ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ПЕРВИЧНОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ Российский патент 2006 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в любых микробиологических лабораториях.

Идентификация энтеробактерий является сложной и дорогостоящей процедурой и основана на определении большого количества биохимических признаков [3].

Поэтому разработка способов упрощения этой процедуры является актуальной проблемой микробиологии. Ее решение снижает трудоемкость и стоимость микробиологических исследований, увеличивает производительность бактериологических лабораторий. Наиболее широко известным и распространенным способом решения данной проблемы является применение сред первичной дифференциации.

Целью использования сред первичной дифференциации является накопление чистой культуры и одновременное выявление некоторых свойств бактерий, что позволяет упростить процедуру дальнейшей идентификации за счет сужения круга подозреваемых микроорганизмов.

Среди сред данного назначения широко известна среда Олькеницкого, которая является аналогом предлагаемого изобретения. Среда содержит глюкозу, лактозу, сахарозу, мочевину, тиосульфат натрия, индикатор сероводорода (аммоний-железо (II) сульфат), феноловый красный и питательный агар. Это позволяет определить такие биохимические свойства бактерий как продукция сероводорода, ферментация глюкозы, лактозы, сахарозы и уреаза [1].

Однако использование среды Олькеницкого не позволяет дифференцировать между собой условно-патогенные энтеробактерии. С ее помощью можно решить только две задачи:

1. Отличить энтеробактерии от группы "неферментирующих грамотрицательных бактерий".

2. Исключить принадлежность выделенного штамма к роду Shigella или Salmonella.

Это обусловлено тем, что большинство видов условно-патогенных энтеробактерии, которые часто встречаются в клиническом материале, не различаются между собой по продукции сероводорода, а ферментация глюкозы характерна для всех видов энтеробактерий. В случае ферментации лактозы или сахарозы невозможно различить, какой из этих двух углеводов ферментирует исследуемый микроорганизм. Наличие у микроба уреазы также создает помеху для выявления ферментации углеводов [1].

По совокупности существенных признаков наиболее близкой к предлагаемому изобретению является среда Клиглера, которая взята авторами за прототип. Среда Клиглера получила наиболее широкое распространение в мировой практике. Эта среда имеет многочисленные модификации, но все они содержат в своем составе глюкозу, лактозу, тиосульфат натрия, индикатор сероводорода (аммоний-железо (II) сульфат, железо (II) сульфат и т.д.), феноловый красный, белковую питательную основу, агар-агар. Все модификации среды Клиглера позволяют определить продукцию сероводорода, ферментацию глюкозы и лактозы [1]. В отличие от среды Олькеницкого среда Клиглера обеспечивает беспрепятственное выявление биохимических свойств бактерий. Использование среды Клиглера позволяет решить те же задачи, что и среда Олькеницкого. Дифференцировать между собой условно-патогенные энтеробактерии среда Клиглера также не позволяет. Причиной данной проблемы является то, что большинство видов условно-патогенных энтеробактерий, часто встречаемых в клиническом материале, не различаются между собой по продукции сероводорода, а по ферментации глюкозы среди всех видов энтеробактерии нет различий. Ферментация лактозы для многих видов (например, Е. coli) является вариабельным признаком.

Известно, что частота встречаемости различных видов условно-патогенных энтеробактерий в клиническом материале существенно различается. Среди данной группы микроорганизмов наиболее часто высевается Е. coli: на ее долю приходится более 75% штаммов, выделяемых из кишечника, более 70% культур, выделяемых из мочи и более 60% - из другого клинического материала.

Использование среды Клиглера не позволяет идентифицировать Е. coli. Возможность идентификации Е. coli появляется при сочетании прототипа со средой Симмонса [1], (культура отсевается в пробирку со средой Клиглера и одновременно - в другую пробирку со средой Симмонса), но данная комбинация позволяет идентифицировать до вида только лактозоположительные штаммы Е. coli (на их долю приходится около 80% всех штаммов кишечной палочки). Точность идентификации Е. coli при этом оказывается недостаточной, т.к. часть штаммов Е. agglomerans по способности ферментировать глюкозу, лактозу, образовывать сероводород и ассимилировать цитрат на среде Симмонса не отличаются от Е. coli. [2]

Для более точной дифференциации Е. coli от Е. agglomerans разумно использовать дополнительный тест определения продукции индола, который можно выявить на среде Клиглера [1].

Однако на среде Клиглера данный признак обнаруживается не достоверно. Причиной этого является высокая концентрация углеводов (в частности, лактозы). В результате ферментации углеводов снижается рН, до уровня, ингибирующего продукцию индола. Снизить концентрацию лактозы в среде Клиглера нельзя, т.к. это приведет к невозможности отличить ее ферментацию от ферментации глюкозы.

Поэтому новизной предлагаемого изобретения является питательная среда, позволяющая накопить чистую культуру грамотрицательных бактерий и одновременно определить у них такие биохимические свойства как ферментация маннита, образование сероводорода и продукция индола.

Существенным отличием питательной среды является то, что она содержит ГРМ-агар, пептон ферментативный, аммоний-железо (II) сульфат, натрия тиосульфат, феноловый красный и маннит при следующем количественном содержании компонентов (в граммах на 1 литр дистиллированной воды):

ГРМ-агар25-30Пептон ферментативный5-10Маннит1-2Аммоний-железо (II) сульфат0,19-0,21Натрия тиосульфат0,25-0,35Феноловый красный0,04-0,05

Замена глюкозы и лактозы на маннит привела к тому, что появилась возможность достоверного определения на заявляемой среде ферментации маннита и продукции индола. Это в свою очередь привело к тому, что при одновременном отсеве изолированной колонии на заявляемую среду и среду Симмонса стало возможным выявить набор биохимических признаков микроорганизмов, достаточный для идентификации до вида Е. coli с достоверностью 99%, причем идентифицировать стало возможно как лактозоположительные, так и лактозоотрицательные штаммы кишечной палочки. Кроме того, появилась возможность идентифицировать до вида также штаммы Р. mirabilis и Р. vulgaris (чертеж).

Таким образом, сопоставление заявляемой питательной среды с прототипом (среда Клиглера) показывает, что заявленная среда существенно отличается от известной тем, что вместо глюкозы и лактозы в своем составе содержит маннит в концентрации 1-2 г/л.

Маннит относится к углеводам. Многие виды энтеробактерий ферментируют его до образования кислоты или кислоты и газа. В данном диапазоне концентраций в результате ферментации микробом маннита образуется количество кислоты, достаточное для выявления ферментации этого углевода и не ингибирующее продукцию индола, поэтому ферментация маннита и продукция индола на заявляемой среде определяется достоверно (см. таблицу 3). В отличие от ферментации лактозы способность ферментировать маннит и образовывать индол является стабильными признаками для Е. coli и большинства других видов условно-патогенных энтеробактерий. Это и привело к увеличению точности идентификации Е. coli с 93% (при использовании прототипа) до 99%, а также появилась дополнительная возможность идентифицировать до вида штаммы Р. mirabilis и Р. vulgaris.

Т.к. на долю описанных выше видов грамотрицательных аэробных и факультативно аэробных бактерий приходится большинство культур, выделяемых из клинического материала, использование разработанной схемы позволяет значительно сократить потребность в использовании дорогостоящих тест-систем для идентификации микроорганизмов за счет того, что отпадает необходимость дальнейшей идентификации условно-патогенных энтеробактерий в значительном проценте случаев. Благодаря этому существенно снижается трудоемкость и стоимость процедуры.

Заявляемая питательная среда имеет следующее количественное соотношение компонентов (в граммах на литр дистиллированной воды):

ГРМ-агар25-30Пептон ферментативный5-10Маннит1-2Аммоний-железо (II) сульфат (Соль Мора)0,19-0,21Натрия тиосульфат0,25-0,35Феноловый красный0,04-0,05

Способ приготовления.

Соли и маннит предварительно растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Пептон растворяют в 900 мл дистиллированной воды, затем туда добавляют ГРМ-агар и растворяют при подогревании и помешивают. Затем все ингредиенты смешивают, фильтруют, добавляют индикатор, устанавливают рН 7,2-7,4 и стерилизуют при 112°С 30 минут. Разливают в пробирки и скашивают, оставляя столбик высотой 2,5-3 см. Готовая среда должна иметь нейтрально-красный или красно-оранжевый цвет.

Посев на заявляемую среду проводят по скошенной части в виде прямой линии, затем уколом в толщу агарового столбика и заканчивают по скошенной части агара штрихом. Над средой помещают индикаторную бумажку на индол.

Параллельно производится посев на среду Симмонса.

Биохимические признаки бактерий на заявляемой среде учитывают согласно таблице 1.

Таблица 1
Оценка биохимических реакций бактерий на заявляемой средеБиохимический тестПоложительная реакцияОтрицательная реакцияФерментация маннитаСтолбик желтого цветаСтолбик красного цветаОбразование H₂SЧерное облако в средеОтсутствие почернения средыПродукция индолаПокраснение индикаторной бумагиИндикаторная бумага не изменила цвет

Выявление свойств бактерий на среде Симмонса проводят согласно общепринятым рекомендациям [1].

Интерпретацию полученных результатов начинают с попытки идентифицировать культуру до вида с помощью набора признаков, выявленных на заявляемой среде и среде Симмонса (таблица 2).

Если набор признаков исследуемого штамма достаточен для идентификации с помощью данных, указанных в таблице 2, то дополнительные тесты не требуются. В остальных случаях идентификация культуры проводится классическим методом.

Таблица 2
Минимальный набор признаков, достаточный для идентификации до вида наиболее часто встречаемых условно-патогенных энтеробактерийПризнакВид микроорганизмаЦитратH₂SМаннитИндол--++Е. coli++--Р. mirabilis-+--Р. mirabilis +-+Р. vulgaris+++-С. freundi++++С. freundi

Примеры.

Для того чтобы обосновать выбранные концентрации ингредиентов в заявляемой питательной среде, было проведено определение биохимических свойств бактерий при разном количественном содержании компонентов.

Были приготовлены 16 вариантов заявляемой среды в различных количественных соотношениях компонентов. В 12 вариантах концентрация ни одного из компонентов заявляемой среды не выходила за пределы указанных в формуле настоящей заявки интервалов значений, но в каждом из вариантов концентрация одного из компонентов была на уровне верхней или нижней границы заявляемого интервала.

В 4 вариантах значения концентрации отдельных компонентов выходили за эти рамки.

Проверка правильности определения биохимических свойств на заявляемой среде была проведена с использованием набора культур энтеробактерий с заведомо известными биохимическими свойствами.

В качестве тест-культур было выбрано по 10 штаммов Е. coli, К. pneumoniae и Р. mirabilis. Результаты опыта представлены в таблице 3.

Таблица 3
Зависимость правильности выявления биохимических свойств энтеробактерий от количественного содержания компонентов заявляемой среды№ вариантаКоличественное содержание компонентов (г/л.)Правильность определения признакаМаннитПептонГРМ-агарСоль МораТищсульфат натрияФеноловый красныйФерментация маннитаОбразование индолаПродукция сероводорода10,57270,200,300,04570%100%100%21,07270,200,300,045100%100%100%31,53270,200,300,045100%80%100%41,55270,200,300,045100%100%100%51,57250,200,300,045100%100%100%61,57270,190,300,045100%100%100%71,57270,200,250,045100%100%100%81,57270,200,300,040100%100%100%91,57270,200,300,050100%100%100%101,57270,200,350,045100%100%100%111,57270,210,300,045100%100%100%121,57300,200,300,045100%100%100%131,510270,200,300,045100%100%100%141,515270,200,300,04590%100%100%152,07270,200,300,045100%100%100%163,07270,200,300,045100%70%100%

Как видно из таблицы 3, при снижении содержания маннита до 0,5 г/л наблюдались ложноотрицательные реакции определения ферментации маннита в 30% случаев.

Повышение концентрации пептона до 15 г/л приводила к появлению ложноотрицательных реакций определения ферментации маннита в 10% случаев.

Повышение концентрации маннита до 3 г/л способствовало затруднению выявления образования индола (30% ложноотрицательных реакций).

К похожему результату приводило снижение концентрации пептона до 3 г/л (20% ложноотрицательных реакций).

В вариантах, где концентрация ни одного из компонентов заявляемой среды не выходила за пределы указанных в формуле настоящей заявки интервалов значений, все биохимические свойства энтеробактерий определялись достоверно.

Поэтому было выбрано следующее количественное содержание компонентов среды: ГРМ-агар 25-30 г/л, пептон ферментативный 5-10 г/л, маннит 1-2 г/л, аммоний-железо (II) сульфат (Соль Мора) 0,19-0,21 г/л, натрия тиосульфат 0,25-0,35 г/л, феноловый красный 0,04-0,05 г/л.

Таким образом, использование заявляемой среды позволяет достоверно определить такие биохимические свойства бактерий, как ферментация маннита, образование сероводорода и продукция индола.

Для проверки точности идентификации энтеробактерий результаты, полученные с использованием заявляемой среды, сравнивались с данными классического метода. В случае, когда при использовании заявляемой среды культура идентифицировалась до вида, правильность ее идентификации проверялась классическим методом. Таким способом были проверены по 100 штаммов, идентифицированных как Е. coli, P. mirabilis, P. vulgaris, С. freundi и НГОБ.

Аналогичным образом была проверена точность идентификации энтеробактерий с использованием прототипа.

Результаты проверки представлены в таблице 4.

Таблица 4
Точность идентификации грамотрицательных условно-патогенных бактерий с использованием заявляемой питательной среды и прототипаПоказательзаявляемая средапрототипРТочность дифференциации энтеробактерий от группы "неферментирующих грамотрицательных бактерий", %.9999>0,05Точность идентификации до вида, %.Е. coli Л+9993<0,05Е. coli Л-98*<0,05Р. mirabilis95*<0,05Р. vulgaris90*<0,05С. freundi9999>0,05* идентификация до вида невозможна.

Из таблицы видно, что использование заявляемой питательной среды по сравнению с прототипом позволяет сократить частоту ошибок идентификации лактозоположительных штаммов Е. coli с 7% до 1%, т.е. в 7 раз. Кроме того, появляется возможность дополнительно идентифицировать до вида лактозоотрицательные штаммы Е. coli, P. mirabilis и Р. vulgaris.

Благодаря этому увеличивается доля штаммов, которые можно идентифицировать до вида при посеве различного биоматериала (таблица 5).

Таблица 5
Доля штаммов грамотрицательных условно-патогенных бактерий, которые можно идентифицировать до вида с использованием заявляемой питательной среды и прототипа в зависимости от исследуемого материалаИсследуемый материалЗаявляемая средаПрототипРИспражнения8068<0,05Моча8262<0,05Другой биоматериал   (отделяемое зева, носа, мокрота и т.д.)6653<0,05

Таким образом, применение заявляемой питательной среды позволяет уже на этапе накопления чистой культуры идентифицировать до вида Е. coli, P. mirabilis, P. vulgaris и С. freundi.

Т.к. на долю описанных выше видов приходится большинство культур, выделяемых из биоматериала, использование разработанной схемы позволяет значительно сократить потребность в дорогостоящих тест-системах для идентификации, тем самым существенно снизить трудоемкость и стоимость процедуры за счет существенного снижения числа штаммов, оставшихся не идентифицированными.

Стоимость прототипа (среда Клиглера) на одну культуру составляет 0,03$, среды Симмонса - 0,02$, заявляемой среды - 0,029$, т.е. стоимость заявляемой среды существенно не отличается от стоимости прототипа. Затраты на первичную идентификацию одной культуры с использованием как заявляемой среды так и прототипа составляют не более 0,05$. Техника приготовления и употребления заявляемой среды и прототипа практически не отличается (заявляемая среда отличается от прототипа только составом). Поэтому существенно не различаются и затраты рабочего времени на данную процедуру, которые составляют в среднем 7 минут на культуру.

Стоимость тест-системы для идентификации 1 штамма грамотрицательных бактерий составляет 1,25$, затраты рабочего времени на идентификацию одного штамма с ее использованием - 30 минут.

Таким образом, стоимость идентификации одного штамма с использованием тест-системы в 25 раз превышает стоимость данной процедуры с применением заявляемой питательной среды, а трудозатраты - в 4 раза.

Поэтому если с помощью заявляемой среды удается идентифицировать культуру до вида, отпадает необходимость употребления этих дорогостоящих тест-систем, что значительно экономит время и деньги. Кроме того, общее время идентификации в этих случаях сокращается на сутки.

Экономический эффект использования заявляемой среды хорошо виден на следующем примере.

При посеве 476 проб мочи было выделено 100 культур грамотрицательных условно патогенных бактерий.

Применение для их первичной идентификации прототипа в сочетании со средой Симмонса, позволило идентифицировать до вида только лактозоположительные штаммы Е. coli, а также С. freundi (на их долю пришлось 62 штамма), следовательно, остались не идентифицированными 38 штаммов. В результате на идентификацию 100 штаммов потребовалось по 100 пробирок со средой Клиглера и Симмонса и 38 тест-систем. Общие затраты на идентификацию составили 52,5$. Общие затраты рабочего времени составили 30,7 часов. В 62% случаев, когда культуру удалось идентифицировать без дополнительного использования тест-систем, время идентификации сократилось на 1 сутки.

При проведении первичной идентификации этих культур на заявляемой питательной среде в сочетании со средой Симмонса результаты оказались следующими. По сравнению с использованием прототипа появилась дополнительная возможность идентифицировать до вида лактозоотрицательные штаммы Е. coli, P.mirabilis и Р. vulgaris (на их долю пришлось 20 штаммов), следовательно, всего остались не идентифицированными только 18 штаммов. В результате на идентификацию 100 штаммов потребовалось по 100 пробирок со средой Клиглера и Симмонса и всего 18 тест-систем. Общие затраты на идентификацию составили 27,5$, затраты рабочего времени - 20,7 часов. В 82% случаев время идентификации культуры удалось сократить на 1 сутки.

Аналогичное испытание было проведено при идентификации 100 культур, выделенных из фекалий, и 100 культур, изолированных из другого биологического материала. Результаты представлены в таблице 6.

Таблица 6
Стоимость и трудоемкость идентификации 100 культур грамотрицательных условно-патогенных бактерий с использованием заявляемой питательной среды и прототипаИсследуемый материалЗаявляемая средаПрототипРстоимостьтрудоемкостьстоимостьтрудоемкость Испражнения$30,021,7 ч.*$45,027,7 ч.<0,05Моча$27,520,7 ч.$52,530,7 ч.<0,05Другой биоматериал (отделяемое зева, носа, мокрота и т.д.)$47,528,7 ч.$63,835,2 ч.<0,05* затраты рабочего времени

Таким образом, использование заявляемой среды для идентификации грамотрицательных условно-патогенных бактерий, выделенных из испражнений, позволило сократить трудоемкость процедуры на 21,7%, а стоимость - на 33,3%, при посеве мочи - соответственно на 32,6% и 47,6%, а при посеве другого биологического материала - соответственно на 18,5% и 25,5%.

Технический результат: использование заявляемой среды позволяет быстро, недорого и достоверно идентифицировать до вида до 82% штаммов условно-патогенных энтеробактерий, выделяемых из клинического материала.

Литература

1. Голубева И.В., Килессо В.А., Киселева Б.С. и др.; под ред. Покровского В.И. Энтеробактерии: руководство для врачей. М.: Медицина, 1985; 321.

2. Fanner JJ 3rd, Davis BR, Hickman-Brenner FW, McWhorter A, Huntley-Carter GP, Asbury MA, Riddle C, Wathen-Grady HG, Elias C, Fanning GR, et al. Biochemical identification of new species and biogroups of Enterobacteriaceae isolated from clinical specimens. J. Clin, Microbiol. 1985 Jan; 21(1):46-76.

3. Holt J.G., editor in ch. Bergey's manual of determinative bacteriology. Baltimor: Williams & Wilkins; 1994.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской микробиологии. Питательная среда содержит в 1 л дистиллированной воды ГРМ-агар, пептон ферментативный, маннит, аммоний железо (II) сульфат, натрия тиосульфат, феноловый красный в заданном количестве. Изобретение позволяет быстро, недорого достоверно идентифицировать грамотрицательные бактерии. 1 ил., 6 табл.

Питательная среда для первичной дифференциации условно-патогенных энтеробактерий, содержащая ГРМ-агар, пептон ферментативный, маннит, аммоний-железо (II) сульфат, натрия тиосульфат феноловый красный при следующем содержании ингредиентов, г/л дистиллированной воды:

ГРМ-агар25-30Пептон ферментативный5-10Маннит1-2Аммоний-железо (II) сульфат0,19-0,21Натрия тиосульфат0,25-0,35Феноловый красный0,04-0,05