.F., предполагает использование альвеолярных макрофагов свиней, длительный способ их фиксации и использование ядовитого вещества - метанола.

Цель изобретения - разработка экономически выгодной и безвредной специфической дифференциальной диагностики репродуктивно-респираторного синдрома свиней.

Цель достигается тем, что при постановке гистохимического варианта ИФА для диагностики репродуктивно-респираторного синдрома свиней используют инфицированную вирусом PPCC стандартную перевиваемую культуру клеток MARC-145. По сравнению с прототипами это более экономично, так как не связано с убоем животного-донора с целью получения первичной культуры клеток альвеолярных макрофагов и сопровождается вчетверо меньшим расходом сыворотки телят, добавляемой в питательную среду. Чувствительность перевиваемой культуры клеток MARC-145 к вирусу PPCC стабильна в отличие от чувствительности первичной культуры клеток альвеолярных макрофагов, зависящих от индивидуальных особенностей организма животного-донора. В отличие от прототипов фиксируют культуру клеток ацетоном, что исключает использование таких ядовитых веществ, как метанол и формальдегид.

В нашей стране исследования по разработке средств и методов лабораторной диагностики репродуктивно-респираторного синдрома свиней гистохимическим вариантом ИФА не проводились.

Пример конкретного выполнения. При постановке гистохимического варианта ИФА используют 96-луночные панели для микрокультивирования. В работе используют субстрат пероксидазы, который готовят следующим образом: 10 мл 3-амино-9-этилкарбазола, растворенного в 3 мл N N диметилформамида, добавляют в 50 мл 0,05 M раствора ацетата натрия pH 5, затем добавляют 0,2 мл 3%-ной перекиси водорода.

С целью выявления антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней ставят непрямой гистохимический вариант ИФА.

Перед началом постановки метода готовили тест-препараты. Для этого культуру клеток MARC-145, выращенную в 96-луночных полистироловых панелях, заражали вирусом репродуктивно-респираторного синдрома свиней в дозе 0,001 - 0,0001 ТЦД 50/кл. в объеме 0,1 см³ на лунку. Через 48 ч инкубации при 37^oC поддерживающую среду удаляли, монослой культуры клеток фиксировали 20-ти процентным раствором ацетона в дистиллированной воде, охлажденным при минус 60^oC. Полистироловые 96-луночные панели (тест-препараты) подсушивали и оставляли на хранение при минус 60^oC или использовали для постановки реакции.

При постановке гистохимического варианта ИФА все компоненты реакции вносили в объеме 0,1 см³ на лунку. В лунке панели исследуемые сыворотки вносили в разведениях 1:80 - 1:320. При выборе оптимального буфера для разведения исследуемых сывороток использовали три различных буфера:
а) 2% казеин в ЗФР с добавлением 0,1% Твина-80;
б) ЗФР с добавлением 0,1% Твина-80 и 4% сыворотки лошади;
в) 1% бычий сывороточный альбумин (БСА) в ЗФР с добавлением 0,1% Твина-80.

Результаты по использованию различных буферов для разведения исследуемой сыворотки крови свиней представлены в табл. 1.

Из данных таблицы видно, что титр антител к вирусу PPCC в сыворотке крови свиньи при использовании различных буферов для ее разведения оставался неизменным. Для постановки гистохимического варианта ИФА мы использовали буфер, состоящий из 1% БСА в ЗФР с добавлением 0,1% Твина-80, так как данный буфер не требует длительного приготовления, а реагенты, входящие в его состав доступны.

После отмывки лунок панели от сыворотки (3 - 5 раз) вносили в них антисвиные ПХ-иммуноглобулины и инкубировали 30 мин при 37^oC. После отмывки лунок панелей (5 - 7 раз) вносили в них субстрат и оставляли на 10 - 15 мин при 37^oC. После этого проводили световую микроскопию.

Антитела к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней в препаратах обнаруживали по темно-коричневой (красной) окраске цитоплазмы зараженных клеток и отсутствию окрашивания цитоплазмы неинфицированных клеток.

В работе по дифференциальной диагностике репродуктивно-респираторного синдрома свиней мы использовали сыворотки крови животных, содержащие антитела к болезням, клинически сходным с репродуктивно-респираторным синдромом свиней. Результаты по обнаружению антител к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней в сыворотках крови животных представлены в табл. 2.

Результаты исследований, представленные в таблице, свидетельствуют, что предлагаемым способом диагностики можно дифференцировать репродуктивно-респираторный синдром свиней от классической чумы свиней, болезни Ауески, респираторного короновируса свиней, болезни Тешена, парвовирусой болезни, трансмиссивного гастроэнтерита свиней.

Предлагаемый способ позволяет проводить специфическую дифференциальную диагностику репродуктивно-респираторного синдрома свиней от клинически сходных заболеваний, экспрессен, безвреден, прост в использовании, экономически выгоден и может быть промышленно применен в научно-исследовательских институтах и ветеринарных лабораториях.

Способ предназначен для дифференциальной диагностики репродуктивно-респираторного синдрома свиней от клинически сходных заболеваний. Способ осуществляется путем выявления специфических антител гистохимическим вариантом иммуноферментного анализа. Для этого используют стабильную культуру клеток MARC-145. Использование для фиксации этой культуры ацетона позволяет сделать дифференциальную диагностику репродуктивно-респираторного синдрома свиней безвредной. Способ обеспечивает удешевление производства диагностических наборов и их стандартизацию. 2 табл.

Способ дифференциальной диагностики репродуктивно-респираторного синдрома свиней от клинически сходных заболеваний путем выявления специфических антител гистохимическим вариантом иммуноферментного анализа, включающий использование культуры клеток, инфицированной вирусом репродуктивно-респираторного синдрома свиней, фиксацию данной культуры, инкубирование ее последовательно с исследуемыми сыворотками и антисвинными ПХ-иммуноглобулинами, обработку субстратом, отличающийся тем, что используют стандартную перевиваемую культуру клеток MARS-145, инфицированную вирусом репродуктивно-респираторного синдрома, которую фиксируют ацетоном, дифференцирую репродуктивно-респираторный синдром свиней от клинически сходных заболеваний при диагностическом титре 1 : 80 и выше.