СПОСОБ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ДЕЗИНФЕКТАНТОВ И АНТИСЕПТИКОВ Российский патент 2002 года по МПК C12Q1/00 A61L2/16 

Изобретение относится к области медицины, в частности к микробиологии.

Известен качественный способ определения чувствительности (устойчивости) бактерий к дезинфектантам [1], при котором взвесями бактерий с плотностью 2х10⁹ КОЕ/мл контаминируют штифты штампа-репликатора и высушивают их в асептических условиях на воздухе при комнатной температуре. Затем осуществляют дезинфекцию штифтов в лунках штампа-репликатора, в которые внесен тестируемый раствор дезинфектанта. После 10-минутной экспозиции в дезинфектанте штифты переносят в лунки штампа-репликатора, заполненные нейтрализатором, соответствующим тестируемому дезинфектанту, и выдерживают в нем 10 мин. Контроль обеспечивается использованием стерильной дистиллированной воды вместо дезинфектанта. По истечении времени экспозиции опытные и контрольные репликаторы извлекают из нейтрализатора и осуществляют посев-реплику на среду АГВ или другую бактериологическую среду на чашках Петри. Инкубируют 48 ч при 37^oС и учитывают наличие или отсутствие роста бактерий в зонах посевов-отпечатков, считая культуру устойчивой к тест-раствору дезинфектанта при наличии роста в зонах.

Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, является количественный способ [2], при котором 8,0 мл тестируемого раствора смешивают с 1,0 мл микробной тест-суспензией плотностью 10⁸ КОЕ/мл и 1,0 мл воды; активность препарата определяют для экспозиции 5 мин ±10 с, а также для двух дополнительных экспозиций в пределах 1-60 мин. Непосредственно перед окончанием очередной экспозиции зараженный раствор перемешивают, отбирают 1,0 мл микста и переносят в пробирку, содержащую 8,0 мл нейтрализатора и 1,0 мл воды; вновь перемешивают и оставляют на 5 мин для инактивации, после чего делают десятикратное разведение и производят высев из смеси с нейтрализатором и из разведения - по 1,0 мл на чашки CSA (казеин-соевый агар), методом смешивания с расплавленным агаром или методом распределения по твердой среде; инкубируют при 36-37^oС в течение 42-48 ч, затем подсчитывают колонии на чашках и определяют количество микроорганизмов, выживших после воздействия дезинфектанта или антисептика; при этом КОЕ не менее 300 считают удовлетворяющим требованиям.

Однако известный способ достаточно трудоемок для выполнения скрининговых испытаний дезинфектантов и антисептиков, осуществляется в два этапа, предусматривает дополнительное титрование микста. При выполнении данного теста неизбежен значительный расход нейтрализующей смеси и ее компонентов. Кроме того, практика применения методов оценки дезинфекционных средств и антисептиков показывает, что необходимо обеспечить выполнение требования не только искусственной нейтрализации активного вещества, но и предусмотреть факт дополнительной естественной нейтрализации с целью приближения исследования к практическим условиям использования дезинфектантов и антисептиков, когда в качестве естественных нейтрализаторов выступают органические загрязнения или субстраты.

В предлагаемом способе авторы стремились упростить технику исполнения теста, приблизить условия испытания к условиям практического использования, а также снизить расход компонентов искусственной нейтрализующей смеси.

Сущность настоящего способа состоит в том, что используют цилиндры из инертного материала (дюраль или иной материал, не влияющий каким-либо образом на результат испытания) для создания временного микрорезервуара непосредственно на поверхности плотной питательной среды с добавлением естественного нейтрализатора (например, крови) и вносят в цилиндры раствор дезинфектанта (или антисептика) и инокулюм, для приготовления которого используют референс или госпитальные штаммы микроорганизмов. По истечении необходимого периода взаимодействия часть микста удаляют, а оставшееся количество дезинфектанта или антисептика инактивируется искусственным концентрированным нейтрализатором, после чего удаляют цилиндр, а содержавшаяся в нем жидкость распределяется по поверхности агара при помощи стерильного шпателя. Эффективность действия дезинфектанта или антисептика оценивается по коэффициенту редукции (Кред), указывающему на порядок снижения микробного числа в результате обработки инокулюма дезинфектантом или антисептиком, выражаемому в log₁₀, который исчисляют после подсчета колоний, выросших на чашках по окончании периода инкубации и сравнения с контролем. При этом Кред, требуемый для дезинфектантов, составляет 5,0 и более; для антисептиков - от 1,0 до 5,0 [3].

Таким образом, предлагаемый способ отличается от известного использованием цилиндров в качестве микрорезервуаров; использованием плотной питательной среды с добавлением естественного нейтрализатора (например, крови) в качестве подложки под цилиндр и обеспечением учета фактора взаимодействия дезинфектанта или антисептика с органическим субстратом уже с момента внесения в цилиндр (приближение к практическим условиям использования). Снижение расхода нейтрализующей смеси достигается приготовлением концентрированной композиции, при этом концентрация увеличивается в 10 раз по сравнению с нейтрализаторами в известных способах, и использованием только 0,2 мл концентрата при сохранении пропорций для обеспечения полной нейтрализации дезинфектанта или антисептика. Упрощение способа достигается сокращением количества манипуляций и переводом двухэтапного процесса - в одноэтапный.

Эти отличия позволяют сделать вывод о соответствии заявляемого способа критерию "новизна". Признаки, отличающие заявляемое решение от прототипа, не выявлены в других методах при изучении данной и смежных областей медицины и, следовательно, обеспечивают заявляемому решению соответствие критерию "существенные отличия".

Пример 1. Предлагаемый способ оценки эффективности дезинфектантов и антисептиков реализуется следующим образом. В день испытания дезинфектанта или антисептика готовят его раствор на дистиллированной стерильной воде согласно инструкциям к средству. Инокулюм приготовляют, суспендируя в физиологическом растворе колонии тест штамма, снятые с агара, контролируя плотность суспензии по стандарту мутности 0,5 McFarland 1,5х10⁸ КОЕ/мл).

На поверхность 5% Кровяного агара в центр чашки Петри устанавливают подготовленные стерильные цилиндры из дюраля (или иного инертного материала, не влияющего каким-либо образом на результат исследования) с внутренней емкостью около 2,0 см³. Высота цилиндра должна обеспечивать возможность закрытия чашки Петри крышкой на период взаимодействия дезинфектанта или антисептика с инокулюмом, а также на период нейтрализации. В установленные цилиндры вносят последовательно раствор дезинфектанта (или антисептика) в количестве 0,9 мл и инокулюм, в количестве 0,1 мл. Время контакта обусловливается инструкцией к препарату. По истечении периода экспозиции из цилиндра стерильной пипеткой отбирают 0,7 мл микста и сливают в обеззараживающий раствор, а к оставшимся 0,3 мл микста добавляют 0,2 мл концентрированной нейтрализующей смеси и оставляют для инактивации на 5 мин. При этом используют нейтрализующую смесь следующего состава:
Твин 80 - 3,0 г
Цистеин - 0,1 г
Гистидин - 0,1 г
Сапонин - 3,0 г
Буфер М/15 - 10,0 мл
Стерилизация - 121^oС 15 мин
По окончании указанного времени при помощи стерильного пинцета удаляют цилиндр и помещают его в раствор для обеззараживания, а жидкость, излившуюся из цилиндра, распределяют по поверхности агара при помощи стерильного шпателя. Для статистической достоверности на один образец препарата следует брать не менее трех чашек с цилиндром. Для контроля выполняют все, как описано выше, но вместо дезинфектанта используют стерильную дистиллированную воду.

Чашки, засеянным описанным способом, помещают в термостат и инкубируют в течение 48 ч при температуре 35^oС. Эффективность действия дезинфектанта или антисептика оценивают путем подсчета колоний (КОЕ), выросших на чашках в течение периода инкубации. Полученные результаты подсчета КОЕ (N) сравнивают с таковыми в контроле (N₀) и исчисляют коэффициент снижения микробного числа, или редукции (Кред), преобразуя разность в log₁₀, в соответствии с формулой:
Кред=LgN₀ - LgN (1).

При этом требуемый Кред для дезинфектантов составляет 5,0 и более; для антисептиков - от 1,0 до 5,0 [3].

Результаты испытаний некоторых препаратов приведены в табл. 1.

При использовании в известных способах нейтрализующей смеси аналогичного состава, но обычной концентрации (Твин 80 3%, сапонин 3%, гистидин 0,1%, цистеин 0,1%) на исследование 10 образцов в отношении одной тест-культуры расходуется 80,0 мл нейтрализующей смеси, а в предлагаемом способе при удовлетворении тем же требованиям статистики - 6,0 мл концентрированной, что соответствует 60,0 мл обычной нейтрализующей смеси и составляет 75%.

ПРИМЕР 2. Для подтверждения влияния на результат присутствия в питательной среде органического субстрата, в данном случае, крови, провели параллельные испытания с использованием мясопептонного агара (МПА) без добавления крови и с использованием кровяного 5% агара (КА). Результаты испытания (табл. 2) показывают, что в среднем коэффициенты редукции, полученные в первом случае, выше, чем во втором (р>0,05). Часть дезинфектанта или антисептика связывается с органическим субстратом (конкретно - с кровью) и активность антимикробного вещества несколько снижается аналогично тому, как это происходит в реальных условиях, что и отразилось на снижении значений Кред при использовании 5% КА, по сравнению с вариантом использования МПА, где такого связывания не происходит из-за отсутствия сравнимых количеств органического субстрата. Использование КА нивелирует разницу между лабораторными испытаниями и условиями реального использования.

Эффективность предлагаемого способа по сравнению с существующими обеспечивается следующими преимуществами.

1. Тестирование осуществляется в один этап, при этом снижается трудоемкость процесса исследования.

2. Использование 5% КА служит более реальной оценке эффективности, вследствие частичного связывания дезинфектанта или антисептика кровью во время экспозиции с инокулюмом и после распределения по поверхности агара подобно тому, как это происходит на практике.

3. Использование цилиндров в качестве микрорезервуаров и концентрированного нейтрализатора в количестве 0,2 мл позволяет снизить расход компонентов нейтрализующей смеси на 25%.

Источники информации
1. Гудкова Е. И. , Красильников А.П. Методика определения и показатели чувствительности (устойчивости) бактерий к дезинфектантам.//Клин. лаб. диагн. - 1994, 6, 48-50.

2. European Standart CEN/TC 216/HWG, N 46, E.C.7, Dec. 1992, Brussels.

3. Petri A. Antiseptische Wundbehandlung mit Polihexamid unter erschwerter hyginische Bеdingungen. Inauguraldissertation zur Erlagung den D.M. - Mainz. - 1994. - S. 83.

Изобретение относится к микробиологии. В способе используют цилиндры, установленные на плотную питательную среду, содержащую естественный нейтрализатор. Вносят в цилиндры исследуемый препарат и инокулюм. Экспозицию проводят 5 мин. Затем прибавляют искусственный нейтрализатор. После чего оценивают эффективность препаратов. Способ менее трудоемок и позволяет снизить расход компонентов, 2 табл.

Способ оценки эффективности дезинфектантов и антисептиков, включающий сравнение количеств колониеобразующих единиц микроорганизмов до и после воздействия на инокулюм дезинфектанта или антисептика, отличающийся тем, что воздействие на инокулюм дезинфектанта или антисептика проводят в цилиндре, помещенном на поверхность плотной питательной среды, содержащей естественный нейтрализатор, по истечении периода необходимой экспозиции в цилиндр вносят концентрированный искусственный нейтрализатор, через 5 мин цилиндр удаляют и исследуемую смесь распределяют по поверхности плотной питательной среды с последующей оценкой результатов.