СПОСОБ РАННЕГО ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОГО ТЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ У ДЕТЕЙ, ПЕРЕНЕСШИХ ОСТРЫЙ ПИЕЛОНЕФРИТ Российский патент 2002 года по МПК G01N33/52 G01N33/48 

Изобретение относится к области медицины, а именно микробиологии и нефрологии, и может найти применение в диагностической и лечебной работе как в стационарах, так и в поликлинических условиях.

Пиелонефрит является одним из наиболее распространенных заболеваний детского возраста. К числу неблагоприятных последствий перенесенного острого пиелонефрита у детей относится развитие хронических форм этого заболевания. Ранний и точный прогноз указанного неблагоприятного течения представляется на сегодня весьма важным и актуальным.

В настоящее время разработан ряд способов диагностики хронического пиелонефрита (ХП) у детей и прогноза его рецидивов, основанных на определении персистентных характеристик возбудителей. Так, в статье А.А.Вялковой, Л.М. Гордиенко, Л. Ю. Слюсаревой, Н. Ю.Перепелкиной "Клинико-бактериологическая характеристика инфекции мочевой системы у детей" (Ж. микробиол. - 1994, - Приложение, - с.77-79) указывается на взаимосвязь выделения из мочи штаммов, обладающих высокой антилизоцимной активностью (АЛА) (>5 мкг/мл) с рецидивирующим течением хронического пиелонефрита. В статье Л.С.Зыковой и О.Е.Челпаченко "Микробиологическая диагностика пиелонефрита у детей под контролем факторов бактериальной персистенции" (Ж. микробиол. - 1994, - Приложение, с. 74-76) указывается на необходимость определения факторов персистенции бактерий для доказательства их этиологической причастности в развитии инфекции мочевых путей и возможности дифференцировки от сопутствующей микрофлоры. В статье В.А.Гриценко, О.В.Бухарина, А.А.Вялковой "Факторы риска развития пиелонефрита у детей" (Российский вестник перинатологии и педиатрии. - т.44, 1999, - 6, -с.34-40) указывается на диагностическую информативность персистентных характеристик эшерихий (АЛА, антиинтерфероновая (АИА) и антикомплементарная активность) в патогенезе хронического пиелонефрита у детей.

Недостатком всех этих способов является невозможность раннего прогноза перехода острого пиелонефрита (ОП) в хронический, что не позволяет своевременно, на ранних этапах профилактировать формирование хронической патологии почек.

Из патентных источников АС 1837843, МПК А 61 В 10/00, БИ 32, 1993 г. защищен "Способ диагностики хронического пиелонефрита" путем выделения из мочи внутриклеточно персистирующих микроорганизмов и определением их антилизоцимной активности. При значении АЛА 5 мкг и выше диагностируют хронический пиелонефрит.

АС 1644911, МПК А 61 В 10/00, БИ N 16, 1991 г. защищен "Способ прогнозирования осложнений пиелонефрита" путем определения степени инактивации интерферона возбудителем. При инактивации возбудителем интерферона в разведении 1/20 и менее прогнозируют осложненное течение пиелонефрита (гайморит, острая респираторная и аденовирусная инфекция).

Этот способ является наиболее близким к заявляемому и взят в качестве прототипа. Существенным недостатком его является невозможность прогнозирования перехода острого пиелонефрита в хронический.

Целью настоящего изобретения является раннее и точное прогнозирование перехода ОП в ХП. Эта цель достигается следующим образом. У больных с ОП на исследование забирают среднюю порцию утренней мочи при естественном мочеиспускании двукратно, а именно при поступлении в стационар и перед выпиской.

Мочу исследуют на бактериальную обсемененность и видовую характеристику возбудителей стандартным микробиологическим методом (В.В. Меньшиков. Лабораторные методы исследования в клинике (справочник). М.: Медицина, 1987, -с. 316-317). Посев мочи производят секторным способом на следующие питательные среды: кровяной агар, желточно-солевой агар, среды Эндо и Сабуро. Для этого вначале на пластинчатые среды стандартной бактериологической петлей в сектор А производят посев исследуемого материала в виде одного штриха, а затем, после прожигания петли, делают 4 штриховых посева из сектора А в сектор В и аналогичным образом из сектора B в сектор С, а затем в сектор D.

Через 18-24 часа инкубирования в термостате при 37^oС подсчитывают количество колоний, выросших в разных секторах, а затем производят определение степени бактериурии по количеству колониеобразующих единиц (КОЕ) микроорганизмов в 1 мл мочи соответственно таблице, представленной в справочнике В. В.Меньшикова (1987).

У выделенных уропатогенных энтеробактерий определяют адгезивные свойства, АЛА и АИА.

Определение адгезивных свойств выделенных штаммов бактерий проводят по методике В. И. Брилиса с соавт. (Лаб. дело-1986, - 4, -с.210-212, 1986) с использованием формалинизированных эритроцитов 0 (I) Rh (+) группы крови.

Для постановки метода в стерильную колбу вносят по 0,5 мл взвеси эритроцитов и суточной бульонной культуры исследуемых микробов в буферном растворе (0,1 М раствор фосфата натрия) в концентрации 10⁹ клеток/мл. Эту смесь инкубируют при 37^oС на встряхивателе АВУ 6П в течение 30 мин. Затем на предметном стекле готовят мазок из исследуемой взвеси, фиксируют в смеси Никифорова, а затем окрашивают по Граму.

Степень выраженности адгезии учитывают по индексу адгезивности микробов - среднее количество микробов, приходящееся на один участвующий в адгезии эритроцит. Подсчет проводят на 50 эритроцитах, просматривая не менее 10 полей зрения. Микроорганизмы считают неадгезивными при индексе адгезивности микробов (ИАМ)<1,75, низкоадгезивными - от 1,76 до 2,5, среднеадгезивными от 2,51 до 4,0, высокоадгезивными - при ИАМ>4,0.

Наличие и выраженность антилизоцимной активности проводят по методу О.В. Бухарина с соавт. (Журн. микробиол.- 1984, - 2, -с.27-28). Для этого в питательной среде (чашки Петри с 5 мл МПА) готовят ряд разведений лизоцима (коммерческий препарат ПО "Мосмедпрепараты" им. Л.Я.Карпова) с различными концентрациями от 1 до 10 мкг/мл и интервалом 1 мкг. Контролем служит питательная среда без добавления лизоцима. На поверхность приготовленных сред наносят стандартной петлей капли испытуемых суточных бульонных культур (10⁹ бактерий/мл). Посевы инкубируют 18-24 часа при 37^oС. Выросшие колонии исследуемых культур убивают парами хлороформа в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем на колонии наносят второй слой (3 мл) полужидкого (0,7%) МПА, содержащего 0,1 мл 1 млрд. взвеси суточной агаровой индикаторной культуры Micrococcus luteus (ATCC 15307 из коллекции живых бактериальных культур ГИСК им. Л. А. Тарасевича). После повторной 24 часовой инкубации при 37^oС производят количественную оценку антилизоцимной активности по максимальной концентрации лизоцима в среде, при которой еще отмечается рост М.luteus вокруг колоний испытуемых штаммов.

Согласно методике, для оценки уровня антилизоцимной активности используют следующие критерии: низкий уровень АЛА-1-2 мкг/мл, средний - 3-5 мкг/мл, высокий - свыше 5 мкг/мл.

Для определения у микроорганизмов способности инактивировать антибактериальный компонент человеческого лейкоцитарного интерферона ("антиинтерфероновая активность") используют метод О.В.Бухарина с соавт. (А. с. СССР 156491, 1989, Открытия, -1990, - 18).

Вначале готовят рабочий раствор ПЧИЛ (препарат человеческого лейкоцитарного интерферона; НПО "Иммунопрепарат", г.Уфа) путем растворения сухого вещества ампулы в 4 мл стерильного изотонического (0,85%) раствора хлорида натрия. Затем в ряд пробирок с 4 мл расплавленного 1,5% МПА вносят от 0,1 до 0,9 мл рабочего раствора ПЧЛИ, с интервалом 0,1 мл. Содержимое пробирок выливают в стерильные чашки Петри. Контролем служит питательная среда без добавления раствора интерферона.

На поверхность сред стандартной петлей наносят 1 млрд. взвесь исследуемых суточных агаровых культур, суспендированных в изотоническом растворе хлорида натрия. Посевы инкубируют при 37^oС в течение 24 часов. Выросшие культуры инактивируют парами хлороформа в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем заливают вторым слоем 0,7% МПА в объеме 3 мл, содержащего 0,1 мл 1 млрд. взвеси суточной агаровой индикаторной культуры Corynebacterium xerosis 181 (ГИСК им. Л.А.Тарасевича), высокочувствительной к антибактериальной составляющей ПЧЛИ. После повторной инкубации в термостате при 37^oС в течение 24 часов проводят учет результатов исследования по наличию роста индикаторной культуры вокруг колоний микроорганизмов, инактивировавших интерферон. Уровень АИА выражают в условных единицах действия (ед.), в виде отношения максимальной концентрацией ПЧЛИ, инактивируемой исследуемым штаммом, к минимальной бактерицидной концентрации препарата по отношению к тест-штамму. Согласно методике для оценки уровня АИА используют следующие критерии: отсутствие или низкий уровень признака - до 1 ед.; средний - 1,1-2,0 ед.; высокий - 2,1 ед. и более.

При обнаружении в моче обследуемых, после проведения антибактериальной терапии, перед выпиской из стационара, штаммов энтеробактерий с высокими показателями факторов персистенции (индекс адгезивности микроорганизмов (ИАМ)>4,0; АЛА>5,0 мкг/мл; АИА >3,0 ед) на фоне бактериурии ниже диагностического уровня (100-1000 КОЕ/мл) прогнозируют хроническое течение заболевания.

Изобретение иллюстрируется двумя клиническими примерами.

Пример 1. У больного В., 6 лет с клиническим диагнозом "острый пиелонефрит", при поступлении в стационар из мочи была выделена кишечная палочка, в количестве 100 млн КОЕ/мл со следующими показателями факторов персистенции: ИАМ - 3,5; АЛА - 3,6 мкг/мл; АИА - 2,3 ед. После проведения антибактериальной терапии количество кишечных палочек снизилось до нормативных показателей (100 КОЕ/мл), однако показатели факторов персистенции у выделенных бактерий значительно возросли: ИАМ - 4,5; АЛА - 5,4 мкг/мл; АИА - 6,2 ед. На основании полученных биологических свойств кишечных палочек прогнозируется хроническое течение пиелонефрита.

Через 5 месяцев после выписки из стационара обострение процесса: повышение температуры до 38^oС, болевой синдром в области поясницы, бактериальная обсемененность мочи кишечными палочками выше диагностического уровня - 100 тыс. КОЕ/мл. Выявлен высокий уровень факторов персистенции у выделенных патогенов: ИАМ - 4,5; АЛА - 6,2 мкг/мл; АИА - 6,0 ед. Определение факторов персистенции в данном случае позволило прогнозировать хронизацию процесса, что привело к рецидиву инфекции.

Пример 2. Больной К., 4 лет с клиническим диагнозом "острый пиелонефрит". При поступлении в стационар из мочи выделены клебсиеллы в количестве 10 млн. КОЕ/мл со следующими показателями факторов персистенции: ИАМ - 1,9; АЛА - 2,0 мкг/мл; АИА - 1,2 ед. Была проведена соответствующая антибактериальная терапия. Результаты контрольного исследования перед выпиской: обнаружено незначительное количество клебсиелл в моче (10 КОЕ/мл), которые характеризуются низкими показателями факторов персистенции: ИАМ - 2,0; АЛА - 2,4 мкг/мл; АИА - 1,0 ед. Хроническое течение пиелонефрита не прогнозируется. При динамическом наблюдении в течение 1,5 лет после выписки из стационара рецидивов пиелонефрита не отмечалось.

Аналогичные исследования были проведены 50 больным с острым пиелонефритом. В таблице представлены данные по частоте обнаружения штаммов энтеробактерий с высоким уровнем факторов персистенции в динамике ОП и в период обострения при хронизации процесса.

Как видно из таблицы, у 20 детей перед выпиской из стационара в моче присутствовали энтеробактерии с высоким уровнем факторов персистенции, что позволило прогнозировать у них хроническое течение заболевания. Этот прогноз подтвердился у 19 (95,0%) детей, у которых в интервале от 5 месяцев до 1 года возникли рецидивы инфекции.

По сравнению с прототипами заявляемый способ обеспечивает более раннее и точное прогнозирование хронического течения заболевания у детей, перенесших ОП, что позволяет своевременно выделить группы риска, нуждающиеся в дополнительной адекватной этиопатогенетической терапии, направленной на предупреждение хронизации процесса и возникновения рецидивов инфекции.

Изобретение относится к области медицины, в частности к микробиологии и урологии. Способ обеспечивает повышение точности прогнозирования хронического течения пиелонефрита у детей. Определяют в моче обследуемых с острым пиелонефритом при поступлении и после антибактериальной терапии факторы персистенции уропатогенных энтеробактерий, а именно индекс адгезии микробов (ИАМ), антилизоцимную активность (АЛА) и антиинтерфероновую активность (АИА) и при наличии штаммов энтеробактерий с высокими показателями факторов персистенции ИАМ более 4, АЛА более 5 мкг/мл и АИА более 3 ед на фоне бактериурии ниже 100 КОЕ/мл при поступлении прогнозируют хроническое течение пиелонефрита. 1 табл.

Способ прогнозирования хронического течения пиелонефрита у детей, отличающийся тем, что определяют в моче обследуемых с острым пиелонефритом при поступлении и после антибактериальной терапии факторы персистенции уропатогенных энтеробактерий, а именно: индекс адгезии микробов (ИАМ), антилизоцимную активность (АЛА) и антиинтерфероновую активность (AИA), и при наличии штаммов энтеробактерий с высокими показателями факторов персистенции ИАМ более 4, АЛА более 5 мкг/мл и АИА более 3 ед на фоне бактериурии ниже 100 КОЕ/мл при поступлении прогнозируют хроническое течение пиелонефрита.