ШТАММ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОК ПОЧКИ ПОРОСЕНКА SUS SCROFA PK-15/B5, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ Российский патент 2003 года по МПК C12N5/06 C12N7/00 

Изобретение относится к вирусологии, в частности к культивированию клеток и тканей с целью наработки и изучения вирусов.

Известна перевиваемая линия клеток почки поросенка РК-15, изолированная в 1957 году М. Harris из культуры клеток РК-2а почки взрослой свиньи Sus scrofa (АТСС, CCL 33) (1, 2).

Штамм перевиваемых клеток РК-15 из-за того, что его культивировали в лабораториях мира при нестандартных режимах и в различных по составу питательных средах, стал нестабильным по культуральным, морфологическим, цитогенетическим характеристикам и чувствительности к вирусу классической чумы свиней.

Целью изобретения является получение штамма перевиваемых клеток почки поросенка РК-15/В5, стабильного по биологическим характеристикам, пригодного для научно-исследовательской и диагностической работы, обладающего высокой чувствительностью к вирусу классической чумы свиней.

Штамм клеток РК-15/В5 получен из перевиваемой линии клеток почки поросенка РК-15 клонированием методом предельных разведении в питательной среде Игла MEM, содержащей 20% фетальной сыворотки крови телят, с отбором и селекцией высокочувствительного к вирусу классической чумы свиней и генетически однородного клона.

Штамм РК-15/В5 характеризуется следующими признаками.

Культуральные свойства. Жизненный цикл штамма, при котором сохраняются основные биологические показатели, составляет 50±5 пассажей. При посевной дозе - 100-120•10³ клеток/мл монослой формируется на 2-3 сутки культивирования и сохраняется без смены среды в течение 10-12 дней. Коэффициент пересева - 1:2-1:3.

Штамм РК-15/В5 культивируют в монослойных культурах в среде Игла MEM с 5% сыворотки крови новорожденных телят. Для диспергирования клеточного пласта при пересевах используют смесь 0,02% раствора версена и 0,25% раствора трипсина в соотношении 3:1 при температуре 37^oС. Урожай клеток с литрового матраса составляет 50-55 млн. клеток.

Для криоконсервирования при температуре -196^oС применяют смесь, состоящую из 70% среды Игла MEM, 20% сыворотки крови новорожденных телят и 10% диметилсульфоксида, при концентрации клеток 6-8•10⁶ в мл. Жизнеспособность клеток по тесту витального окрашивания трипановой синью после хранения в жидком азоте составляет 85-90%. Клетки восстанавливают исходные ростовые и морфологические свойства в течение 2-3 пассажей.

Создан банк рабочих клеток изготовителя (БРКИ) в количестве 250 млн. клеток. Клетки криоконсервированы в жидком азоте на уровне 5, 8, 11 и 18 пассажа во ВНИИВВиМ (регистрационный 2.10).

Морфологические признаки. Культура клеток представлена эпителиоподобными клетками средних размеров с мелкозернистой цитоплазмой и четко очерченными границами. Ядро округлой формы с 1-3 ядрышками.

Кариологическая характеристика. Популяция гипоплоидная. Варьирование хромосомных наборов от 27 до 33. Модальный класс (61%) составляют клетки, содержащие 31 хромосому. Маркерной хромосомой является большой метацентрик с разрывом.

Гистохимическим методом азосочетания (с использованием в качестве субстрата α-нафтилацетата) установлена высокая активность неспецифических эстераз.

Видовая идентичность подтверждена кариологическими методами.

Прививаемость изогенным животным отсутствует.

Контроль штамма PK-15/B5 на посторонние контаминанты. При обследовании клеток штамма РК-15/В5 на стерильность (наличие бактерий, грибов, микоплазм) получены отрицательные результаты.

Чувствительность к вирусам. Клетки штамма РК-15/В5 чувствительны к различным штаммам вируса классической чумы свиней (см. таблицу).

Штамм перевиваемых клеток РК-15/В5 может быть использован в вирусологических исследованиях для наработки и изучения вируса классической чумы свиней, а также в диагностических целях.

Штамм перевиваемых клеток почки поросенка sus scrofa РК-15/В5 депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических культур клеток сельскохозяйственных и промысловых животных Российской коллекции культур клеток при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии (СХЖ РАСХН) под 55.

Список литературы
1. Pirtle EC and Woods LK. Cytogenetic alterations in swine kidney cells persistenty infected with hog cholera virus and propagated with and without antiserum in the medium // Am. J. Vet. Res. 1968.29:153-164;
2. Armstrong J.A. et al. C-type virus particles in pig kidney cell lines // J. Genet. Virol. 1971. 10:195-198.

Изобретение относится к вирусологии, в частности к культивированию клеток и тканей для наработки и изучения вирусов. Штамм клеток РК-15/В5 получают путем клонирования линии клеток почки поросенка РК-15 методом предельных разведений и пассирования в среде Игла МЕМ с 5% фетальной сыворотки крови телят или сыворотки крови новорожденных телят. Кариотип стабилен на протяжении 50 пассажей. Модальный класс представлен клетками, содержащими 31 хромосому (61%). Культура клеток РК-15/В5 чувствительна к различным штаммам вируса классической чумы свиней и является тест-системой, используемой в диагностике и титровании вируса КЧС. Изобретение позволяет получить штамм перевиваемых клеток почки поросенка РК-15/В5, стабильный по биологическим характеристикам, пригодный для научно-исследовательской и диагностической работы. 1 табл.

Штамм перевиваемых клеток почки поросенка Sus scrofa РК-15/В5 депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических культур клеток сельскохозяйственных и промысловых животных Российской коллекции культур клеток при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии (СХЖ РАСХН) под 55, используемый для вирусологических исследований.