СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭФФЕКТИВНЫХ ДОЗ ТОКСИЧНЫХ И ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ Российский патент 2002 года по МПК G01N33/15 

Данное изобретение относится к медицине, а именно к токсикологии, фармакологии, радиобиологии, и предназначено для определения эффективных доз токсичных и лекарственных веществ, воздействующих на живой организм и его субстанции.

Известно несколько способов определения эффективных доз (в основном, среднеэффективных). Это способ Литчфилда-Вилкоксона (Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. - Л.: "Изд-во мед. лит.", 1963. - 152 с.); Финни, Фишера, Прозоровского, Фрумина (Криштопенко С.В., Тихов М.С. Токсикометрия эффективных доз. - Н.Новгород: "Изд-во НГУ", 1997. - 156 с.).

Для того чтобы при помощи этих способов определить среднеэффективную или другую дозу, необходимо еще на этапе планирования эксперимента сформировать не менее трех групп тест-объектов (экспериментальных животных, органов и тканей организма и других) численностью не менее 6 в каждой. После испытания одинаковых для каждой группы доз определяется частота проявления заданного эффекта в группах, которая преобразуется в квантили нормального распределения (пробиты). Испытанные дозы (или логарифмы доз) и пробиты составляют совокупность исходных данных для построения функции эффективности. В том случае если функция эффективности примет линейный вид, возможно вычисление эффективных доз.

Недостатками в применении данных способов являются: трудности в формировании однородных групп (например, в ситуациях, когда воздействовавшие дозы определяются после испытаний, или в случае исследований клинической эффективности лекарственных препаратов сформировать однородные группы тест-объектов практически невозможно); использование только линейной модели для построения функции эффективности, которая к тому же задается априорно (в настоящее время доказано, что функции эффективности многих веществ имеют нелинейный вид); отсутствие системы учета влияния погрешностей испытанных доз на конечные показатели; использование не менее 18 тест-объектов.

Целью изобретения является повышение точности и надежности определения эффективных доз, оптимизация способа и экономия экспериментального материала.

Поставленная цель достигается за счет проведения на тест-объектах испытаний в три этапа заданных доз токсичного или лекарственного вещества при равномерном заполнении исследуемого диапазона. Эффект (результативный признак) учитывается в альтернативной форме (1 - есть проявление признака, 0 - нет проявления признака). При этом условие формирования однородных групп не ставится.

Результаты независимых единичных испытаний представлены в виде пар показателей "доза-эффект". Независимыми они являются потому, что при последующих вычислениях не включаются в состав каких-либо однородных групп, а единичными - потому, что каждое наблюдение выступает как самостоятельный представитель экспериментальной выборки даже в случаях повторных испытаний.

В дальнейшем по разработанному нами алгоритму, основанному на известном в математической статистике методе ядерной оценки регрессии (Тихов М.С. Построение и анализ статистических оценок для неполностью известных семейств распределений: Дис... д-ра физ.-мат. наук. Н.Новгород, 1993. 354 с.) производится оценка эффективных доз и построение функции эффективности с учетом величины погрешности испытанных доз.

На первом этапе необходимо найти диапазон доз, в котором происходит резкий переход эффектов от 0 к 1, при увеличении доз в 2 раза.

Например, пусть при испытаниях доз 5, 10, 20 и 40 мг/кг получены соответствующие им эффекты 0, 0, 1, 1. Ясно, что среднеэффективная доза вероятнее всего находится в диапазоне доз 10...20 мг/кг. Если же происходит чередование 0 и 1 (0, 1, 0, 1) при увеличении доз в 2 раза, то существует большая вероятность парадоксальной функции эффективности, так как в этом случае при возрастании испытанной дозы в 4 раза эффекты остаются равными. В таких условиях определить среднеэффективную дозу на минимальном числе наблюдений невозможно, и необходимо провести построение и анализ функции эффективности для решения вопроса об особенностях токсикодинамики (фармакодинамики) исследуемого препарата.

На втором этапе, увеличивая или уменьшая дозу в найденном диапазоне в 1.1 раза, необходимо добиться следующих возможных последовательностей эффектов:
00-0001-11
00-0010-11
00-0011-11
00-0100-11
00-0101-11
00-0110-11
00-0111-11
00-1000-11
00-1001-11
00-1010-11
00-1011-11
00-1100-11
00-1101-11
00-1110-11
При этом используются еще шесть тест-объектов. Изменение дозы в 1.1 раза обеспечивает равномерное перекрытие диапазона с возрастанием конечной дозы по сравнению с начальной в 2 раза. Кроме того, достигается минимально достаточное число наблюдений при соблюдении условия нормального распределения искомой среднеэффективной дозы.

В данном случае устанавливается общая закономерность зависимости "доза-эффект" или общий вид функции эффективности в диапазоне испытанных доз. Среднеэффективная доза может быть определена на минимально возможном числе наблюдений в том случае, если функция эффективности равномерно возрастает и не имеет тенденции к парадоксальному виду. Поэтому переход эффектов с 0 на 1 должен наблюдаться в середине диапазона при наличии на краях не менее двух доз с 0 и 1 эффектами.

На третьем этапе необходимо провести дополнительные испытания доз в определенных точках в зависимости от полученной комбинации эффектов. Порядок дополнительных испытаний приведен в табл. 3. Пользоваться этой таблицей необходимо следующим образом. Исходными данными для входа в таблицу являются комбинации эффектов, полученные на втором этапе испытаний и находящиеся в строках таблицы, обозначенных целыми числами (1, 2, 3 и т.д.). Условной точкой отсчета является доза 10.0 мг/кг. В реальной ситуации за точку отсчета может принята любая испытанная доза, и от нее необходимо производить увеличение или уменьшение испытанных доз в 1.1 раза. Например, приведенные в строке 1 результаты испытаний необходимо дополнить еще двумя наблюдениями в дозах 13.3 и 14.6 мг/кг. В данном случае возможны четыре варианта эффектов. При вариантах эффектов 1.1, 1.3 и 1.4 Среднеэффективная доза может быть вычислена по 10 наблюдениям. А при варианте 1.2 необходимо дополнить испытания дозой 22.0 мг/кг с обязательным положительным эффектом. В случае проявления отрицательного эффекта существует вероятность парадоксальной функции эффективности. Для ее полного формирования необходимо дополнить испытания в более широком диапазоне доз.

Среднеэффективная доза может быть определена на 10-12 тест-объектах.

При использовании на втором этапе более шести тест-объектов специального планирования эксперимента не требуется. Необходимо только приблизительно равномерное их распределение внутри найденного на первом этапе диапазона доз.

Сущность эксперимента состоит в следующем. В организм вводится случайная доза Х, которая к тому же измеряется с ошибкой ε. Эта ошибка накладывается на истинную дозу X₁ аддитивно. Результатом измерения является случайная величина Х= X₁+ε. Пусть z - нижняя граница, с которой начинается фиксируемый отклик организма (эффект - W). Если Z≥X, то эффект отсутствует. В противном случае (т. е. когда Z<Х) эффект проявляется. Иными словами, рассматривается бинарная случайная величина W-индикатор события (Z<Х), т.е. W=I(Z<X).

В результате выполненного эксперимента в качестве исходных данных для построения функции эффективности имеется выборка пар наблюдений B⁽ⁿ⁾={(X_i, W_i),1≤i≤n}.

Предполагается, что {(X_i,W_i),1≤i≤n} есть последовательность независимых между собой одинаково распределенных с (X,W) двумерных случайных векторов. Рассматриваемая характеристика - регрессия величины W на Х, т.е. условное ожидание E(W|X = x) величины W при фиксированном значении Х.

Если z и х независимы, то E(W|X = x) = F(x) = P(Z<x), где F(x)-функция распределения случайной величины z.

В общем случае E(W|X = x) = P(Z<x|X = x) = F(x|x) = T(x) - условная функция распределения, которая и является функцией эффективности.

В случае независимых z и x функция T(x)=F(x) является монотонно не убывающей функцией х. Если же z и х зависимы, то Т(х) имеет область значений - интервал [0;1], но может быть и убывающей на каких-то интервалах значений переменной х. Такие функции эффективности называются парадоксальными.

Принцип построения функции эффективности показан на фиг. 1.

Посредством ядерной оценки регрессии в каждом основном диапазоне доз (фиг. 1) определяется значение вероятности эффекта, соответствующее дозе в середине этого диапазона.

Если в основном диапазоне находится n значений доз (Х_i) из общей выборки с соответствующими индикаторами альтернативного эффекта (W_i), то оценка вероятности эффекта в середине диапазона может быть найдена по формуле

где с - величина (константа), задающая величину "окна просмотра";
х - значение категории эффективной дозы, находящейся в середине заданного диапазона испытанных доз;
n - число испытанных в заданном диапазоне доз.

Функция ядра K(ν) имеет смысл весовых коэффициентов, предназначенных для уменьшения влияния на конечный результат малоинформативных крайних значений доз диапазона. Она определена в интервале -1≤ν≤1 и равна

При достаточном объеме выборки распределение оценки приближается к нормальному закону со стандартной ошибкой

где


Ошибка измерения испытанных доз является нормально распределенной случайной величиной со средним значением 0 и дисперсией S₀ ², на основании которой можно находить интервал допустимых значений испытанных в эксперименте доз. Величину S₀ можно определить как среднеквадратическое отклонение, которое формирует границы толерантного интервала выборки допустимых значений испытанной дозы при значении уровня надежности, соответствующего предельному значению для нормального распределения, исходя из правила "трех сигм"
x±3•S₀ (6)
Значение величины ε можно преобразовать в единицы предельной относительной погрешности и выразить в процентах

Соответственно
(8)
Поскольку измерения доз производятся с ошибками, то само значение искомой эффективной дозы ν^* будет найдено с ошибкой и ее следует скорректировать по формуле

где


Вероятность эффекта λ, соответствующая середине заданного диапазона ν^*, определяется из уравнения

Введем обозначения величины доверительного интервала искомой эффективной дозы как

где n - число наблюдений, вошедшее в основной диапазон (см. фиг. 3);
- стандартная ошибка эффективной дозы.

Вычисление стандартной ошибки эффективной дозы в методе ядерной оценки регрессии может производиться следующим образом:

где



Применение формулы 17 основано на известном в математической статистике методе "конечных разностей". Ее применение иллюстрируется на фиг. 1 в виде вспомогательных диапазонов T_n1(ν-0.5•c) и T_n2(ν+0.5•c), обозначенных цифрой 2. Оценка надежности вычисленной вероятности эффекта в середине вспомогательного диапазона производится аналогично такой же оценке, применяемой в отношении основного диапазона.

Доверительный интервал заданной надежности
γ = 1-(α+β) = 0.95
для среднего значения эффективной дозы х с учетом наличия погрешности испытанных доз определяется как

Из формулы 18 видно, что на оценку эффективной дозы х строится доверительный интервал уровня надежности γ=0.95 и явно определяются только значения его границ. В этом случае конечная (истинная) ошибка эффективной дозы, включающая погрешность измерения испытанных в эксперименте доз может быть вычислена с учетом свойств доверительных интервалов и величины t-критерия Стьюдента. Поскольку для достижения заданного уровня надежности используется уровень ошибки воспроизведения вероятности эффекта α=0.025 и ошибки испытанных доз β=0.025, то уровень суммарной (аддитивной) ошибки эффективной дозы равен η=0.05. Поэтому вычисление истинного значения ошибки эффективной дозы по установленному доверительному интервалу производится с учетом значения t-критерия Стьюдента для уровня надежности γ = 1-η(t_1-η/2,n-1).
Критерием адекватности эффективной дозы является ее соответствие закону нормального распределения.

В качестве примера применения предлагаемого способа приведем определение эффективных доз ацетилхолина йодида по эффекту хромодакриорреи у белых крыс. Препарат вводился животным подкожно в диапазоне доз от 3.0 до 7.0 мг/кг с равномерным заполнением этого диапазона. Появление эффекта учитывалось в течение 5 минут. В опытах использовались беспородные белые крысы массой тела 0.180-0.260 кг. Предельная относительная погрешность воздействовавшей дозы составляла не более 5%. Эффект учитывался в альтернативной форме (0 - нет эффекта, 1 - есть эффект). Опыт выполнен на 18 животных, а его результаты приведены в табл. 1.

Полученные исходные данные по своей сути представляют собой независимые единичные испытания. Методом ядерной оценки регрессии была построена функция эффективности (зависимость "доза-эффект"), состоящая из 45 статистически надежных и адекватных точек с координатами по оси абсцисс - эффективные дозы, по оси ординат - вероятности эффектов, значения которых приведены в табл. 2 и проиллюстрированы на фиг. 2.

Анализируя функцию эффективности ацетилхолина, можно видеть, что она определена в диапазоне эффективных доз от ЕД_17.9 до ЕД_97.2. Эта функция монотонно возрастает и не имеет разрывов, что позволяет вычислять на ней любую эффективную дозу. Например, среднеэффективная доза (ЕД₅₀) равна 4.25±0.29 (3.62-4.88) мг/кг. Она вычислена по общему диапазону, включающему 13 наблюдений.

Оптимальная величина "окна просмотра" (константы с) равна 1.15 мг/кг. Точность определения средней составила 6.8%. На величину вероятности эффекта (50%) может быть построен доверительный интервал с заданным уровнем надежности (например, γ= 0.95) с использованием в качестве ошибки значения =14,5%:50.0±2.20•14.5 (18.1-81.9)%.

Такие же вычисления можно провести и в отношении любой эффективной дозы и вероятности эффекта на данной функции эффективности.

Таким образом, для практического использования предлагается простой, удобный и статистически адекватный способ определения среднеэффективных доз (ЕД₅₀) при минимально возможном числе испытаний. Конечно же точно прогнозировать необходимое число тест-объектов на предварительном этапе испытаний невозможно. Но если установлен диапазон, в котором может находиться среднеэффективная доза, то для ее определения потребуется дополнительно от 8 до 12 тест-объектов.

Преимущества способа:
- во-первых, предлагаемый способ отличается строгой статистической обоснованностью и адекватностью, что обеспечивает требуемый уровень надежности конечных оценок. Он позволяет определять статистически состоятельные оценки искомых показателей эффективных доз и вероятностей эффектов (среднее значение, стандартную ошибку средней и доверительный интервал) в любой точке функции эффективности, которые пригодны для выполнения последующих сравнений между различными показателями (проведение оценки достоверности различий, вычисление коэффициентов и т.д.);
- во-вторых, способ позволяет учитывать влияние на конечные показатели погрешностей исходных данных (испытанных в эксперименте доз), что обеспечивает метрологическую адекватность конечных оценок. Следует отметить, что ни один из существующих способов определения среднеэффективных доз не содержит хоть какого-либо механизма учета влияния погрешностей исходных данных на искомые показатели;
- в-третьих, предлагаемый способ позволяет строить функцию эффективности любого вида, в том числе нелинейные и парадоксальные, в отличие от традиционных методов, основанных только на линейных моделях;
- в-четвертых, данный способ позволяет получать конечные оценки заданного уровня надежности при минимально достаточном числе испытаний. Экономия тест-объектов (живых организмов, растений и их субстанций) составляет более 30%. Например, надежное значение среднеэффективной дозы можно получить уже на 10-12 тест-объектах, тогда как при использовании традиционных способов минимальное значение наблюдений равно 18.

Приведенные доводы позволяют рассматривать данный способ в качестве стандарта для определения показателей токсичности (вредного воздействия) повреждающих факторов и эффективности лекарственных средств.

Изобретение относится к медицине, а именно к токсикологии, фармакологии, радиобиологии, и предназначено для определения эффективных доз токсичных и лекарственных веществ. Испытания проводят в три этапа на тест-объектах. На первом этапе определяют диапазон доз, в котором происходит резкий переход эффектов от 0 к 1. На втором этапе, увеличив или уменьшив дозу в заданном диапазоне в 1.1 раза, добиваются воспроизведения следующих последовательностей эффектов: 00-0001-11, 00-0010-11, 00-0011-11, 00-0100-11, 00-0101-11, 00-0110-11, 00-0111-11, 00-1000-11, 00-1001-11, 00-1010-11, 00-1011-11, 00-1100-11, 00-1101-11, 00-1110-11, при этом увеличивая число шесть тест-объектов. На третьем этапе проводят дополнительные испытания в специально заданных точках и методом ядерной оценки регрессии строят функцию эффективности и определяют эффективные дозы. Способ позволяет повысить точность способа. 2 ил., 3 табл.

Способ определения эффективных доз токсичных и лекарственных веществ, включающий проведение испытаний доз веществ на группе тест-объектов, определение у них проявления эффекта и построение функции эффективности, отличающийся тем, что испытания проводят в три этапа, на первом определяют диапазон доз, в котором наблюдается резкий переход эффекта от 0 к 1 при увеличении дозы в 2 раза, на втором этапе, увеличивая или уменьшая дозу в 1,1 раза, добиваются воспроизведения следующих возможных последовательностей эффектов
00-0001-11
00-0010-11
00-0011-11
00-0100-11
00-0101-11
00-0110-11
00-0111-11
00-1000-11
00-1001-11
00-1010-11
00-1011-11
00-1100-11
00-1101-11
00-1110-11
при этом используя еще шесть тест-объектов, на третьем этапе проводят дополнительные испытания в заданных точках по таблице 3 и методом ядерной оценки регрессии строят функцию эффективности и определяют эффективные дозы.