Способ экспресс-оценки витального красителя для контрастирования внутриглазных структур заднего сегмента глаза Российский патент 2018 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмохирургии, и может быть использовано для оценки качества и биологической безопасности витального красителя для контрастирования заднего сегмента глаза. Использование изобретения повышает достоверность получаемого результата при оценке качества исследуемого красителя в биологических жидкостях.

Хирургия макулярных разрывов должна быть атравматичной и при этом требует особой деликатности. Витальные красители стали неотъемлемой частью при операциях на заднем сегменте глаза, особенно при макулярной хирургии (макулярные разрывы, эпиретинальные мембраны, диабетический макулярный отек). Так, с целью улучшения результатов хирургического лечения, был разработан и предложен метод усиления визуализации интравитреальных и преретинальных мембран и структур сетчатки - хромовитрэктомия. Способность красителей улучшать визуализацию внутриглазных структур облегчает и повышает безопасность хирургического вмешательства с минимизацией травмирования нейроэпителия сетчатки глаза. Внедрение в витреоретинальную хирургию красителей обеспечило более точную идентификацию и безопасное удаление оптически полупрозрачных тканей с улучшением качества зрения после оперативных вмешательств.

Стремление витреоретинальных хирургов максимально повысить эффективность хирургического лечения привело к изучению и внедрению в практику совершенно новой технологии интраоперационного контрастирования тончайших структур заднего сегмента глаза с помощью красителей - хромовйтрэктомии. Красителями называют соединения, обладающие способностью поглощать и преобразовывать световую энергию в видимой и ближних ультрафиолетовой и инфракрасной областях спектра. Поглощая часть световых лучей определенной длины волны, эти соединения становятся «цветными». Использование красителей обеспечивает лучшую визуализацию интраокулярных структур во время операции, а также безопасное удаление оптически полупрозрачных кортикальных слоев, внутренней пограничной мембраны (ВПМ) и эпиретинальных мембран.

В то же время процессы свободаорадакального окисления играют важную роль в патологии заднего сегмента глаза. Сетчатка, являясь тканью с высоким парциальным напряжением кислорода (70 мм. рт.ст.), очень уязвима к оксидативному стрессу (Whitehead A.J., Mares J.A., Boulton М.Е. et al., 2006). Одним из важных критериев при использовании медицинских изделий в хирургии витреоретинальной патологии является биологическая инертность без усугубления оксидативного стресса.

В связи с этим для оценки качества и биологической активности раствора окрашивающего для офтальмохирургии на сегодняшний день используется методика железоиндуцированной хемилюминесценции полученного витального раствора, по которой оценивают состояние свободаорадикальных процессов и антиокислительной активности свободнорадикального окисления. Для этого проводят исследования по определению интенсивности реакции перекисного окисления липидов (ПОЛ) и активных форм кислорода (АФК) заявленного раствора в биологически активных веществах.

При оценке качества витального красителя регистрируют железоиндуцируемую хемилюминесценцию модельной системы, оценивают состояние свободаорадикальных процессов и антиокислительной активности (ОАО) окрашивающего раствора в модельных системах in vitro с использованием прибора «Хемилюминометр ХЛ-003».

Для этого исследуемый препарат разводят в физиологическом растворе так, чтобы концентрация была сопоставима с терапевтической дозой. Отбирают от 0,005 до 0,1 мл и добавляют в тест-системы, в которых ишийируют реакции свободно-радикального окисления (СРО) - образование активных форм кислорода и свободно-радикальное перекисное окисление липидов - процессы, наиболее часто встречающиеся в организме.

В качестве модельной системы для оценки состояния свободаорадикальных процессов и антиокислительной активности (ОАО) используют 20 мл фосфатного буфера (КН₂РО₄ - 20mM, KCl - 105 тМ), с цитратом (50 тМ) и люминолом (10^-5 М). Состав буфера: 2,72 г KH₂PO₄, 7,82 г KCL, цитрата натрия C₆H₈07N₃*5,5H₂O на 1 литр дистиллированной воды. Величину рН получаемого раствора доводят до заданной величины 7,45 ед. титрованием насыщенным раствором КОН и добавляют 0,2 мл маточного раствора люминола (10^-5 М). Образование АФК инициируют введением 1 мл 50 тМ раствора инициатора, сернокислого железа (FeSO₄7H₂O). Перед измерением свечения исследуемый объем помещают в светоизолированную камеру прибора и ведут запись хемилюминесценции (ХЛ) при комнатной температуре в течение 5 минут. В готовый буфер добавляют исследуемый раствор в зависимости от терапевтической дозы, свечение индуцируют добавлением раствора сернокислого железа.

Исследования проводят на хемилюминометре ХЛ -003, настроенном по программе: «Мешалка - быстро», «Термостат - выключен», «Время измерения - 5 минут». Прибор ХЛ-003 на дисплее компьютера выводит кривые записи хемилюминесценции, отражающие интенсивность процессов свечения изучаемого препарата, зависящую, в свою очередь, от скорости реакций свободнорадикального окисления липидов.

Данный способ известен из патента RU №2533216, G01N 33/48, G01N 33/52, опубл. 20.11.14. Это решение принято в качестве прототипа.

Данный известный способ как технический прием широко используется для оценки различных биологических растворов (RU 2278382, 2165620, 2192009).

Особенностью известного способа является то, что он позволяет определить светосумму и максимальную светимость при железоиндуцированной хемилюминесценции. Результаты средних значений светосуммы и максимальной интенсивности свечения позволяют определить амплитуду максимального свечения I мах. и интегральные параметры люминол-зависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ) в модельной системе и в индуцированной системе, свидетельствующие о подавлении генерации АФК. Данный способ позволяет установить присутствие в растворе антиоксидантных свойств.

Однако, данный способ оценки качества биологических растворов не позволяет выявить степень сохранения или длительности сохранения антиоксидантных свойств раствора в биологической среде.

Настоящее изобретение направлено на достижение технического результата, заключающегося в повышении точности оценки качества витальных красителей, в том числе обладающих про- и антиоксидантной активностью, по показателям перекисного окисления липидов.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе экспресс-оценки витального красителя для контрастирования внутриглазных структур заднего сегмента глаза, заключающемся в проведении сравнения железоиндуцированной хемилюминесценции модельной системы свободнорадикального окисления, содержащей фосфатный буфер, и той же модельной системы, в которую добавляют в терапевтических дозах исследуемый раствор витального красителя, в качестве модельной системы используют фосфатный буфер, включающий в себя дистиллированную воду, KH₂PO₄ и KCl, к которым добавлены цитрат натрия и люминол, при этом в полученный раствор с рН 7,45 ед. добавляют куриный желток, а исследуемый раствор витального красителя добавляют путем титрования в модельную систему в соотношении 1:5 для развития процесса хемилюминесценции, по интенсивности которого судят о процессах перекисного окисления липидов, сходных по составу к лип идам крови, а о сохранности или времени сохранения антиоксидантных свойств раствора витального красителя в биологической среде судят по уменьшению медленной вспышки при добавлении раствора витального красителя в модельную систему, содержащую липиды куриного желтка.

Указанные признаки являются существенными и взаимосвязаны с образованием устойчивой совокупности существенных признаков, достаточной для получения требуемого технического результата.

Настоящее изобретение поясняется конкретными примерами исследований, которые наглядно демонстрируют возможность достижения требуемого технического результата.

На фиг. 1 - представлена графическая запись хемилюминесценции раствора окрашивающего для офтальмологической хирургии по ТУ 9393-019-29792921-2015 (ЗАО «Оптимедсервис», Россия): 1- контроль (буферный раствор и инициатор ХЛ 1 мл сернокислое железо); 2,3,4,5, - к модельной Системе добавляли краситель по ТУ 9393-019-29792921-2015 (ЗАО «Оптимедсервис», Россия) в зависимости от терапевтической дозы исследуемого препарата - 2 - 0,005 мл, 3 - 0,01 мл, 4 - 0,05 мл, 5-0,1 мл;

фиг. 2 - представлена графическая запись ХЛ в модельной системе, генерирующей АФК, после добавления раствора окрашивающего для офтальмологической хирургии по по ТУ 9393-019-29792921-2015 (ЗАО «Оптимедсервис», Россия): 1 - контроль, 2 - 0,005 мл; 3 - 0,01 мл, 4 - 0,05 мл, 5 0,1 мл;

фиг. 3 - сравнительная характеристика витального красителя по ТУ 9393-019-29792921-2015 (ЗАО «Оптимедсервис», Россия): 1 - контроль, 2 - 0,05 мл витального красителя по ТУ 9393-019-29792921-2015 (ЗАО «Оптимедсервис», Россия), 3 - 0,01 мл витального красителя по ТУ 9393-019-29792921-2015 (ЗАО «Оптимедсервис», Россия), и витального красителя зарубежного производства: 4 -0,05 мл «Dorc», 5 - 0,1 мл "Dorc".

Согласно настоящего изобретения рассматривается новый способ экспресс-оценки витального красителя для контрастирования внутриглазных структур заднего сегмента глаза по показателям инертности и безопасности при сохранении про- и антиоксидантной активности.

Для проведения исследований был использован отечественный витальный краситель для контрастирования внутриглазных структур именно заднего сегмента глаза, который содержит следующие компоненты в следующем соотношении, на 1 мл раствора:

Краситель Trypan blue - 1,3 мг;

Краситель BBG - 0,2 мг;

Динатрий фосфат - 3,1 мг;

Дигидрофосфат натрия - 0,3 мг;

Натрий хлористый - 7,6 мг;

Полиэтиленгликоль (ПЭГ) - 20 мг;

Гиалуронат натрия - 3 мг;

Дистиллированная вода - до 1 мл.

Соотношения компонентов на 1 мл раствора получены в результате экспериментального подбора и протестированы испытаниями. Данный раствор витального красителя создан ЗАО «Оптимедсервис», Россия по ТУ 9393-019-29792921-2015.

Созданный раствор окрашивающий для офтальмологической хирургии на основе красителя Trypan blue обладает биологической инертностью, безопасностью и про и/или антиоксидантным действием, что позволит в дальнейшем расширить арсенал перспективной отечественной технологической платформы для витреоретинальной хирургии.

В связи с этим для оценки качества и биологической активности раствора окрашивающего для офтальмохирургии авторами была использована методика железоиндуцированной хемилюминесценции полученного раствора, по которой оценивают состояние свободаорадикальных процессов и антиокислительной активности свободнорадикального окисления. Для этого были проведены исследования по определению интенсивности реакции ПОЛ и АФК заявленного раствора в биологически активных веществах.

При оценке качества витального красителя регистрируют железоиндуцируемую хемилюминесценцию модельной системы, оценивают состояние свободаорадикальных процессов и антиокислительной активности (ОАО) окрашивающего раствора в модельных системах in vitro с использованием прибора «Хемилюминометр ХЛ-003». Для Определения сохранности антиокислительных свойств исследуемого раствора в биологической среде оценивают его влияние и на перекисное окисление липидов (ПОЛ).

Для этого исследуемый препарат разводят в физиологическом растворе так, чтобы концентрация была сопоставима с терапевтической дозой. Отбирают от 0,005 до 0,1 мл и добавляют в тест-системы, в которых инициируют реакции СРО -образование активных форм кислорода и свободно-радикальное перекисное окисление липидов - процессы, наиболее часто встречающиеся в организме.

В качестве первой модельной системы для оценки состояния свободаорадикальных процессов и антиокислительной активности (ОАО) используют 20 мл фосфатного буфера (KH₂PO₄ - 20 mM, KCl - 105 mM), с цитратом (50 mM) и люминолом (10^-5 М). Состав буфера: 2,72 г KH₂PO₄, 7,82 г KCL, цитрата натрия C₆H8O₇N₃*5,5H₂O на 1 литр дастиллированной воды. Величину рН получаемого раствора доводят до 7,45 ед. титрованием насыщенным раствором КОН и добавляют 0,2 мл маточного раствора люминола (10^-5 М). Образование АФК инициируют введением 1 мл 50 mM раствора сернокислого железа (FeSO₄7H₂O).

Перед измерением свечения исследуемый объем помещают в светоизолированную камеру прибора и ведут запись хемилюминесценции (ХЛ) при комнатной температуре в течение 5 минут. В готовый буфер добавляют витальный краситель в зависимости от терапевтической дозы, свечение индуцируют добавлением раствора сернокислого железа.

Исследования проводят на хемилюминометре ХЛ -003, настроенном по программе: «Мешалка - быстро», «Термостат - выключен», «Время измерения - 5 минут». Прибор ХЛ-003 на дисплее компьютера выводит кривые записи хемилюминесценции, отражающие интенсивность процессов свечения изучаемого препарата, зависящую, в свою очередь, от скорости реакций свободнорадикального окисления липидов.

А в качестве второй модели для оценки сохранности антиокислительных свойств исследуемого раствора в биологической среде и его влияния и на перекисное окисление липидов (ПОЛ) использовали ту же модельную систему с тем же фосфатным буфером и добавлением путем титрования в соотношении 1:5 куриного желтка и исследуемого препарата. Введение ионов железа в желтковую среду приводит к окислению ненасыщенных жирных кислот, входящих в состав липидов, развивается хемилюминесценция, по интенсивности которой судят о процессах перекисного окисления липидов (ПОЛ), сходными по составу к лип идам крови (Клебанов Г.И., 1988).

Помимо кинетических характеристик оценивают наиболее информативные параметры ХЛ: светосумму свечения по интенсивности излучения и амплитуду максимального свечения (I max). Интенсивность данных параметров модельной системы без добавления образцов принимают за 100%, проводили не менее 6 измерений в каждом объеме образца.

Изобретение иллюстрируется графиком на фиг. 1. где представлена запись хемилюминесценции отечественного витального красителя согласно настоящего изобретения: 1- контроль (буферный раствор и инициатор ХЛ 1 мл сернокислое железо); 2, 3, 4, 5, - к модельной системе добавляли краситель в зависимости от терапевтической дозы исследуемого препарата - 2 - 0,005 мл; 3 - 0,01 мл, 4 - 0,05 мл, 5 - 0,1 мл.

Определяли светосумму и максимальную светимость при железоиндуцированной хемилюминесценции. Результаты средних значений светосуммы и максимальной интенсивности свечения приведены в таблице 1 (показатели хемилюминесценции витальных красителей отечественного и зарубежного производства при комнатной температуре).

Из таблицы 1 видно, что под действием витального красителя согласно изобретения I мах. уменьшились интегральные параметры ЛЗХЛ в модельной системе - в 1,1 - 1,6 раза, в индуцированной - в среднем 1,4 раза, что свидетельствует о подавлении генерации АФК.

Антиоксидантные свойства витального красителя сохранялись и в биологической среде, что нашло отражение в уменьшении медленной вспышки при добавлении его в модельную систему, содержащую липиды куриного желтка (фиг. 2).

На представленных графических записях хемилюминесценции видно, как уменьшаются показатели медленной вспышки при добавлении в данную модельную систему витального красителя (фиг. 1), т.е. антиокислительные свойства препарата сохранялись и биологической среде (фиг. 2).

Антиоксидантный эффект был дозозависимым - с повышением концентрации красителя происходило пропорциональное снижение интенсивности хемилюминесценции.

Для экспресс-оценки витального красителя для контрастирования внутриглазных структур заднего сегмента глаза в части сохранения антиоксидантных свойств использовали схожую методику проведения железоиндуцированной хемилюминесценцию модельной системы свободнорадикального окисления, содержащей фосфатный буфер, и той же модельной системы, в которую добавляют в терапевтических дозах исследуемый раствор витального красителя.

В качестве модельной системы используют фосфатный буфер, включающий в себя дистиллированную воду, КН₂РО₄ и KCl, к которым добавлены цитрат натрия и люминол, при этом в полученный раствор с рН 7,45 ед. добавляют куриный желток, а исследуемый раствор витального красителя добавляют путем титрования в модельную систему в соотношении 1:5 для развития процесса хемилюминесценции, по интенсивности которого судят о процессах перекисного окисления липидов, сходных по составу к липидам крови, А о сохранности или времени сохранения антиоксидантных свойств раствора витального красителя в биологической среде судят по уменьшению медленной вспышки при добавлении раствора витального красителя в модельную систему, содержащую липиды куриного желтка.

Для оценки ПОЛ используют фосфатный буфер и добавляют путем титрования в соотношении 1:5 куриный желток и исследуемый препарат. Введение ионов железа в желтковую среду приводит к окислению ненасыщенных жирных кислот, входящих в состав липидов, развивается хемилюминесценция, по интенсивности которой судят о процессах перекисного окисления липидов (ПОЛ), сходными по составу к липидам крови (Клебанов Г.И., 1988).

В качестве контрольного сравнения использовали вышеуказанную методику для зарубежного аналога - Раствор окрашивающий для офтальмохирургии MembraneBlue Dual (D.O.R.C. mtemational, Нидерланды), зарегистрированный на территории РФ и разрешенный к применению в медицинской практике (№ФСЗ 2011/09078 от 24 февраля 2011 года). На фиг. 3 представлена сравнительная характеристика отечественного витального красителя в дозах 0,05 мл (кривая 2) и 0,01 (кривая 3) по отношению к кривой 1, принимаемой за 100% в части интенсивности этого параметра в модельной системе без добавления образцов.

Кривые 4 - 0,05 мл «Dork», 5-0,1 мл "Dork" показывают тот же параметр витального красителя зарубежного производства компании «Dork», Netherlands.

Оценка проводилась по параметрам светосуммы свечения и максимальной светимости по отношению к модельной системе. Как видно, отечественный раствор витального красителя для контрастирования внутриглазных структур заднего сегмента глаза обладает высокой контрастирующей эффективностью и высокой антиокислительной активностью, превышающей аналогичные параметры рекомендованных к применению зарубежных образцов. Данные параметры заявленного витального красителя прямо указывают на высокую безопасность витального раствора, обладающего про- и антиоксидантной активностью, за счет усиления биологической инертности, что приводит к уменьшению возможных побочных эффектов.

Собственные данные. Антиоксидантные свойства красителя сохранялись и в биологической среде, что нашло отражение в уменьшении медленной вспышки при добавлении его в модельную систему, содержащую липиды куриного желтка. Полученные данные свидетельствуют о высокой антиокислительной активности и позволяют на более высоком уровне оценивать длительность этой активности.

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмохирургии, и может быть использовано для экспресс-оценки витального красителя для контрастирования внутриглазных структур заднего сегмента глаза. Для этого проводят сравнение железоиндуцированной хемилюминесценции модельной системы свободнорадикального окисления, в которую добавляют в терапевтических дозах исследуемый раствор витального красителя. В качестве модельной системы используют фосфатный буфер, включающий дистиллированную воду, KH₂PO₄ и KCl, цитрат натрия и люминол. При этом в полученный раствор с рН 7,45 ед. добавляют куриный желток. Исследуемый раствор витального красителя добавляют путем титрования в модельную систему в соотношении 1:5 для развития процесса хемилюминесценции. По интенсивности хемилюминесценции судят о процессах перекисного окисления липидов, сходных по составу к липидам крови. О сохранности или времени сохранения антиоксидантных свойств раствора витального красителя в биологической среде судят по уменьшению медленной вспышки при добавлении раствора витального красителя в модельную систему, содержащую липиды куриного желтка. Изобретение позволяет повысить точность оценки качества витальных красителей, в том числе обладающих прооксидантной и антиоксидантной активностью, по показателям перекисного окисления липидов. 1 табл., 3 ил.

Способ экспресс-оценки витального красителя для контрастирования внутриглазных структур заднего сегмента глаза, заключающийся в проведении сравнения железоиндуцированной хемилюминесценции модельной системы свободнорадикального окисления, содержащей фосфатный буфер, и той же модельной системы, в которую добавляют в терапевтических дозах исследуемый раствор витального красителя, отличающийся тем, что в качестве модельной системы используют фосфатный буфер, включающий в себя дистиллированную воду, KH₂PO₄ и KCl, к которым добавлены цитрат натрия и люминол, при этом в полученный раствор с рН 7,45 ед. добавляют куриный желток, а исследуемый раствор витального красителя добавляют путем титрования в модельную систему в соотношении 1:5 для развития процесса хемилюминесценции, по интенсивности которого судят о процессах перекисного окисления липидов, сходных по составу к липидам крови, а о сохранности или времени сохранения антиоксидантных свойств раствора витального красителя в биологической среде судят по уменьшению медленной вспышки при добавлении раствора витального красителя в модельную систему, содержащую липиды куриного желтка.