СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ПРОЦЕССА У БОЛЬНЫХ УВЕИТАМИ Российский патент 2002 года по МПК G01N33/52 G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для исследования свободно-радикальных процессов в слезной жидкости как показателей свободно-радикального окисления в тканях глаза при обследовании больного и для обоснования выбора оптимальной тактики лечения с учетом состояния генерации активных форм кислорода, обоснования включения рекомендуемых в последнее время антиоксидантов в комплекс терапии, контроля эффективности проводимого лечения.

По современным представлениям одной из важнейших задач при клиническом обследовании больного увеитом различной этиологии является установление активности воспалительного процесса, так как это играет огромное значение в определении тактики лечения больного, необходимой для решения вопроса о возможности оперативного вмешательства для лечения осложнений и последствий увеита.

Прототипом предлагаемого нами способа определения активности воспалительного процесса у больных увеитами послужил метод, предложенный BenEzra D. с соавт. (BenEzra D., Forrester J.V., Nussenblatt R.B., Tabbara К., Timonen P. Uveitis scoring system. Berlin: Springer-Verlag, 1992; p. 1-9). Известный метод основан на определении активности воспалительного процесса клиническими приемами, основным из которых является непрямая бинокулярная офтальмоскопия. Данным способом оценивается степень помутнения оптических сред в баллах, степень клеточной реакции, наличие очагов на глазном дне, состояние сосудов глазного дна, макулы, диска зрительного нерва, на основании чего устанавливается активность воспалительного процесса. За основу взятой нами классификации активности увеита принята классификация Л.А.Кацнельсона, В.Э. Танковского (Л.А.Кацнельсон, В.Э.Танковский. Увеиты. (Клиника, лечение). М., 4-й филиал Воениздата. 1998. 208 с., С. 22-23), также базирующаяся на клинических характеристиках воспалительного процесса.

Технический результат предлагаемого изобретения - повышение точности диагностики, ее достоверности.

Метод основан на определении свободных радикалов - активных форм кислорода в слезной жидкости методом регистрации люминолзависимой хемилюминесценции, отражающей состояние свободно-радикального окисления в тканях глаза и его изменения в зависимости от активности воспалительного процесса и проводимого лечения.

Способ осуществляется следующим образом. Хемилюминесценцию изучают на приборе ХЛМ-003. Проверку стабильности работы установки проводят перед каждым измерением по излучению вторичного эталона СФХМ 1 (ГОСТ 9411-81). Интенсивность свечения контроля составила 5,1•10⁵ квантов/с. Для удобства эта величина принимается за одну условную единицу.

Готовят модельную систему, состоящую из фосфатного буфера (20 мМ КН₂РO₄, 105 мМ КС1, рН 7,5) с добавлением цитрата натрия (50 мМ) и люминола (10^-5 М). Данная модельная система состоит из физико-химически стабильных компонентов, поэтому не требуется ее приготовление перед каждым анализом заново, что существенно сокращает время исследования и повышает его достоверность.

Готовят раствор для исследования люминолзависимого свечения, который представляет собой смесь физиологического раствора 2 мл (рН 7,2) с люминолом (10^-5 М). Все приготовленные растворы стабильны, что позволяет существенно сократить время исследования и повысить его точность.

Стимулированную вдыханием паров 10% нашатырного спирта слезную жидкость в объеме 0,15 мл забирают канюлей из слезного озера и нижнего конъюнктивального свода, не касаясь конъюнктивы и роговицы, утром после пробуждения больного, чтобы исключить влияние на состав слезной жидкости гигиенических процедур, а также различных физических и психоэмоциональных факторов. Полученную слезную жидкость помещают в центрифужную пробирку и центрифугируют при 2000 об/мин 5 минут. Слезная жидкость разделяется на 2 фракции - надосадочную жидкость (супернатант) и осадок, которые затем исследуют раздельно.

Отбирают надосадочную жидкость в объеме 0,1 мл и определяют ее суммарную антиокислительную активность. Для этого 5 мл модельной системы цитрат-фосфат-люминол (с 0,1 мл физиологического раствора) помещают в термостатируемую кювету хемилюминомера ХЛМ-003, в которой поддерживается температура 37^oС. При постоянном перемешивании реакционной смеси вводят активатор окисления - 1 мл 10 мМ раствора сернокислого железа. Определяют светосумму люминесценции, характеризующую генерацию радикалов кислорода в реакции Гебера-Вайсса. Светосумму регистрируют за 5 минут измерения по площади под кривой записи. Показатели светосуммы модельной системы служат контролем. Супернатант слезной жидкости в объеме 0,1 мл помещают в модельную систему и в кювету хемилюминомера, после чего начинают процесс регистрации хемилюминесценции. При постоянном перемешивании вводят 1 мл 10 мМ раствора сернокислого железа и записывают в течение 5 минут хемилюминограмму. Интегральной величиной является светосумма свечения, которая отражает квантовый выход произошедших в модельной системе свободно-радикальных реакций. Полученные цифровые показатели светосуммы оценивают в процентах от контроля, что является численным выражением суммарной антиокислительной активности супернатанта. Чем выше суммарная антиокислительная активность супернатанта, тем в большей степени угнетается генерация свободных радикалов в модельной системе и тем меньше светосумма хемилюминесценции модельной системы.

Исследование осадка слезной жидкости объемом 0,05 мл заключается в следующем. Осадок ресуспендируют в 0,5 мл раствора для исследования люминолзависимого свечения, затем помещают в кювету, куда дополнительно добавляют еще 1,5 мл раствора для исследования люминолзависимого свечения. Кювету помещают в термостатируемую камеру хемилюминомера и в течение 5 минут регистрируют хемилюминесценцию. Записывают основные параметры хемилюминограммы - светосумму свечения, максимальную интенсивность свечения и величину спонтанного излучения. Учитывают основной, наиболее информативный показатель - светосумму свечения (светимость).

Весь процесс измерения хемилюминесценции и обработка результатов проводятся автоматически, что повышает точность и объективность полученной информации. Полученные данные обрабатываются специальной компьютерной программой и фиксируются в цифрах и графически на экране монитора.

Таким образом, методом регистрации люминолзависимой хемилюминесценции исследуются 2 фракции слезной жидкости - супернатант и осадок и определяются соответственно 2 группы показателей - суммарная антиокислительная активность супернатанта и светимость осадка. Данным методом обследовано 46 человек (15 здоровых и 31 больной увеитом). Осадок здоровых обладает минимальной светимостью 1,83±0,85 условных единиц и ниже. Светимость осадка слезной жидкости больных увеитами обусловлена наличием в нем свободных радикалов, вырабатываемых фагоцитирующими клетками, мигрирующими в слезу при воспалении.

Наоборот, супернатант слезной жидкости здоровых людей обладает антиокислительной активностью и при добавлении к модельной системе, в которой протекают реакции свободно-радикального окисления, приводит к уменьшению количества свободных радикалов и сопровождается соответственно уменьшением светосуммы свечения модельной системы. В среднем уменьшение светосуммы свечения модельной системы в присутствии супернатанта слезной жидкости здорового человека составляет более 50%. При увеитах светосумма свечения модельной системы в присутствии супернатанта слезной жидкости в процентах от контроля составляет менее 50%, что говорит о снижении суммарной антиокислительной активности супернатанта, которое связано с расходованием антиоксидантов слезы на утилизацию свободных радикалов. Анализ записей хемилюминесценции слезной жидкости 31 больного увеитом вкупе с клиническими данными позволил выделить основные параметры активности увеального воспаления.

Воспалительный процесс при увеитах расценивается как активный, если светимость осадка слезной жидкости превышает 8,75±3,91 условных единиц и суммарная антиокислительная активность супернатанта слезной жидкости менее 25%. Воспалительный процесс при увеитах субактивный, если светимость осадка составляет 8,75±3,91 - 1,83±0,85 условных единиц и суммарная антиокислительная активность супернатанта 50-25%. Воспалительный процесс при увеитах неактивный, если светимость осадка составляет 1,83±0,85 условных единиц и ниже и суммарная антиокислительная активность супернатанта слезной жидкости 50% и более.

На фигуре 1 представлена типичная запись хемилюминесценции модельной системы с 0,1 мл физиологического раствора (а - контроль) и в присутствии 0,1 мл супернатанта слезной жидкости с различной суммарной антиокислительной активностью (б - здорового человека, в - больного увеитом с субактивным воспалительным процессом, г - больного увеитом с активным воспалительным процессом).

На фигуре 2 представлена запись хемилюминесценции осадка слезной жидкости при увеитах с различной активностью воспалительного процесса (а - кривая записи хемилюминесценции здорового человека, б - больного увеитом с субактивным воспалительным процессом, в - больного увеитом с активным воспалительным процессом).

Пример 1. Больная Н., 17 лет, поступила с жалобами на снижение остроты зрения левого глаза. Из анамнеза известно, что пациентка больна ювенильным ревматоидным артритом. Острота зрения левого глаза при поступлении 0,04 не корригирует. Внутриглазное давление OS 22 mmHg. OS-значительная смешанная инъекция глазного яблока, на эндотелии роговицы пылевидные преципитаты, влага передней камеры опалесцирует, клеточная реакция во влаге 2-3 степени, задние стромальные синехии на 4-6 часах, помутнение и деструкция стекловидного тела. Глазное дно OS: диск зрительного нерва бледно-розовый, границы четкие. Вены среднего калибра, артерии извитые. На периферии глазного дна, больше в наружном секторе, мутный отек сетчатки. В общем анализе крови эритроциты 5,1•10¹², гемоглобин 103 г/л, лейкоциты 10,3•10⁹, сегментоядерные 81, лимфоциты 13, моноциты 2, скорость оседания эритроцитов 27 мм/ч. Гиперпродукция иммуноглобулинов всех классов, предельное количество ЦИК, высокие титры аутоантител к тканям сердца, соединительной ткани, печени, хрусталика.

Проведено исследование слезной жидкости. Стимулированная вдыханием паров 10% нашатырного спирта слезная жидкость забиралась из нижнего конъюнктивального свода, центрифугировалась. Методом регистрации люминолзависимой хемилюминесценции исследовалась светимость осадка и суммарная антиокислительная активность супернатанта. Осадок помещался в раствор для исследования люминолзависимой хемилюминесценции и записывалась светимость. Проводилась регистрация железоиндуцированной хемилюминесценции модельной системы с 0,1 мл физиологического раствора (контроль), затем - с 0,1 мл супернатанта, вычислялся процент светосуммы свечения модельной системы в присутствии супернтатанта от контроля. При исследовании слезной жидкости обнаружено следующее: светосумма свечения осадка составила 36,29 у.е., суммарная антиокислительная активность супернатанта менее 25%. Был выставлен диагноз: OS: Рецидивирующий периферический увеит, активный, ревматоидной этиологии. Проведена комплексная терапия с применением глюкокортикоидов местно и системно. После проведенного лечения процесс был купирован. Показатели хемилюминесценции слезной жидкости составили: светимость осадка 2,56 у.е., суммарная антиокислительная активность супернатанта 40%.

Пример 2. Пациент Л., 11 лет. Поступил с диагнозом OD: Подострый иридоциклит неясной этиологии, субактивный. Осложненная катаракта. Острота зрения OD 0,02 не корригирует, внутриглазное давление 17 mmHg. Цилиарная инъекция сосудов глазного яблока, пигментированные преципитаты различной давности, передняя камера средней глубины, влага опалесцирует, множественные задние синехии, зрачок неправильной формы, рисунок радужки стушеван, дисперсия пигмента. Хрусталик диффузно-мутный, глублежащие среды не офтальмоскопируются. При исследовании слезной жидкости обнаружено следующее: светосумма свечения осадка составила 6,13 у.е., суммарная антиокислительная активность супернатанта - 32%.

Существенным отличием предлагаемого метода исследования является то, что при определении активности воспалительного процесса при увеитах используется экспресс-метод хемилюминесцентного анализа, при котором определяется суммарная антиокислительная активность супернатанта слезной жидкости в стабильной модельной системе на цитрат-фосфатном буфере и светимость осадка слезной жидкости. Применение предлагаемого способа дает возможность точно определять степень активности воспалительного процесса у больных увеитами на основании показателей хемилюминесценции двух фракций слезной жидкости - осадка и супернатанта, что позволяет обоснованно и дифференцирование применять традиционные препараты для лечения увеитов и антиоксиданты, осуществлять контроль за течением заболевания и оценивать эффективность проводимого лечения. Определение активности воспалительного процесса методом исследования фракций слезной жидкости неинвазивно, не требует больших материальных затрат, просто в проведении. Все процессы регистрации протокола исследования производятся с помощью компьютерной обработки специальным пакетом программ без вмешательства персонала, что повышает точность исследования.

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для исследования свободно-радикальных процессов в слезной жидкости как показателей свободно-радикального окисления в тканях глаза. Способ обеспечивает повышение точности диагностики и ее достоверности. Регистрируют уровень люминол-зависимой хемилюминесценции осадка и супернатанта слезной жидкости. Для этого готовят раствор для исследования люминолзависимого свечения и стабильную модельную систему на цитрат-фосфатном буфере, регистрируют ее железоиндуцированную хемилюминесценцию, которая служит контролем. Полученную слезную жидкость разделяют путем центрифугирования на 2 фракции - супернатант и осадок. В растворе для исследования люминолзависимой хемилюминесценции определяют светимость осадка. В модельной системе в присутствии супернатанта определяют светосумму свечения и вычисляют в процентах от контроля суммарную антиокислительную активность супернатанта. При значениях светимости осадка более 8,75±3,91 условных единиц и суммарной антиокислительной активности супернатанта менее 25% воспалительный процесс определяют как активный, при значениях светимости осадка 8,75±3,91 - 1,83±0,85 усл. ед. и суммарной антиокислительной активности супернатанта 25-50% воспалительный процесс определяют как субактивный, при значениях светимости осадка 1,83±0,85 и менее усл. ед. и суммарной антиокислительной активности супернатанта 50% и более воспалительный процесс определяют как неактивный. 2 ил.

Способ определения активности воспалительного процесса у больных увеитами, отличающийся тем, что регистрируют уровень люминолзависимой хемилюминесценции осадка и супернатанта слезной жидкости, определяют светимость осадка и суммарную антиокислительную активность супернатанта, при этом определяют светосумму свечения железоиндуцированной хемилюминесценции стабильной модельной системы на цитрат-фосфатном буфере в присутствии супернатанта, вычисляют ее значение в процентах от контроля и при значениях светимости осадка более 8,75±3,91 усл. ед. и суммарной антиокислительной активности супернатанта менее 25% воспалительный процесс определяют как активный, при значениях светимости осадка 8,75±3,91-1,83±0,85 усл. ед. и суммарной антиокислительной активности супернатанта 25-50% воспалительный процесс определяют как субактивный, при значениях светимости осадка 1,83±0,85 и менее условных единиц и суммарной антиокислительной активности супернатанта 50% и более воспалительный процесс определяют как неактивный.