СПОСОБ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ОЧИСТКИ СТОЧНЫХ ВОД ПРОМЫШЛЕННЫХ ПРЕДПРИЯТИЙ ОТ ИОНОВ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ: ЦИНКА, КАДМИЯ И СВИНЦА Российский патент 2003 года по МПК C02F3/34 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к вопросам охраны окружающей среды и гигиены и может быть использовано в процессах санации сточных вод от тяжелых металлов и, как следствие, в предотвращении загрязнения открытых водоемов этими токсикантами.

Изобретение предназначено для использования в работе очистных сооружений и биологических прудах очистки.

Тяжелые металлы всегда присутствуют в биосфере. Небольшие количества многих из них необходимы для нормальной жизнедеятельности организмов. В водных бассейнах в результате антропогенного воздействия содержание отдельных металлов непрерывно возрастает. Одним из источников загрязнения водоемов, приводящих к ухудшению качества воды и нарушающих условия обитания в них гидробионтов, являются сточные воды заводов, содержащих разбавленные растворы тяжелых металлов, состав которых чрезвычайно разнообразен.

По токсичности тяжелые металлы располагаются в следующей последовательности: ртуть, серебро, медь, кадмий, цинк, свинец, хром, никель, кобальт (Авакян, 1967 [1]; Эрлих, 1981 [2]).

Тяжелые металлы подавляют жизнедеятельность всех высших и низших организмов: блокируют ферментные системы, нарушают целостность клеточных стенок.

По данным Marier и Takino (1981 [3]) для зоопланктона и рыб токсичны концентрации (мг/дм³): Cu - 0,05-0,09; Pb - 0,05-0,1; Ni - 0,03-0,04; Zn - 0,06-0,3; Al - 0,2-1,49; Cd - 0,02-0,03. Большую опасность представляет способность гидробионтов аккумулировать в своем организме высокие концентрации отдельных металлов. Их ионы, попадая по трофической цепи в организм человека, могут вызвать аллергические заболевания, бронхиальную астму и энфизему легких, нарушение генеративных функций и окислительно-восстановительных процессов, новообразования.

Несмотря на то, что микробиологическая трансформация и детоксикация отдельных металлов и их соединений уже достаточно полно изучена, биологическая очистка от них промышленных сточных вод находится в стадии разработок и становления (Яковлев и др., 1974 [4]; Романенко и др., 1976 [5]; Ворр L.H., 1980 [6]; Юровская, 1984 [7]).

В настоящее время очистка стоков от тяжелых металлов проводится химическими, физическими и электрохимическими способами. Она дорога, громоздка и не всегда обеспечивается высокая степень очистки. В последние годы ведущая роль в процессах очистки принадлежит биологической, а главную роль в ней занимают микроорганизмы, особенно бактерии.

В проблеме чистой воды одним из перспективных направлений является использование природных факторов самоочищения и особое место в сохранении чистой природной воды занимают родококки.

Алканотрофные родококки, выделенные из разных природных субстратов (почвы, подземных и поверхностных вод, воздуха, снега, донных отложений и глубинных пород), контрастных эколого-географических зон (Ившина, 1982 [8]; Goodfellow, 1989 [9] ), обладают высоким потенциалом, а поэтому становятся все более значительным объектом возможного их промышленного использования.

Способность родококков метаболизировать широкий спектр органических полютантов и синтезировать такие полезные соединения, как сурфактониты, флокулянты, аминокислоты, полимеры, обуславливает перспективность их использования в различных областях биотехнологии и охраны окружающей среды (Самсонова, Слизень, 1989 [10]; Слизень и др., 1989 [11]; Bekhi et al., 1993 [12]; 1994 [13]; Mulbry, 1994 [14]).

Около 80 патентов с использованием родококков в очистке от углеводородов разного рода приводится в списках последних трех лет Всемирного патентного индекса (Derwent Patent Citation Index (DPCI), Derwent Information Ltd., London, UK). Многими исследователями отмечена высокая устойчивость алканотрофных родококков к неблагоприятным и даже экстремальным условиям окружающей среды, таким как пониженная температура и давление кислорода, недостаток питательных субстратов, повышенная соленость, присутствие в среде ингибиторов и антибиотиков (Ившина и др., 1981 [15]; Милько и др., 1991 [16]; Коронелли и др., 1994 [17]).

О способности родококков аккумулировать металлы из загрязненных естественных мест обитания отмечается в работах Tomioka et al., (1994 [18]). В предложенном Tomioko et al. (1994 [18]) способе извлечения металла цезия, автор использует виды Rhodococcus erythropolis CS 98 и Rhodococcus sp. strain CS 402. В работе Пешкур (2000 [19]) решаются задачи по подбору оптимальных условий эффективного извлечения цезия с учетом температуры, рН, источника углерода, соотношения ионов К⁺ и Cs⁺ в среде культивирования. В предложенной работе дана оценка возможности использования родококков для биоаккумуляции цезия. Подобраны оптимальные условия эффективного извлечения цезия с учетом этих условий.

Объектом исследования служили штаммы, принадлежащие к различным видам Rhodococcus (R.) из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов под ред. Ившиной [20] (R. fascians, R. erythropolis, R. "longus" и R. ruber). О способности к биоаккумуляции Cs⁺ судили по степени исчезновения ионов цезия из культуральной жидкости. Автор предлагает наиболее активные биоаккумуляторы Cs⁺, штаммы R. erythropolis ИЭГС АС 270 (R. fascians ИЭГМ АС 173, R. "longus" (ИЭГМ AC 32, ИЭГМ AC 69) и R. ruber ИЭГМ AC 326. В данном способе все отобранные штаммы предлагаются как биоаккумуляторы цезия. Именно опыт использования этих микроорганизмов свидетельствует о перспективности включения родококков в очистку от тяжелых металлов, так как в настоящее время это одна из наиболее актуальных биотехнологических проблем. Этот способ и взят нами за прототип.

Однако существенным недостатком предлагаемого автором метода является очень узкое деструктивное действие избранных видов (только по отношению к цезию), в то время как известно, что в загрязняющих воду и почву промышленных стоках отмечается большое разнообразие полютантов. Все это и заставляет искать микроорганизмы с более широкими возможностями биоаккумуляции металлов, в целях их использования в обеззараживании водоемов и почв, загрязненных разными металлами одновременно. А исходя из все возрастающего загрязнения природных водоемов такими металлами, как Zn, Cd и Pb, являющихся высокотоксичными компонентами природной среды, весьма актуальным является поиск микроорганизмов, обладающих широким спектром аккумулятивного действия по отношению к ним.

Новизной заявляемого способа является то, что биологическим объектом, используемым для очистки пресных водоемов от тяжелых металлов, предлагаются виды родококков, обладающие способностью эффективно извлекать из сточных вод Cd, Zn, Pb одновременно.

Существенным отличием предлагаемого способа является то, что используют бактериальную смесь родококков, состоящую из R. ruber (ИЭГМ АС 219; ИЭГМ АС 220; ИЭГМ АС 221; ИЭГМ АС 222; ИЭГМ АС 338; ИЭГМ АС 347).

Предлагаемое техническое решение применяется впервые в биотехнологической очистке промышленных сточных вод, так как в качестве биологических факторов очистки предлагается микробиологическое сообщество родококков, обладающих большим функциональным разнообразием и целым комплексом стратегических возможностей к биоаккумуляции разного спектра тяжелых металлов.

Методика выращивания Rhodococcus ruber, используемых для очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов: Zn, Cd, Pb.

1. На первом этапе выращивается суточная культура R. ruber на 1,5% мясо-пептонном агаре (МПА) без тяжелых металлов.

2. Затем взвесь выращенной культуры объемом 1 мл (исходной оптической плотности D₅₄₀=0,6 при 37^oС и длине оптического пути 10 мм на спектрофотометре СФ-46) добавляли в автоклавированную смесь Киевской среды, содержащей, г/дм³: MgSO₄•7H₂O - 0,2; K₂HPO₄ - 1,0; KNO₃ - 1,0; КН₂РO₄ - 1,0; NaCl - 1,0; СаСl₂•Н₂O - 0,02; FеСl₃ - 0,001 и ацетата аммония в качестве источника углерода и энергии в концентрации 2 г/дм³ (см. Пешкур, 2000 [19]). В эту среду добавляли также соли металлов: ацетат Cd, ацетат Zn, ацетат Pb (в подборе соли исходили из того, что они хорошо растворимы в водной среде, а ацетат являлся дополнительным источником питания для родококков). Концентрации солей металлов (в мг/дм³) брали для кадмия в пределах 0,3-2,5; для цинка 0,5-2,5 и для свинца 0,5-2,5, что соответствовало максимальным концентрациям тяжелых металлов (Zn, Cd, Pb) в водоемах. В контроле брали Киевскую среду, ацетат аммония в концентрации 2 г/дм³ и взвесь культуры родококков (1 мл).

С целью обеспечения оптимальных условий для жизнедеятельности бактерий рекомендовано выращивать их в стеклянных колбах Эрленмейера емкостью 250 мл, содержащих по 100 мл питательной среды, на орбитальных шейкерах (130 об/мин) при температуре 25-28^oC.

Из приготовленных автоклавированных растворов без взвеси культуры берется 50 мл раствора на анализ исходного содержания металла.

3. Из опытных колб (т. е. культура + металл) и контроля делали контрольный посев на 1,5% МПА, с целью учета исходного содержания родококков (общее микробное число, ОМЧ_исх).

4. Опытные колбы культивировали при температуре 25-27^oС в течение 72 ч, а через 72 ч отфильтровывали 50 мл культуральной жидкости через биофильтр с целью удаления микробной массы, а фильтрат анализировали на содержание тяжелых металлов с помощью атомно-адсорбционного спектрофотометра типа ASSlN.

5. О способности родококков к биоаккумуляции исследуемых металлов судили по степени исчезновения иона металла из культуральной жидкости.

6. Одновременно в процессе 72-часового культивирования проводили контроль состояния микрофлоры путем высева культуральной взвеси на 1,5% МПА ОМЧ_исх в нулевой точке отсчета и затем через 18, 24, 48 и 72 ч.

В лабораторных условиях нами были оптимизированы условия выращивания отобранных культур для их использования в очистке сточных вод.

Оптимальными условиями, при которых происходит интенсивное (от 49 до 70%) извлечение металлов Zn, Cd, Pb из среды, оказались следующие: температура 25-28^oС; рН 7,8-8,0; источник углерода ацетат аммония; присутствие металлов (Pb, Zn или Cd) в концентрации от 0,29 до 2,47 мг/дм³. По полученным данным наиболее активными биоаккумуляторами Zn, Pb и Cd являются коллекционные штаммы R. ruber (ИЭГМ АС 219, ИЭГМ АС 220, ИЭГМ АС 221, ИЭГМ АС 222, ИЭГМ АС 338, ИЭГМ АС 347).

В заявляемом способе обезвреживания промышленных стоков от Zn, Cd и Pb используется бактериальная смесь родококков, состоящая из R. ruber (ИЭГМ АС 221, ИЭГМ АС 222, ИЭГМ АС 347, ИЭГМ АС 219, ИЭГМ АС 220, ИЭГМ АС 338).

Создание предлагаемого способа стало возможным благодаря следующим моментам - из 12 штаммов родококков 6 штаммов были способны аккумулировать металлы:
1. Rhodococcus ruber ИЭГМ АС 219 обладает способностью аккумулировать Zn, Cd.

2. Rhodococcus ruber ИЭГМ АС 220 обладает способностью аккумулировать Cd.

3. Rhodococcus ruber ИЭГМ AC 221 по нашим данным обладает способностью аккумулировать Zn.

4. Rhodococcus ruber ИЭГМ АС 222 обладает способностью аккумулировать Рb и Cd.

5. Rhodococcus ruber ИЭГМ AC 338 обладает способностью аккумулировать Рb и Cd.

6. Rhodococcus ruber ИЭГМ АС 347 обладает способностью аккумулировать Zn, Рb.

Опытное обоснование факта микробиологической очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов смесью родококков представлено в таблице 1. В качестве иллюстрации предлагаются примеры.

Пример 1
В колбу помещали сточную воду, содержащую тяжелые металлы в концентрации (мг/дм³): Zn - 1,81; Cd - 0,3; Pb - 0,91 и ацетат аммония в концентрации 2 г/л, а затем в нее добавляли культуру Rhodococcus ruber ИЭГМ АС 219. Проведенный анализ после 72-часового культивирования этого штамма в сточной воде, содержащей тяжелые металлы, показал, что в ней концентрации этих металлов снизились до (мг/дм³): Zn - 0,54; Cd - 0,08, то есть концентрация цинка уменьшилась в 3,4 раза, кадмия в 3,6 раза, концентрация свинца не изменилась.

Пример 2
В сточную воду, содержащую следующие концентрации металлов в (мг/дм³): Zn - 0,5; Cd - 2,4, внесли культуру Rhodococcus ruber ИЭГМ АС 220 и ацетат аммония в концентрации 2 г/л, анализ содержания металлов через 72 ч показал, что концентрации металлов стали в (мг/дм³): Zn - 0,5; Cd - 0,72 (концентрация кадмия уменьшилась в 3,3 раза).

Пример 3
Микроорганизмы Rhodococcus ruber ИЭГМ АС 221 вносили в сточную воду, содержащую тяжелые металлы в (мг/дм³): Zn - 1,03; Cd - 1,38 и ацетат аммония в концентрации 2 г/л, через 72 ч содержание цинка снизилось в 2,5 раза (до 0,4), а содержание кадмия уменьшилось до 1,03 мг/дм³.

Пример 4
К сточной воде содержащей тяжелые металлы в (мг/дм³): Zn - 2,3; Cd - 2,0 и Pb - 1,07, добавлен Rhodococcus ruber ИЭГМ AC 347 и ацетат аммония в концентрации 2 г/л, после 72-часового культивирования концентрации металлов снизились у цинка в 3,3 раза, у свинца в 3,1 раза.

Пример 5
К сточной воде, содержащей тяжелые металлы в (мг/дм³): Zn - 1,4; Pb - 1,8; Cd - 2,02, внесли культуры Rhodococcus ruber (ИЭГМ AC 219, ИЭГМ AC 220, ИЭГМ AC 221, ИЭГМ AC 222, ИЭГМ АС 338, ИЭГМ АС 347). Анализ содержания металлов через 72 ч показал, что концентрации металлов стали в (мг/дм³): Zn - 0,56, Pb - 0,9; Cd - 1,18, то есть концентрация цинка уменьшилась в 2,5 раза, концентрация свинца в 2 раза, а кадмия в 1,7 раза (см. чертеж).

Анализ опытов, в которых в бактериальную смесь для очистки было введено разное количество предлагаемых культур родококков, показал, что соотношение взятых в смесь сообществ родококков не существенно, так как при разных вариациях количественных соотношений этих культур в смеси процент убыли металла был сравнительно одинаков.

Пример 6
В две колбы разливали сточную воду с содержанием металлов в ней (мг/дм³): Zn - 1,5; Pb - 2,0; Cd - 2,5. Затем в одну колбу вносили смесь сообщества культур родококков в следующих соотношениях: ИЭГМ АС 219 - 5 мл; ИЭГМ АС 220 - 10 мл; ИЭГМ АС 221 - 5 мл; ИЭГМ АС 222 - 5 мл; ИЭГМ АС 338 - 10 мл; ИЭГМ АС 347 - 10 мл.

Во вторую колбу эти же культуры вносились в ином соотношении: ИЭГМ АС 219 - 10 мл; ИЭГМ АС 220 - 5 мл; ИЭГМ АС 221 - 10 мл; ИЭГМ АС 222 - 10 мл; ИЭГМ АС 338 - 5 мл; ИЭГМ АС 347 - 5 мл. Анализ содержания металлов через 72 ч показал, что убыль в содержании металлов в обеих колбах сравним (табл. 2).

Не следует опасаться того, что микрофлора бытовых стоков, поступающая в составе сточных вод, может подавить развитие родококков, так как обычная сапрофитная микрофлора не обладает устойчивостью к высоким концентрациям тяжелых металлов и быстро гибнет.

Отличительным свойством предлагаемых штаммов родококков является их высокая активность к аккумуляции Zn, Cd, Pb, а также способность развиваться на широком спектре углеводородов.

Процесс очистки может осуществляться непрерывно в ходе работы биореакторов.

Отобранные культуры Rhodococcus ruber (ИЭГМ АС 219, ИЭГМ AC 220, ИЭГМ AC 221, ИЭГМ AC 222, ИЭГМ АС 338, ИЭГМ АС 347), предварительно выращенные в лаборатории по предложенной методике, вносятся в биореактор вместе с активным илом, в который поступают промышленные стоки. В качестве дополнительного источника питания добавляется небольшое количество углеводородов, содержащих компоненты, пригодные для питания используемых бактерий, но лишенные токсических веществ. Кроме того, широкий спектр углеводородов, поступающих со сточными водами, также является источником питания для развития этих микроорганизмов, так как родококки представляют собой организмы, способные использовать в качестве источника углерода широкий спектр органических веществ. Поэтому смешивание промышленных сточных вод, содержащих тяжелые металлы с бытовыми стоками, содержащими органические вещества, оказывает стимулирующее влияние на развитие этих микроорганизмов, поскольку они могут использовать в качестве энергии и питания разнообразные органические соединения, а также аккумулировать тяжелые металлы.

Литература
1. Авакян З.А. Сравнительная токсичность тяжелых металлов для некоторых микроорганизмов // Микробиология.- 1967.- 36, 6. - С.446-450.

2. Эрлих X. Жизнь микробов в присутствии тяжелых металлов, мышьяка и сурьмы // Жизнь микробов в экстремальных условиях. - М.:[Б.и.], 1981.- С. 440-465.

3. Maier M. , Takino M. Avaliaczo Toxicologica de metals em aquars ars represadas do sudeste de Sao-Paulo, Brasil // Biol. Gnst. pesca. - 8.-P. 119-129.

4. Яковлев С.В., Кузьмичева В.А., Кореньков В.Н. Биохимическая очистка сточных вод, содержащих соединения шестивалентного хрома // Водоснабжение и сан. техника. - 1974. - 5. - С.7-10.

5. А. с. 521234 СССР, МКИ⁵ С 02 F 3/00. Способ биологической очистки сточных вод // В. И. Романенко, С.И. Кузнецов, В.Н. Кореньков. - Опубл. в 1976, Бюл. 26.

6. Ворр L.H., Ehrilich H.L. Enzymatik reduction of Cr⁶⁺ by a strain Pseudomonas fluorescens // Abstr. Meet. Amer. Soc. Microbiol. - Washington: D. C., 1980. - P. 212-216.

7. Юровская Е.М. Микробиологическая очистка промышленных сточных вод. - Киев // Здоровье, 1984. - 160 с.

8. Ившина И.Б. Биология бактерий рода Rhodococcus, усваивающих пропан и н-бутан. Дисс....канд. - Киев, 1982. - 215 с.

9. Goodfellow M. Genus Rhodococcus // Bergey' s Manual of Systematic Bacteriology. / Edit. : J.G. Holt. - Baltimore etc.: Williams and Wilkins Company, 1989. - Vol. 4. - 2648 p.

10. Самсонова А. С., Слизень З.Б. Утилизация диметилтерефталата Rhodococcus erythropolis // Докл. АН БССР. 1989. - Т. 33, 5. - С.467-470.

11. Слизень З. Б. , Зименко Т.Г., Самсонова А.С. Утилизация диметилтерефталата Rhodococcus erythropolis // Микробиология. - 1989. - Т. 58, вып.3. - С.382-386.

12. Bekhi R.M., Topp E.E., Dick W., Germon P. Metabolism of the herbicide atrazine by Rhodococcus strains // Appl. Env. Microbiol. - 1993. -Vol. 59.-P. 1955-1959.

13. Bekhi R.M., Topp E.E., Blackwell B.A. Ring hydroxylation of N-methylcarbamate insecticides by Rhodococcus TE1 // J. Agric. Food Chem. - 1994. - Vol. 42. - P. 1375-1378.

14. Mulbry W. W. Purification and characterization of an inducible S-triazine hydrolase from Rhodococcus corralinus NRRL B-1554R // Appl. Env. Microbiol. - 1994. - Vol. 60. - P. 613-618.

15. Ившина И. Б., Оборин А.А., Нестеренко О.А., Касумова С.А. Бактерии рода Rhodococcus грунтовых вод района нефтяных месторождений Пермского Предуралья // Микробиология. - 1981. - Т.50, вып.4.-С.709-717.

16. Милько Е.С., Егоров Н.С. Гетерогенность популяций бактерий и процесс диссоциации (корине- и нокардиоподобные бактерии). - М.: Изд-во МГУ, 1991. - 144 с.

17. Коронелли Т.В., Дермичева С.Г., Ильинский В.В., Комарова Т.И., Поршнева О. В. Видовая структура углеводородокисляющих бактериоценозов водных экосистем разных климатических зон // Микробиология. - 1981. - Т.50, вып.1. - С.167-170.

18. Tomioka N., Uchiyama H., Yagi О. Cesium accumulation and growth characteristics of Rhodococcus erythropolis CS98 and Rhodococcus sp. strain CS402 // Appl. Env. Microbiol. - 1994. - Vol. 14, 2. - P. 283-290.

19. Прототип. Пешкур Т.А. Оптимальные условия эффективного извлечения цезия бактериями рода Rhodococcus // Сб. Охрана природы и здоровья человека. - Оренбург, 2000. - С.50-52.

20. Каталог штаммов региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов. // Под ред. И.Б. Ившиной. Ин-т экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН. - М.: Наука, - 1994. - 163 с.

Изобретение относится к вопросам охраны окружающей среды (водоемов) и может быть использовано в биотехнологической очистке промышленных стоков, загрязненных тяжелыми металлами. Способ заключается в том, что очистки стоков от тяжелых металлов используют бактериальную смесь микроорганизмов, состоящую из штаммов Rhodococcus ruber (ИЭГМ АС 219; ИЭГМ АС 220; ИЭГМ АС 221; ИЭГМ АС 222; (ИЭГМ АС 338; ИЭГМ АС 347). Бактериальная смесь обладает большим функциональным разнообразием и целым комплексом стратегических возможностей к биоаккумуляции разного спектра ионов тяжелых металлов. 2 табл., 1 ил.

Способ микробиологической очистки промышленных сточных вод от ионов тяжелых металлов: цинка, кадмия и свинца путем использования в качестве микробиологических факторов очистки штаммов родококков, отличающийся тем, что используют бактериальную смесь родококков, состоящую из штаммов Rhodococcus ruber (ИЭГМ АС 219; ИЭГМ АС 220; ИЭГМ АС 221; ИЭГМ АС 222; (ИЭГМ АС 338; ИЭГМ АС 347).