СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ САПРОБНОСТИ ВОДЫ ПРЕСНЫХ ВОДОЕМОВ Российский патент 1998 года по МПК C12Q1/04 G01N33/18 

Изобретение относится к микробиологии, в частности к гигиене и санитарии пресных водоемов, и может быть использовано при проведении санитарно-микробиологического анализа воды в системе мониторинговых работ по санитарно-гигиенической оценке пресных водоемов.

Сапробность - комплекс физиолого-биохимических свойств организма, обуславливающий его способность обитать в воде с тем или иным содержанием органических веществ, т.е. с той или иной степенью загрязнения. Сапробностью оценивается загрязненность вод органическими веществами [1].

Сапробы или сапробионты - растения и животные, обитающие в водах, в той или иной степени загрязненных органическими веществами. Способность сапробов минерализовать органические вещества загрязнений используется для усиления процессов самоочищения вод, особенно сточных.

Известен способ оценки самоочищающей способности водоемов [2], заключающийся в определении соотношения лактозопозитивных кишечных палочек (ЛКП), фекальных кишечных палочек (ФКП) с такими санитарно-химическими показателями, как биологическое потребление кислорода с использованием соотношения БПК₅/БПК_полн.. При этом степень интенсивности самоочищения определяется по расчетной гигиенической шкале самоочищения.

Наиболее близким к заявляемому способу по совокупности существенных признаков является способ определения степени сапробности воды с использованием индикаторных биологических объектов, в частности микроводорослей или ракообразных [3]. В зависимости от степени загрязненности водоемы или их зоны подразделяются на ксено- (X), олиго- (o), β- мезо- (b), α- мезо- (a) и поли- (p) сапробные с динамикой индекса сапробности от 0 до 5,0 (менее 0,5 для ксеносапробных, 0,5-1,5 для олигосапробных, 1,6-2,5 для β- мезосапробных, 2,6-3,5 для α- мезосапробных, 3,6-более 4,0 для полисапробных).

При осуществлении этого способа определяют количество сапробных видов фито- или зоофлоры и рассчитывают индекс сапробности воды (S) по формуле

где
S - значение показателя сапробности отдельных организмов (справочные значения);
h - относительная частота встречаемости видов.

Расчетный индекс сапробности воды (S) показывает степень сапробности анализируемой воды, т.е. ее чистоту и самоочищающую способность.

Однако в известном способе степень сапробности водоема оценивается по максимальному количеству организмов, обнаруживаемых в водоеме, что существенно затрудняет работу лаборанта и удлиняет сроки получения результата. Продолжительность анализа длится от 7-10 дней до 1 месяца.

Заявляемый способ решает задачу ускорения и упрощения определения степени сапробности воды пресноводных водоемов.

Для решения указанной задачи в заявляемом способе определения степени сапробности воды пресных водоемов, включающем микробиологическое выделение водорослей, определение их показателя сапробности, расчет индекса сапробности воды и суждение по его величине о степени сапробности водоема, у выделенных микроводорослей определяют лизоцимную и антилизоцимную активность (ЛА и АЛА соответственно), затем определяют показатель сапробности каждого вида, обладающего указанными признаками, вычисляют среднее значение показателя сапробности и по его величине судят о степени сапробности водоема.

Новым в заявляемом способе является то, что у выделенных микроводорослей определяют ЛА и АЛА, затем определяют показатель сапробности каждого вида, обладающего указанными признаками, вычисляют среднее значение их показателя сапробности и по его величине судят о степени сапробности водоема.

Достигаемый при осуществлении изобретения технический результат состоит в том, что предложенный способ определения сапробности воды пресных водоемов обеспечивает упрощение и ускорение получения результатов за счет сокращения количества операций при определении индекса сапробности водоема и использования физиологических характеристик микроводорослей - их лизоцимной и антилизоцимной активности. Таким образом, новый способ сужает исследования по определению степени сапробности воды до уровня лизоцим- антилизоцимной части альгосообщества и сокращает продолжительность исследований по определению индекса сапробности воды в 5 раз.

Разработка заявляемого способа стала возможной после определения ряда моментов:
1. Преимущество водорослей для определения сапробности воды несомненно, т. к. для многих уже известны их показатели сапробности, что не сделано для бактериальной флоры. Для определения показателей сапробности отдельных микроводорослей существуют различные таблицы. В частности, авторы пользовались табличными значениями, указанными в справочнике "Водоросли" авторов Вассера, Кондратьевой и др. [4].

2. У водорослей в отличие от зоопланктеров, у которых бывают науплиальные и копеподные стадии (не имеющие показателя сапробности), всегда регистрируются вегетативные формы, у которых возможно установление их видовой принадлежности и показателя сапробности.

3. В ходе проведенных исследований авторами было выявлено, что для водных объектов с поли- и α- мезосапробными типами воды характерно преобладание антилизоцимных (АЛА) форм водорослей тогда, как водные объекты с β- мезо- и олигосапробным состоянием характеризовались преобладанием среди альгофлоры лизоцимактивных (ЛА) культур.

4. Экологическими факторами, определяющими ход биологических процессов в водоеме, являются температура и pH, поэтому было проведено экспериментально-натурное изучение их воздействия на лизоцим- антилизоцимные взаимоотношения водорослей.

В процессе изменения температурного режима искусственного водоема авторами было установлено, что при переходе сообщества из зоны низких температур с 4^oC (соответствующих зимнему минимуму) до 25^oC (летний максимум) происходило изменение качественных показателей водорослей. При температурах, соответствующих летнему режиму 21 - 25^oC, у водорослей проявлялась максимальная физиологическая активность (АЛА 3 мкг/мл; ЛА 0,97 мкг/мл), которая была принята за 100%. При охлаждении воды до 4^oC лизоцимная и антилизоцимная активности снижались до минимальных значений, такое состояние альгоценоза наблюдалось в промежутке от 4 до 10^oC. При температурах от 11 до 20^oC и от 26 до 30^oC наблюдалось изменение активности водорослей, проявляющееся в снижении ЛА на 42-56%, что составляло (0,52 ± 0,03) мкг/мл, и АЛА на 33%, количественное выражение которой составило 2 мкг/мл.

Таким образом, количественные и качественные показатели в лизоцимном сообществе при температуре 21 - 25^oC достигали максимальных значений, обеспечивая текущие процессы самоочищения водоемов, при повышении температуры до 30^oC, что обычно имеет место при тепловых загрязнениях водоемов в случае сброса в них термальных вод с ТЭС и ГРЭС, наблюдались сдвиги в альгосообществе в сторону увеличения антилизоцимактивных форм и как следствие ухудшение качества процессов самоочищения водоемов.

Известно, что при поступлении различных токсикантов и ксенобиотиков в водоем прежде всего изменяется водородный показатель (pH) воды. Поэтому мы проследили возможное влияние сдвига pH на лизоцим- антилизоцимные взаимодействия водорослей.

Авторами проведены исследования по изучению влияния различных значений pH на водорослевую компоненту водоемов. Результаты исследований сведены в диаграмму (см. чертеж), на которой показана динамика проявления лизоцимного и антилизоцимного признаков у водорослей при различных значениях pH.

Как видно из представленных на диаграмме данных, при контрольно-пограничном значении pH-5,0, когда состояние экосистемы характеризовалось как критическое, у водорослей утрачивалась способность проявлять лизоцимную и антилизоцимную активность. Одновременно нами не было зарегистрировано значительных изменений в численности и видовом составе биоценоза. Это позволило рассматривать отсутствие антилизоцимной и лизоцимной активности у исследуемых водорослей как ранний признак наступающих глубоких и необратимых изменений в сообществе.

По полученным результатам проведенных исследований значения pH от 6,2 до 8,0 являются оптимальными для жизнедеятельности водорослей в условиях открытых водоемов. При pH от 8,4 и более происходит активация антилизоцимактивных водорослей при отсутствии лизоцимной активности, что служит диагностическим признаком сдвига pH в водоемах и начинающихся необратимых изменений в них. Вероятно, это можно рассматривать в качестве раннего показателя наступающих глубоких и необратимых изменений в сообществе. Таким образом, возникающие сдвиги в лизоцим- антилизоцимном сообществе альгоценоза при воздействии изменяющихся температур или сдвига pH могут быть ранними диагностическими признаками снижения процесса самоочищения водоемов.

5. Проведенные натурные исследования на реке Урал в зонах с удовлетворительной степенью чистоты воды и с β- мезосапробным состоянием (точка открытого городского водозабора) и с загрязненной водой с α--мезосапробным состоянием (точка сброса вод с городских очистных сооружений) выявили следующее:
- в точке водозабора выделено 204 вида микроводорослей, из которых 58 относились к индикаторным по сапробности видам (индекс сапробности воды в соответствии со способом-прототипом составил 2,15). В процессе исследования в описанной точке реки были выявлены 10 индикаторных по сапробности видов водорослей, обладающих лизоцимным и антилизоцимным признаками. Учитывая, что лизоцим- антилизоцимные взаимоотношения обеспечивают функционирование водных биоценозов, мы определили показатель сапробности каждого из выделенных 10 видов по имеющимся таблицам [4] и вычислили среднее значение показателя их сапробности, составившее 2,15. Полученное значение соответствовало β- мезосапробному состоянию водоема с удовлетворительной степенью чистоты воды и полностью совпадало с аналогичным показателем, рассчитанным с помощью способа-прототипа;
- в точке сброса с городских очистных сооружений выделено 42 индикаторных по сапробности вида водорослей из 180 культур. Индекс сапробности воды, определенный способом-прототипом, составил 2,75.

В лизоцим- антилизоцимной части альгоценоза было выделено 6 индикаторных по сапробности видов водорослей. Их средний показатель сапробности составил 2,70, соответствуя α- мезосапробному состоянию исследуемой зоны водоема с загрязненным качеством воды.

Таким образом, сравнение полученных индексов сапробности воды, рассчитанных по водорослевому биоценозу, с использованием полного массива выделенных водорослей (способом-прототипом) и у части альгоценоза, обладающей лизоцимной и антилизоцимной активностями, выявило совпадение результатов. Это позволило сузить исследования до уровня лизоцим- антилизоцимной части альгосообщества и сократить продолжительность исследований по определению индекса сапробности воды в два-пять раз.

Известны методики определения лизоцимной и антилизоцимной активности микроорганизмов [5, 6]. Лизоцимная активность у микроводорослей определялась по известной методике [6].

В работе с альгокультурами для изучения их антилизоцимной активности нами была модифицирована известная методика [5], заключающаяся в посеве исследуемых бактерий "пятачками" на поверхность питательного агара, содержащего лизоцим, с последующей обработкой выросших посевов парами хлороформа и заливкой вторым слоем агара, смешанного с индикаторной на лизоцим тест-культурой Micrococcus lysodeikticus. Учет антилизоцимной активности производят по наличию зон стимуляции роста микрококка вокруг выросших "пятачками" исследуемых культур. Степень проявления антилизоцимной активности оценивают по наибольшей концентрации лизоцима, инактивированного исследуемым штаммом и выражают в мкг/мл.

Нами были внесены следующие изменения:
- во-первых, был изменен температурный режим культивирования, т.к. для водорослей оптимальной является температура 23 - 25^oC;
- во-вторых, был увеличен срок инкубации в термостате до 3 суток, т.к., по известным данным, выделение белков из клеток водорослей лишь начинается после 24 ч инкубации, а достигает максимума к 48 ч;
- в-третьих, мы отказались от обработки исследуемых культур хлороформом, так как макроколонии микроводорослей достаточно плотно прилегали к питательной среде и не распространялись по всей поверхности чашки при покрытии их вторым слоем питательного агара.

Таким образом, модифицированная методика определения антилизоцимной активности у водорослей заключается в посеве концентрированной аксеничной водорослевой суспензии (объемом 200 - 300 кл/мл) на поверхность 1,5%-ного питательного агара, содержащего лизоцим в различных концентрациях, с последующей 2-, 3-суточной инкубацией в термостате при 23 - 25^oC и заливкой индикаторной на лизоцим тест-системой (0,7%-ным питательным агаром, смешанным с микрококком). Учет результатов производится по наибольшей концентрации лизоцима, инактивированного исследуемыми водорослевыми культурами в пересчете на мкг/мл.

Способ осуществляется следующим образом.

Отобранные из исследуемого водоема пробы воды в объеме 0,5 л фильтруются с помощью фильтра Зейтца через мембранные фильтры фирмы "Сынпор" с диаметром пор 0,40 мкм.

Фильтры с осажденными на них микроводорослевыми клетками помещаются на застывшую в чашках Петри поверхность 1,5%-ного питательного агара. Определяют у выделенных микроводорослей лизоцимную и антилизоцимную активность.

Для определения лизоцимной активности питательный агар содержит 0,5•10⁹ KOE/мл тест-культуры Micrococcus lysodeikticus. Для определения антилизоцимной активности в питательную среду добавляют 0,2•10^-4-0,4•10^-4 мг/мл раствора яичного лизоцима и 0,5•10⁹ KOE/мл культуры Micrococcus lysodeikticus, чашки Петри с посевами помещаются в термостат. После 48-72-часовой инкубации при 25^oC фильтры с выросшими на них колониями водорослей снимают. На поверхности питательной среды учитывают проецирующиеся под ними зоны стимуляции роста микрококка (в случае проявления антилизоцимной активности) и зоны лизиса тест-культуры (в случае проявления лизоцимной активности). Водоросли, проявившие лизоцимную или антилизоцимную активности, смывают с поверхности фильтров, микроскопируют и идентифицируют по морфологическим свойствам.

У идентифицированных водорослей по специальным таблицам определяют их показатель сапробности, вычисляют среднее значение их показателя сапробности и по его величине судят о степени сапробности водоема.

Пример конкретного выполнения заявляемого способа.

Авторами были взяты пробы из исследуемых пресных водоемов: реки Сакмары (водоем с чистой водой), реки Каргалки (водоем со средней степенью загрязнения воды), реки Черной (водоем с сильно загрязненной водой) и проведены определения степени сапробности данных водоемов. Результаты исследования приведены в таблице.

Как видно из таблицы, для реки Сакмары с удовлетворительной степенью чистоты воды и с β--мезосапробным состоянием было характерно преобладание в альгоценозах лизоцимактивных видов водорослей. Всего выделен 131 вид водорослей, из них индикаторных по сапробности 45 (11 олиго-, 29 -β- мезосапробных и 5 -α- мезосапробных). Индекс сапробности, рассчитанный по способу-прототипу, был равен 1,75-2,08.

Среди водорослей, обладающих лизоцимным и антилизоцимным признаками, обнаружено 8 видов индикаторных по сапробности водорослей (таблица). Среднее значение показателя сапробности составило 1,96. Следовательно, индекс сапробности воды в р. Сакмаре, определенный с помощью предлагаемого способа, составил 1,96, что соответствовало удовлетворительной степени чистоты воды и β- мезосапробному состоянию водоема.

Река Каргалка характеризовалась как α-β- мезосапробная с загрязненным качеством воды. Для нее было характерно увеличение числа антилизоцимактивных форм в альгоценозе. Всего выделено 96 видов водорослей, из которых 39 были индикаторными по сапробности (8 олиго-, 17-β--мезосапробных и 14 -α- мезосапробных). Индекс сапробности, определенный в соответствии со способом-прототипом, был равен 2,52 - 2,56.

Среди водорослей, обладающих лизоцимным и антилизоцимным признаками обнаружено 8 видов, индикаторных по сапробности. Среднее значение их показателя сапробности составило 2,55. Следовательно, сапробность воды в р. Каргалка, определенная с помощью предлагаемого способа, составила 2,55, что соответствовало средней степени загрязненности воды и α-β- мезосапробному состоянию водоема.

Река Черная, получающая максимальное количество загрязнений антропогенного характера с водосборной площади, была отнесена к грязной. Вода в этом водоеме содержала незначительное количество растворенного кислорода. Всего было выделено 87 видов водорослей. Из них 32 индикаторных по сапробности (4 - олиго-; 11 -β- мезо-; 17 -α- мезосапробных). Сапробность воды, рассчитанная по способу-прототипу, составила 2,7 - 3,5.

Анализ проведенных исследований выявил преобладание среди водорослей антилизоцимактивных форм. Среди водорослей с антилизоцимным и лизоцимным признаками обнаружено 9 видов, индикаторных по сапробности. Среднее значение их показателя сапробности составило 3,5. Следовательно, сапробность воды в р. Черная, определенная с помощью предлагаемого способа, составила 3,5, что соответствовало сильной загрязненности воды и α--мезосапробному состоянию водоема.

Таким образом, предлагаемый способ определения сапробности воды пресноводных водоемов обеспечивает упрощение и ускорение получения результатов за счет сокращения количества операций при определении индекса сапробности водоема и использования физиологических характеристик микроводорослей - их лизоцимной и антилизоцимной активностей. Предлагаемый способ определения сапробности водоема прост и надежен в применении и может быть использован в полевых условиях при проведении мониторинговых работ по определению экологического состояния водоемов.

Источники информации
1. Кочемасова З.Н., Ефремова С.А., Рыбакова А.М. Санитарная микробиология и вирусология.- М.: Медицина, 1987, 352 с.

2. Плитман С.И. Комплексная оценка самоочищающей способности водоемов. Гиг. и санит. - 1991, N 3, с. 15 и 16.

3. Чурбанова Н.Н. Микробиология.- М.: Высшая школа, 1987, с. 156 - 166.

4. Вассер С.П., Кондратьев Н.В. и др. Водоросли. Справочник.- Киев: Наукова Думка, 1989, 608 с.

5. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Малышкин А.П., Немцева Н.В. Метод определения антилизоцимной активности микроорганизмов. ЖИЭИ.- 1984, N 2, с. 27 - 29.

6. Бухарин О.В., Васильев Н.В., Усвяцов Б.Я. Лизоцим микроорганизмов.- Томск, 1985, с. 17 - 27.

Изобретение относится к микробиологии, в частности к гигиене и санитарии пресных водоемов, и предназначено при проведении санитарно-микробиологического анализа воды в системе мониторинговых работ по санитарно-гигиенической оценке пресных водоeмов. Способ предусматривает микробиологическое выделение микроводорослей, определение у них лизоцимной (ЛА) и антилизоцимной (АЛА) активности и показателя сапробности каждого вида, обладающего указанными признаками. Рассчитывают индекс сапробности воды и судят по его величине о степени сапробности воды и водоема. Индекс сапробности воды вычисляют как среднее значение показателей сапробности микроводорослей, обладающих ЛА и АЛА. Способ сужает исследования по определению степени сапробности воды до уровня лизоцим - антилизоцимной части альгосообщества и сокращает продолжительность исследований по определению индекса сапробности воды. 1 табл., 1 ил.

Способ определения степени сапробности воды пресных водоемов, включающий микробиологическое выделение микроводорослей, определение их показателя сапробности, расчет индекса сапробности воды и суждение по его величине о степени сапробности водоема, отличающийся тем, что у выделенных водорослей определяют лизоцимную (ЛА) и антилизоцимную активность (АЛА), затем определяют показатель сапробности каждого вида, обладающего указанными признаками, вычисляют среднее значение их показателя сапробности и по его величине судят о степени сапробности водоема.