Изобретение относится к анализатору для простого анализа и исследования малых количеств образцов.
Уделяется внимание важности выполнения анализов или измерений в тех местах, где анализы или измерения являются необходимыми, или вблизи них (в дальнейшем упоминается в целом как "анализы НМЛ, и тому подобное"), таких как анализ для диагностики непосредственно у постели больного с проведением измерений, необходимых для медицинской диагностики рядом с пациентом (анализы НМЛ (на месте лечения)), для анализа опасных веществ в реках и в отходах в таких местах как реки, земляные дамбы и тому подобное, и инспекции загрязнений в каждом месте приготовления, заготовки и импорта пищевых продуктов, и ударение в настоящее время делается на развитие методов диагностики и устройств, применяемых для этих анализов НМЛ и тому подобное. Эти анализы НМЛ и тому подобное, согласно требованиям, должны производиться просто, за короткое время и недорого.
Что касается обычных методов микроанализа, как правило, используются устройства ГХ-МС и устройства ЖХМС для количественной характеристики образцов с помощью масс-спектрометра после разделения образца с помощью капиллярной газовой хроматографии (КГХ), капиллярной жидкостной хроматографии (КЖХ) и тому подобное.
Однако эти анализаторы не являются пригодными для использования в таких точках измерения, как у постели пациента, загрязненные реки и земляные дамбы, поскольку масс-спектрометры являются большими по размеру и сложными в работе. Далее, для анализаторов, предназначенных для использования в медицинской диагностике с использованием крови и тому подобного в качестве образцов, является желательным, чтобы вступающие в контакт детали были заменяемыми.
Для решения этих проблем была предложена концепция методов, называемая, в целом, μTAS (micro total analysis system - микросистема для тотального анализа), предназначенная для того, чтобы сделать обычно используемые анализаторы меньшими и осуществлять взаимодействие и разделение образцов с использованием кристаллов в несколько квадратных сантиметров, содержащих капилляры для осуществления электрофореза, используемого для просто осуществляемого микроанализа (Sensors and Actuators, Bl (1990), 244-248, A. Manz et al.). Эта μТАS имеет те преимущества, что количества образцов и реагентов, необходимых для диагностирования компонентов и количества отходов, и отходы, возникающие от использования расходуемых материалов и тому подобное, уменьшается, и диагностирование может быть осуществлено за короткое время.
μТАS состоит из образцов, состоящих, в свою очередь, из жидкостей, газов и тому подобное (в дальнейшем упоминается как "флюид"), в кристалле, средств для переноса реагентов и средств для достижения их взаимодействий и тому подобное, в дополнение к вышеуказанным кристаллам и методам анализов, для каждого из которых производится исследование.
Однако каждый из них имеет недостатки, как описывается ниже, и полная μTAS, объединяющая все эти компоненты, при настоящих обстоятельствах еще не завершена.
Например, материалы, формирующие капилляр, как правило, представляют собой стекло и кремний, который необходимо прецизионно обрабатывать с высокой степенью точности (например, выложенный патент Японии 2-245655), но они также имеют те недостатки, что стоимость процесса является очень высокой и требуется осторожное обращение, поскольку они легко ломаются, и тому подобное. Более того, как описано выше, при использовании в медицинской диагностике и тому подобном, является желательным, чтобы кристаллы были заменяемыми, поскольку они вступают в контакт с образцами, выделяемыми у пациентов, такими как кровь и тому подобное, но такие материалы, как стекло и кремний, являются негорючими, создавая, таким образом, проблемы также и при обработке отходов.
В качестве исследования, предназначенного для решения этих проблем, возникающих, когда используется стекло и кремний, предложен способ, в котором кристаллы изготавливают из смолы (R.M. McCormick et al./Anal. Chem. Vol. 69, No. 14 (1997), 2626-2630, выложенный патент Японии 2-259557, патент Японии 2639087 (Регистрация: 25 апреля, 1997, Shimadzu Corp.). Способ производства кристаллов из смолы включает способ, при котором поверхность кремниевой пластины обрабатывается с использованием прецизионной технологии обработки полупроводников с последующим электроосаждением Ni и удалением Si путем растворения и тому подобное, с получением шаблона, для обработки смолы, и затем акриловая смола или нечто подобное обрабатывается с помощью формования литьем, при этом описанный выше шаблон используется в качестве матрицы для формования кристаллов (Analytical Chemistry 69, 2626-2630 (1997) (Aclara Biosciences)).
Таким образом, кристаллы, выполненные из смолы, являются превосходными в отношении заменяемости и массового производства, но доставляют проблемы, как описано ниже, когда флуоресцентные методы, абсорбциометрические методы и тому подобное, используемые в обычных детектируемых устройствах, адаптируются в качестве средств для детектирования веществ в кристалле, как в случае стекла и кремния.
Уровень техники будет дополнительно описан ниже с акцентом на устройства детектирования.
Методы анализа образцов, протекающих в капилляре, как правило, включают методы флуоресцентной спектроскопии (например, S.C. Jacobson et al., Anal. Chem. Vol. 66, 4127-4132, 1994, выложенный патент Японии 2-245655), абсорбциометрические методы (например, N. Kuroda et al., J. Chromatogr., Vol. 798, 325-334, 1998), и методы хемилюминисценции (например, М.F. Regehr et al., J. Capillary Electrophor, Vol. 3, 117-124, 1996).
Среди этих методов метод хемилюминисценции и флуоресцентный метод являются методами, в которых вещество, которое необходимо детектировать, в присутствии катализатора преобразуется в соединение в возбужденном состоянии, например окислитель, и обнаруживается энергия, испускаемая в виде света, когда соединение переходит из этого состояния в основное состояние (в случае флуоресцентного метода энергия переносится к приемнику энергии, существующему совместно с возбужденным соединением, и определяется энергия, испускаемая, когда этот приемник переходит из возбужденного состояния в основное состояние). С другой стороны, абсорбциометрический метод является методом, при котором в раствор, содержащий вещество, которое необходимо определить, вводится свет для измерения интенсивности проходящего света и определения отношения интенсивности проходящего света к интенсивности падающего света. Что касается чувствительности, в целом можно сказать, что порядок, от самой низкой до самой высокой, является следующим: абсорбциометрический метод, флуоресцентный метод и хемилюминесцентный метод.
В качестве главных хемилюминесцентных реакций в течение долгого времени известны методы, использующие люминол и люцигенин. Кроме того, хемилюминесцентная реакция имеет такие преимущества, как высокая скорость и высокая чувствительность и относительно недорогое устройство, поскольку для детектирования не требуется источника света, но она имеет те недостатки, что люминесценция быстро затухает, реагенты для использования являются нестабильными, фон является высоким.
Подобным же образом, флуоресцентный метод имеет то преимущество, что его система реакций известна в течение долгого времени, но он требует источник возбуждающего света в качестве оптической системы и оптические фильтры для разделения возбуждающего света и флуоресценции.
Кроме того, эти методы, использующие явления люминесценции, доставляют проблемы с плохой эффективностью сходимости света, поскольку излучаемый свет расходится во всех направлениях. В случае флуоресцентного метода общая применимость не является высокой, поскольку выход флуоресцентного излучения является низким, и является необходимым создание системы реакции для преобразования вещества-объекта, которое необходимо измерить, в вещество с ограниченной флуоресценцией.
В частности, в области клинических исследований для медицинской диагностики, поскольку интеграция измеренных значений с величинами, получаемыми стандартными методами, определяемыми академическими сообществами, и тому подобное, находится в процессе развития, существенные изменения в системах измерений могут вызывать проблемы.
Кроме того, абсорбциометрический метод имеет тот недостаток, что является необходимым создание длины оптического пути, достаточно большой для того, чтобы получить точные результаты, и особенно длинный оптический путь получается для определения незначительных количеств образцов, при этом структура ячеек детектора становится сложной, поскольку принципиально определяется соотношение падающего света к проходящему свету.
Таким образом, исследование с помощью общепринятых абсорбциометрических методов и флуоресцентных методов с использованием кювет и тому подобного может осуществляться с использованием относительно малых устройств, но измерение с помощью кристаллов, снабженных капиллярами, предназначенными для применения в анализах НМЛ, и тому подобное, делает возможной только малую длину оптического пути, поскольку диаметр капилляра уменьшается, и может быть получена только низкая чувствительность.
Предложены способы, в которых свет не поступает в капилляр вертикально, а вводится в направлении потока для получения большой длины оптического пути (например, выложенный патент Японии 8-304339), но эти способы имеют тот недостаток, что исследование в направлении потока не является простым в случае капилляров, сформированных в кристаллах, и структура кристалла вместе со структурой его детектирующих частей становится более сложной.
В качестве другого способа детектирования незначительных количеств компонентов в течение длительного времени известен способ фототермического детектирования (метод детектирования с тепловой линзой), в котором образцы в жидкости возбуждаются с помощью возбуждающего света, создавая так называемую тепловую линзу, и изменения в тепловой линзе измеряются с помощью детектируемого света (выложенный патент Японии 60-174933, А. С. Boccara et al., Appl. Phys. Lett. 36, 130, 1980).
В способе фототермического детектирования с помощью возбуждающего света формируется тепловая линза толщиной, как правило, от около 0, 1 мкм до 1 мм. В том случае, если может быть обеспечена достаточная длина оптического пути, например около 1 см, способ фототермического детектирования, как правило, не используется, поскольку требуется два вида источников света, то есть возбуждающий свет и детектируемый свет, в противоположность абсорбциометрическому способу и флуоресцентному способу. Кроме того, возбуждающий свет и детектируемый свет делаются коаксиальными и должны пройти по капилляру, вызывая, таким образом, усложнение устройства.
Однако предложены способы, в которых два лазера не являются коаксиальными, но располагаются под углом или навстречу друг другу (J. Liquid Chromatography 12, 2575-2585 (1989), выложенный патент Японии 10-142177 (Molecular Biophotonics)), а также способы, в которых свет одного лазера разделяется при использовании, и детектируется сдвиг положения фокуса самого по себе, вызванный фототермическим преобразованием (выложенный патент Японии 4-369467 (Yokogawa Electric Corp.)).
Одним из примеров способа фототермического детектирования с использованием Аr лазера и He-Ne лазера является способ, в котором образец помещается на стеклянную пластинку и образует сэндвич с другой стеклянной пластинкой (Anal. Chem. 65, 2938-2940 (1993)).
Далее, существует пример, где ввод света производится с наружной стороны планарного кристалла, содержащего капилляры, в анализатор, который направляет жидкость с использованием насосов (Analysis No.4, 280-284, 1997, M. Harada et al. , Anal. Chem. Vol. 65, 2938-2940, 1993, Kawanishi et al., Japan Analytical Chemistry, Abstracts of 44th Annual Meeting, p.119, 1995, и тому подобное).
Эти способы фототермического детектирования главным образом предназначены для улучшения локальной абсолютной чувствительности типа "сколько молекул может детектироваться". Таким образом, доминируют способы, в которых лазерный свет сфокусирован настолько, насколько это возможно, возбуждающий свет фокусируется в малом объеме, и детектируется тепловая линза, возникающая в микроскопической области.
Более того, среди этих примеров также находятся такие, которые демонстрируют концепцию, когда системы с химической реакцией, такие как реакционные емкости, элементы для контроля жидкости и детектирующие части, интегрируются в кристалле (Journal of Japan Mechanics Association 100, 615-617 (1997), Sensor/Actuator/Week 1997 General Symposium Abstracts "Microsensor" Session 3, pp.19-23 (April 17,1997)). Далее, в этих примерах, формируются капилляры, и стекло, таким образом, используется в качестве материала для образования канавок на его поверхности.
В случае, когда в качестве материалов для кристаллов используются кремний и стекло, на подложке, выполненной из стекла, кварца, или на Si подложке, с использованием такой технологии, как вакуумное испарение, формируются защитные покрытия для травления (Сr и тому подобное) толщиной несколько тысяч ангстрем, и на нее с использованием центробежного устройства наносятся структурообразующие кислотоупорные слои. Затем этот слой подвергают действию ультрафиолетового света с использованием маски для фотолитографии, с последующим осуществлением проявления (удаление не отвержденной части с помощью растворителя) структуры, что приводит к получению желаемой конфигурации. Затем, используя структурированный кислотоупорный слой в качестве маски при травлении, защитное покрытие при травлении растворяется и удаляется с помощью раствора феррицианиада калия, что приводит к образованию структуры. Затем, используя структурированный кислотоупорный слой и защитное покрытие при травлении в качестве масок, подложку вытравливают с помощью раствора фтористоводородной кислоты, например, для образования канавки. Затем кислотоупорный слой и защитное покрытие вытравливаются. Кроме того, в дополнение к описанной выше подложке, такая подложка как стекло, снабженная сквозными отверстиями, создается с использованием такой технологии как ультразвуковая обработка.
Наконец, после того как подложка, снабженная канавками, и подложка, снабженная сквозными отверстиями, ламинируются, при этом канавка находится на ее внутренней стороне, ламинированные подложки нагреваются, например, в вакуумной печи (в случае, когда обе они являются стеклянными пластинами, примерно при 600oС в течение нескольких часов), а затем их оставляют, чтобы они остыли и сплавились вместе с образованием кристалла.
Как описано выше, в случае стекла канавки должны создаваться на плоской поверхности стекла одна за другой для получения кристаллов, использующих такой способ в качестве расширения технологии для создания полупроводниковых интегральных схем (сочетание технологии фотолитографии и технологии травления). Кроме того, в процессе производства используют множество вредных химикалиев, и процесс производства занимает многие часы и требует дорогостоящего оборудования, используемого в производстве полупроводников, и тому подобное. Далее, описанный выше кристалл, выполненный из стекла, имеет тот недостаток, что оно может расколоться, и с ним нужно обращаться осторожно.
Далее, для использования в медицинской диагностике кристалл может вступать в контакт с образцами, берущимися у пациентов, такими как кровь, и желательно, чтобы описанный выше кристалл был выполнен заменяемым, но стекло является негорючим материалом, таким образом, вызывая проблемы и при уничтожении отходов. Поэтому оно не является пригодным для использования при анализах НМЛ и тому подобное, требующих удешевления.
С другой стороны, для медицинской диагностики, концентрации различных веществ в образцах, берущихся из биологической тел, таких как кровь, моча и спинномозговая жидкость, широко определяются количественно или качественно. Параметры, которые должны определяться в образцах, берущихся из биологических тел, включают ферментативную активность GOT, GPT, γ-GTP и ALP, общий уровень холестерина, триглицерида, глюкозы, гемоглобина Alc (HbAlc), и других белков, таких как креатининкиназа, С-реактивные белки (CRP) и цитокинины, антигены, производимые бактериями, и антитела против них.
Определение веществ, подлежащих определению, осуществляется путем взаимодействия образца с ферментом и антителом, специфичным к веществу, подлежащему определению, с целью конечного преобразования этого вещества в вещество (красители, флуоресцентные вещества, люминесцентные вещества и тому подобное), которые могут определяться с помощью поглощения, флуоресценции, хемилюминесценции и так далее, и определения количества конечного вещества (Ogawa, Z. et al., Clinical Investigation, 41:981 (1997), Kanno, Т., Clinical Investigation, 42:309 (1998)).
Эти реакции для определения осуществляются путем взвешивания заданного количества образца и одного или нескольких видов растворов реагентов соответственно, и смешивания их для осуществления взаимодействия при заранее определенной температуре в течение заданного периода времени.
В центральных лабораториях больших госпиталей и в автоматических анализаторах, используемых компаниями, специализирующимися на клинических анализах, растворы реагентов и образцы с заданным объемом или весом взвешиваются соответствующим образом с помощью автоматических пипеток. Также, в случае анализа, выполняемого вручную, исследователи взвешивают заданное количество образцов и растворов, используя пипетки и количественные капилляры.
Исследование загрязнений для пищевых продуктов производится подобным же образом (выложенный патент Японии 4-64063, Method of Detecting Food Contaminating Bacteria).
В случае определения количества загрязнения окружающей среды часто приготавливаются различные виды реагентов для взаимодействия с использованием речной воды и экстрактов почвы в качестве образцов для детектирования веществ-объектов (выложенный патент Японии 9-72898, Method of Analyzing Soils).
Способы, в которых эти взаимодействия для определения осуществляются в кристалле, то есть некоторые реакционно-способные реагенты и стандартные реагенты смешиваются с образцами в кристалле для осуществления взаимодействия, а образец после реакции анализируют, включая способы, описанные ниже.
Один из них является способом, в котором заданные количества растворов пробы и реагентов взвешиваются вне пределов кристалла, а затем инжектируются в кристалл. Кроме того, существует метод, в котором в кристалле создается канал (резервуар) с заранее заданным объемом, такой как мерный цилиндр, и поступающая жидкость точно контролируется посредством сочетания насоса с клапанами или приложения электрического поля, тем самым взвешивая и смешивая образец и раствор реагента в кристалле (например, A. Manz et al., Trends Anal. Chem., Vol. 10, 144, 1991).
Далее, существует способ, в котором пробу и раствор реагента выливают в камеру и смешивают для осуществления реакции, с последующим взвешиванием их заданного количества для разделения компонентов и количественного анализа каждого из разделенных компонентов (S.C. Jacobson et al., Anal. Chem., Vol. 6, 4127, 1994). В любом из этих способов требуется процесс взвешивания пробы и раствора реагента или их смеси, и способ, в котором анализ осуществляется при непрерывном поступлении жидкости и при постоянном отношении скоростей потока, не был предложен.
С другой стороны, также была предложена концепция смешивания двух жидкостей в заранее определенном отношении без операции взвешивания (патент США 5785831 (HP), выложенный патент Японии 8-261986 (патент Японии соответствует патенту США 5785831)).
Однако концепция заключается в простом смешивании двух жидкостей в расходящемся канале, и она не включает концепцию осуществления заданного химического взаимодействия непрерывно и с использованием этого взаимодействия для определения конкретных веществ. Подобным же образом, были также предложены способы, в которых используется взаимодействие вблизи границы раздела между двумя ламинарными потоками, вступающими в контакт друг с другом при заданной скорости потока (WO 9739338, патент США 5716852, WO 9747390).
Однако, также и в этом случае, это, в основном, является средством для экстрагирования или измерения необходимых молекул и частиц с использованием различия в скорости диффузии, связанной с различием в размерах частиц и молекул, содержащихся в каждом потоке, а заданное химическое взаимодействие не осуществляется.
Кроме того, существуют примеры осуществления необходимых химических взаимодействий без операций взвешивания (J. Micromech, Microeng. 4, 246-256 (1994), Verpoorte E. M.J. // Manz A., deRooij N. F. INTERFACIAL DESIGN AND CHEMICAL SENSING, Chapter 21, pp.244-254, America Chemical Society (1994)). То есть два или более кристалла из кремния, имеющих канавки на поверхности, накладываются один на другой с образованием капилляра, и раствор взаимодействующего реагента вводится с помощью насоса в капилляр при постоянной скорости потока, тем самым смешивая раствор пробы с раствором взаимодействующего реагента при заданном отношении и осуществляя взаимодействие в капилляре.
Однако в этом методе раствор образца просто смешивается с раствором взаимодействующего реагента в заданном соотношении, и при реальном осуществлении процессов он существенно не отличается от загрузочной системы, в которой раствор пробы и раствор взаимодействующего реагента вводятся в емкость для смешивания в заданном отношении.
Далее, в структуре, подобной этой, имеющей множество кристаллов, перекрываемых один другим, канал имеет трехмерную структуру, при этом делая сложным прохождение вверх шаг за шагом в канале и получение измеренных значений при различном времени взаимодействия. То есть определение количества может быть осуществлено в конечной точке ферментативной реакции, но является сложным определение количества в кинетическом исследовании, в котором количество фермента определяется по скорости реакции.
Для анализаторов научно-исследовательские и конструкторские работы, направленные на анализы НМЛ, в настоящее время интенсивно развиваются, включая тот факт, что предложены кристаллы, содержащие капилляры. Однако, как описано выше, материал кристалла, содержащего капилляры, в настоящее время представляет собой стекло и кремний, к которому должна применяться прецизионная обработка с высокой степенью точности. По этой причине стоимость производства является высокой, и существуют также те недостатки, что кристалл легко раскалывается, и необходимо осторожное обращение. Более того, при использовании в медицинской диагностике кристалл может соприкасаться с пробами, взятыми у пациентов, такими как кровь, и поэтому является желательным, чтобы кристалл, содержащий капилляр, был заменяемым, но материал стекла является негорючим, и поэтому возникают также проблемы с переработкой отходов.
Кроме того, рассматривая анализатор, объединяющий устройство с каналом и детектирующее устройство, для способа, использующего явления люминесценции, характеристика сходимости света не является высокой, поскольку испускаемый свет расходится во всех направлениях.
Из способов, использующих явления люминесценции, реакции с хемилюминесценцией имеют преимущества высокой скорости и высокой чувствительности и относительно недорого устройства, поскольку для определения не требуется источника света, но имеет те недостатки, что люминесценция быстро затухает, реагенты являются нестабильными, фон является высоким.
Далее, подобным же образом, флуоресцентный способ имеет то преимущество, что его система реакций является известной в течение длительного времени, но он требует в качестве части оптических систем источники возбуждения света и оптические фильтры для разделения возбуждающего света и флуоресценции.
Кроме того, флуоресцентный способ не является пригодным для использования в случае, в котором определяется малое количество пробы в тонком капилляре для использования в настоящем изобретении, поскольку выход испускаемой флуоресценции является низким.
Также, абсорбциометрический метод имеет тот недостаток, что возникает необходимость получения большой длины оптического пути для того, чтобы получить точные результаты, и особенно длинный оптический путь получается при определении малых количеств проб, при этом структура ячеек детектирования становится сложной, поскольку в принципе детектируется отношение падающего света к проходящему свету.
Таким образом, анализаторы, детектирующие малое количество проб в тонком капилляре для использования в настоящем изобретении, которые являются простыми в обращении и экономичными и способны производить анализ с высокой чувствительностью и могут подвергаться миниатюризации, не являются доступными, а анализаторы, пригодные для использования для анализов НМЛ, являются желательными в настоящих обстоятельствах.
С другой стороны, бумажные тесты, которые делают возможным детектирование уровня сахара в крови и тому подобное путем растворения твердых реагентов (реагентов, полученных сушкой вымораживанием, или бумаги и волокон, пропитанных заданным количеством реагентов) в пробе, использующем только плазму, имеются на рынке. Эти твердые реагенты являются удобными, поскольку нет необходимости взвешивать реагенты, но имеют тот недостаток, что они имеют плохую количественную точность по сравнению с жидкими реагентами.
Далее, способы, в которых проба и реагент взвешивают вне пределов кристалла и после этого вводят в кристалл для осуществления взаимодействия с целью детектирования, не только требуют больших затрат труда, но также приводят к получению отходов, дополнительных к отходам кристаллов. Кроме того, в случае, когда человек не взвешивает пробу и реагент, в дополнение к кристаллу требуется система взвешивания, таким образом, приводя в целом к большому объему оборудования. Далее, является необходимым создание в кристалле канала для взвешивания пробы и реагента, при этом канал в кристалле становится более сложным, и его стоимость повышается. Кроме того, эти способы имеют тот недостаток, что введение операции взвешивания пробы и реагента ведет к усложнению процесса анализа, безразлично, на внутренней или на внешней стороне кристалла. Далее, известные из уровня техники устройства требуют дополнительных средств для регулировки временного графика для каждого процесса, который является непрерывным, и требуют точного контроля времени из-за процессов загрузочного типа для введения пробы и детектирования.
Анализатор согласно настоящему изобретению содержит кристалл, включающий в себя капилляр, который является простым в обращении, способным иметь сложную структуру и превосходным по надежности, заменяемости и может производиться серийно, и детектирующее устройство, которое легко подвергается миниатюризации и способно определять малые количества компонентов с высокой чувствительностью. Затем, задачей является создание анализатора, который является превосходным по рабочим характеристикам, компактным и недорогим, при этом заданное смешивание и химическая реакция осуществляются только в капилляре кристалла без взвешивания проб и реагентов, по отдельности, и точная настройка согласования по времени для каждого процесса из всех процессов не является необходимой.
Настоящее изобретение использует, по меньшей мере частично, органический полимер в качестве материала кристалла, содержащего капилляр, в котором течет флюид. Кристалл, выполненный из органического полимера, который формуется с хорошей точностью по размерам, является пригодным для использования при микроанализе, может быть произведен недорого и может быть легко переработан путем сжигания, и поэтому является пригодным для использования в качестве заменяемого кристалла. Далее, кристалл является простым в обращении, способным иметь сложную структуру, и является превосходным по надежности и при массовом производстве.
Кроме того, в настоящем изобретении скорости потока флюидообразной пробы и флюидообразных реагентов в капилляре, сформованном в кристалле, выполненном из органического полимера, контролируются при заданных значениях, соответственно, и эти флюиды протекают непрерывно, при этом флюидообразная проба соединяется с флюидообразным реагентом при заданной скорости потока. После соединения предусматривается капилляр, имеющий длину, необходимую и достаточную для того, чтобы дать возможность флюидам протекать в течение периода времени, необходимого для смешивания и взаимодействия при заданной скорости потока, для осуществления заданных операций, таких как смешивание, разбавление и химическое взаимодействие. С помощью этих средств заданные операции, такие как смешивание и разбавление множества флюидов, могут осуществляться без осуществления взвешивания (безразлично, на внутренней или внешней сторонах кристалла), давая возможность точного и простого осуществления необходимого химического взаимодействия без требования точной настройки согласования по времени для каждого процесса среди всех процессов.
Кроме того, когда продукт взаимодействия, получаемый с помощью указанных выше средств, облучается светом возбуждения, фокусируемым линзой объектива, происходит изменение физической величины, сопровождающее частичное изменение температуры (фототермический эффект) из-за возбуждения и поглощения, более конкретно изменение коэффициента преломления. С помощью этого анализатора, содержащего детектирующее устройство (детектирующее устройство с тепловой линзой), которое измеряет это изменение с использованием детектируемого света, излучаемого в дополнение к свету возбуждения, является возможным измерение концентрации веществ, которые необходимо определять, что является сложным для измерения с помощью средств, известных из уровня техники, из-за того, что оптический путь является настолько же малым, как и вертикальная ширина кристалла (угол не обязательно является прямым углом по отношению к поверхности кристалла), а именно настолько же малым, как и глубина канавки (от около 1 до 1000 мкм).
Однако обычно используемый способ определения с тепловой линзой представляет собой общий способ определения веществ в микрообъемах, но в этом способе для улучшения абсолютной чувствительности относительно того, сколько молекул может быть обнаружено как минимум, свет возбуждения фокусируется настолько, насколько это возможно, с помощью линзы объектива, и сходится в растворе образца, таким образом, уменьшая толщину формируемой тепловой линзы.
Например, в одном из обычных способов определения с тепловой линзой ("Development of Integrated Liquid Phase Chemical Analysis System Using Micro Chanell on Glass Substrate and Thermal Lens Microspectrometry (I)" (Japan Analytical Chemistry, Abstracts of 44th Annual Meeting, p.119, 1995) by Kawanishi et al.) описывается, что диаметр луча света возбуждения около фокуса уменьшается до около 4 мкм путем установки увеличения микроскопа в 70 раз, и диаметр луча света возбуждения может быть дополнительно уменьшен до порядка долей микрона путем установки увеличения микроскопа в 280 раз.
Однако в этих обычных способах определения с тепловой линзой чувствительность по концентрации при определении количества веществ в заданном объеме раствора пробы является низкой.
Для медицинской диагностики и анализа окружающей среды является важным, чтобы чувствительность по концентрации, а не абсолютная чувствительность была высокой. Затем авторы настоящего изобретения обнаружили, что чувствительность по концентрации увеличивается при уменьшении степени сгущения света и увеличения размера тепловой линзы приблизительно до площади поперечного сечения канала, в противоположность обычным способам определения с тепловой линзой, таким образом, делая возможным определение веществ с высокой чувствительностью даже в капилляре, имеющем малую площадь поперечного сечения, которое делает возможным стабильный электроосмотический поток.
Кроме того, когда кристалл, выполненный из органического полимера, содержащий капилляр, применяется в описанном выше детектирующем устройстве с тепловой линзой, фоновый сигнал на выходе в способе определения с тепловой линзой возрастает в зависимости от материала кристаллов. В случае материала-стекла, который обычно используется, стекла, у которых коэффициент пропускания за исключением отраженного лазерного света для использования в способе определения с тепловой линзой (например, He-Ne лазер (длина волны: 633 нм), Аr лазер (длина волны: 488 нм), полупроводниковый лазер (например, длина волны: 780 нм)) составляет не ниже, чем 99%, или почти равно 100%, легко получаются как обычные доступные коммерческие продукты. Таким образом, не возникает проблем в осуществлении способа определения с тепловой линзой.
Однако, что касается органических полимеров, обычные доступные коммерческие продукты содержат добавки, пластификаторы, стабилизаторы и тому подобное, и полимеры, имеющие такой же высокий коэффициент пропускания, как стекло, в целом не являются доступными. Поэтому было обнаружено, что базовые материалы, выполненные из органического полимера, применимые в детектирующем устройстве с тепловой линзой, являются ограниченными. В частности, существует поглощение света возбуждения на оптическом пути света возбуждения, которое оказывает сильное влияние на детектирующее устройство с тепловой линзой. Поэтому приемлемый диапазон величин поглощения был установлен с помощью экспериментов.
То есть анализатор согласно настоящему изобретению представляет собой анализатор для флюидообразных проб или флюидообразных проб и флюидообразных реагентов, протекающих в капилляре для анализа заданных компонентов в описанных выше пробах или в смешанном флюиде из указанных выше проб и указанных выше реагентов, причем согласно изобретению анализатор состоит из кристалла, конфигурированного, по меньшей мере частично, из органического полимера и содержащего описанный выше капилляр и фототермическое детектирующее устройство для облучения описанных выше заданных компонентов светом возбуждения для измерения изменения физической величины, сопровождающего возникающее в результате частичное изменение температуры в указанном выше капилляре.
Далее, флюид согласно настоящему изобретению обозначает вещества, имеющие текучесть, в дополнение к жидкости и газу.
Кроме того, что касается флюидообразной пробы, которая должна протекать в капилляре, может протекать только проба, и проба может быть смешана с флюидообразным носителем, или проба может быть смешана с флюидообразным реагентом, который должен протекать в капилляре, настолько, насколько смешанный продукт является флюидом.
Они могут быть смешаны перед тем как они вводятся в капилляр, или каждый из них может быть введен в капилляр индивидуально, а затем смешиваться в капилляре.
Описанный выше кристалл может быть получен с помощью ламинирования пары плоских пластинчатых элементов, по меньшей мере, один из которых включает канавки на плоской поверхности и, по меньшей мере, один из которых выполнен из органического полимера, с описанной выше плоской поверхностью, включающей канавки, находящиеся на их внутренней стороне.
Далее, относительно пары описанных выше элементов, оба из них могут быть выполнены из органического полимера, или только один из них может быть выполнен из органического полимера. Однако является желательным, чтобы описанный выше плоский пластинчатый элемент, который включает канавки, был выполнен из органического полимера.
Кроме того, рассматривая описанное выше изменение физической величины как изменение коэффициента преломления, описанное выше фототермическое детектирующее устройство может быть устройством, предоставляющим возможность определяемому свету в тепловой линзе, формируемой с помощью описанного выше изменения коэффициента преломления, быть использованным для измерения изменения описанного выше определяемого света, вызванного описанной выше тепловой линзой.
Является желательным, чтобы элемент, составляющий описанный выше кристалл, не оказывал существенного влияния на фототермический эффект из-за поглощения описанного выше света возбуждения.
Например, является желательным, чтобы элемент, составляющий описанный выше кристалл, имел коэффициент поглощения описанного выше света возбуждения, равный 5% или менее.
Далее, является желательным, чтобы степень сгущения описанного выше света возбуждения была заранее установлена таким, чтобы частичное изменение температуры в описанном выше капилляре происходило в диапазоне, в котором может быть получена чувствительность по концентрации, достаточная для анализа описанных выше заданных компонентов.
Однако, более предпочтительно, чтобы оптическая ось описанного выше света возбуждения была перпендикулярной к направлению потока описанной выше пробы и описанной выше смеси флюидов, и степень сгущения описанного выше света возбуждения является заранее установленной таким образом, чтобы частичное изменение температуры в описанном выше капилляре происходило в диапазоне, в котором может быть получена чувствительность по концентрации, достаточная для анализа описанных выше заданных компонентов, в поперечном сечении, перпендикулярном к описанному выше направлению потока и включающем описанную выше оптическую ось.
Далее, оптическая ось описанного выше света возбуждения может быть наклонной по отношению к направлению потока описанного выше образца и описанного выше смешанного флюида.
Далее, степень конденсации описанного выше света возбуждения может быть установлена с использованием числовой апертуры линзы объектива, облучающего описанный выше капилляр описанным выше светом возбуждения.
Далее, описанный выше капилляр анализатора согласно настоящему изобретению может иметь конфигурацию, имеющую каналы для пробы, предназначенные для протекания описанной выше пробы, и каналы для осуществления описанного выше измерения, и в дополнение к ним, имеющую, по меньшей мере, одно средство для смешивания реагентов между описанными выше каналами для проб и каналами для осуществления описанного выше измерения;
где описанные выше средства для смешивания реагентов состоят из, по меньшей мере, одного канала для реагента, предназначенного для протекания описанного выше реагента, пересечения флюида, протекающего со стороны описанного выше канала для пробы, и реагента, протекающего из описанного выше канала для реагента, и канала для смешивания, расположенного после этого слияния, предназначенного для смешивания флюида, протекающего со стороны описанного выше канала для пробы, и реагента, протекающего из описанного выше канала для реагента, при заданной скорости потока, для осуществления взаимодействия в течение заданного периода времени,
в случае, когда количество описанных выше средств для смешивания реагента равно двум или более, каждое из средств для смешивания реагентов расположено последовательно, и
содержится механизм, регулирующий скорость потока, для установки скорости потока в описанном выше канале для пробы и в описанном выше канале для реагента в соответствии с описанным выше отношением смешивания.
В случае такой конфигурации описанная выше проба и описанный выше реагент протекают непрерывно в описанном выше капилляре, и описанный выше канал для смешивания может быть каналом с длиной, достаточной для того, чтобы флюид, слившийся как раз перед его пересечением, протекал в течение периода времени, необходимого для завершения заданного смешивания и взаимодействия при заданной скорости потока.
Далее, описанная выше проба или описанный выше образец и реагент могут протекать при помощи приложения разности напряжений к описанной выше пробе или приложения напряжения к описанной выше пробе и реагенту по отдельности.
Далее, описанная выше проба может быть пробой, происходящей из биологического материала.
Далее, в случае, когда описанный выше кристалл состоит из пары описанных выше плоских пластинчатых элементов, один из пары плоских пластинчатых элементов может быть плоским пластинчатым элементом, выполненным из органического полимера, который формуется с использованием одного из способов: прессования в форме, способа формования тиснением, способа литьевого формования, способа литьевого формования, в котором температура стеклования смолы понижается в присутствии газа, компрессионного литьевого формования и литьевого формования с использованием нагрева поверхности формы с помощью электромагнитной индукции, или их комбинации.
В этом случае газ, используемый в описанном выше способе литьевого формования, в котором температура стеклования смолы понижается в присутствии газа, может быть двуокисью углерода.
Таким образом, анализатор согласно настоящему изобретению определяет заданный компонент с помощью способа фототермического определения, с использованием системы детектирования устройства фототермического детектирования после того, как осуществляется заданное смешивание и взаимодействие, без взвешивания пробы и реагента в кристалле. При использовании способа фототермического детектирования в качестве способа детектирования малые количества заданного компонента могут определяться с высокой чувствительностью. Далее, поскольку не является необходимым производить взвешивание, безразлично, на внутренней или внешней стороне кристалла, могут быть достигнуты не только превосходные рабочие характеристики устройства, но и его миниатюризация.
Фиг. 1 представляет собой схематическое изображение части анализатора с тепловой линзой на основе способа фототермического детектирования согласно настоящему изобретению;
фиг. 2 представляет собой блок-схему устройства для фототермического детектирования согласно настоящему изобретению;
фиг. 3 представляет собой конфигурацию каналов 1, предназначенную для приготовления заданного количества пробы;
фиг. 4 представляет собой конфигурацию каналов 2, предназначенную для приготовления заданного количества пробы;
фиг. 5 представляет собой схематическое изображение 1 канала, в котором множество флюидов сливаются друг с другом для получения разбавления, смешивания, производимых согласно настоящему изобретению;
фиг. 6 представляет собой схематическое изображение 2 канала, в котором множество флюидов сливаются друг с другом для получения разбавления, смешивания, производимых согласно настоящему изобретению;
фиг. 7 представляет собой схематическое изображение 3 канала, в котором множество флюидов сливаются друг с другом для получения разбавления, смешивания, производимых согласно настоящему изобретению;
фиг. 8 представляет собой схематическое изображение 4 канала, в котором множество флюидов сливаются друг с другом для получения разбавления, смешивания, производимых согласно настоящему изобретению;
фиг. 9 представляет собой схематическое изображение 1, показывающее конфигурацию канавок пластинчатого элемента, выполненного из органического полимера, имеющего на поверхности тонкие канавки, в которых течет флюид, которые формуются путем литьевого формования;
фиг. 10 представляет собой схематическое изображение 1, показывающее кристалл, который получают путем ламинирования пары пластинчатых элементов из органического полимера и на котором с помощью проводящей краски путем печати нанесены система проводников, электрод для захвата жидкости и электрод для присоединения к клеммам источника питания в детектирующем устройстве;
фиг.11 представляет собой вид в разрезе по линии а-а' фиг.10;
фиг. 12 представляет собой схематическое изображение канала, в котором в точке слияния боковые потоки сливаются под прямым углом с получением двух реагентов, слившихся друг с другом;
фиг. 13 представляет собой схематическое изображение канала, в котором в точке слияния боковые потоки сливаются под острым углом с получением двух реагентов, слившихся друг с другом;
фиг. 14 представляет собой схематическое изображение канала, в котором два или более реагентов сливаются в двух или более точках слияния;
фиг. 15 представляет собой таблицу, показывающую результаты измерений поглощения лазерного луча в материалах на основе полимера и выходной сигнал метода детектирования с тепловой линзой;
фиг. 16 представляет собой схематическое изображение, показывающее поперечное сечение устройства для формования, предназначенного для формования пластинчатого элемента из органического полимера, имеющего на поверхности тонкие канавки, по которым течет флюид;
фиг. 17 представляет собой вид сверху (а), показывающий прецизионную форму для формования (переноса) канала, состоящего из канавок, выполненных на поверхности элемента матрицы формы для формования, предназначенной для формования пластинчатого элемента из органического полимера, имеющего на поверхности тонкие канавки, по которым течет флюид согласно настоящему изобретению, и вид в разрезе (b), показывающий форму поперечного сечения по линии а-а' прецизионной формы, и вид в разрезе (с), показывающий форму поперечного сечения по линии b-b';
фиг. 18 представляет собой схематическое изображение 2, показывающее конфигурацию канавок пластинчатого элемента из органического полимера, имеющего на поверхности тонкие канавки, по которым течет флюид и которые формуются с помощью литьевого формования;
фиг. 19 представляет собой схематическое изображение 2, показывающее кристалл, полученный путем ламинирования пары пластинчатых элементов из органического полимера, и на котором с помощью проводящей краски путем печати нанесены система проводников, электрод для захвата жидкости и электрод для присоединения к клеммам источника питания в детектирующем устройстве;
фиг.20 представляет собой вид в разрезе по линии с-с' фиг.19;
фиг.21 представляет собой блок-схему устройства для детектирования с тепловой линзой, используемого в варианте воплощения;
фиг. 22 представляет собой диаграмму, показывающую взаимосвязь между положением фокуса лазера по отношению к капилляру устройства детектирования с тепловой линзой и выходным сигналом в способе детектирования с тепловой линзой;
фиг. 23 представляет собой схематическое изображение 3, показывающее конфигурацию канавок пластинчатого элемента из органического полимера, имеющего на поверхности тонкие канавки, по которым течет флюид, который сформован с помощью литьевого формования;
фиг. 24 представляет собой схематическое изображение 3, показывающее кристалл, полученный путем ламинирования пары пластинчатых элементов из органического полимера, и на котором с помощью проводящей краски путем печати нанесены система проводников, электрод для захвата жидкости и электрод для присоединения к клеммам источника питания в детектирующем устройстве;
фиг.25 представляет собой вид в разрезе по линии а-а' фиг.24;
фиг. 26 представляет собой диаграмму, показывающую взаимосвязь между концентрацией холестерина и выходным сигналом в способе детектирования с тепловой линзой в примере 3; и
фиг. 27 представляет собой диаграмму, показывающую взаимосвязь между концентрацией холестерина и выходным сигналом в способе детектирования с тепловой линзой в примере 4.
Анализатор согласно настоящему изобретению включает в себя кристалл, содержащий капилляр и детектирующее устройство.
Кристалл состоит из пары плоских пластинчатых элементов из полимера, и на поверхности, по меньшей мере, одного из элементов выполнены канавки, по которым текут флюиды. Эти плоские пластинчатые элементы ламинируются друг с другом, при этом канавка находится на его внутренней стороне и образует капилляр. Этот капилляр имеет канал для пробы и канал, по меньшей мере, для одного вида раствора реагента, а также точку слияния, в которой такие каналы сливаются последовательно или одновременно. Далее, этот капилляр имеет после точки слияния в канале участок с заданной длиной, требуемой для смешивания и химического взаимодействия описанной выше пробы и описанного выше раствора реагента, или превышающей ее, а также имеет структуру, в которой этот канал соединяется с каналом для осуществления измерений. Поскольку эти пробы и раствор реагента необходимо контролировать с тем, чтобы они поступали при заданной скорости потока, описанный выше анализатор имеет конфигурацию, соответствующую этому требованию. То есть конфигурацию, при которой описанная выше проба и описанный выше раствор реагента течет в капилляре при заданной скорости потока.
Затем, детектирующее устройство содержит механизм для излучения света возбуждения и детектируемого света и состоит из системы оптического детектирования на основе способа фототермического детектирования (например, Analysis No. 4, 280-284 (1997)).
(Полимерные кристаллы)
В настоящем изобретении, форма поперечного сечения канавки, образованной на поверхности кристалла, включает в себя многоугольные формы, такие как четырехугольник и треугольники, полукруги и полуэллипсы, и не является специально ограниченной. Кроме того, кристалл может иметь на поверхности канал, состоящий из сочетания нескольких видов канавок различных форм. Ширина верхней поверхности (открытой поверхности) канавки может быть такой же или большей, чем у нижней поверхности (дна) канавки. Далее, для более простого и точного применения средств детектирования на основе фототермического способа, описанного ниже, является желательным, чтобы форма поперечного сечения канавки была четырехугольной.
Если эта канавка является слишком малой, поток может возмущаться мелкими частицами. Кроме того, если она является слишком большой, не только площадь поверхности плоского пластинчатого элемента должна увеличиваться, когда множество каналов делаются на поверхности одного кристалла, но также возникает проблема относительно диффузионной длины, когда смешивание осуществляется с помощью диффузии. Таким образом, предпочтительно, чтобы ширина канавки составляла от 1 до 1000 мкм, глубина составляла от 0,1 до 1000 мкм и площадь поперечного сечения составляла от 1 до 1000000 мкм2. Более предпочтительно, чтобы ширина канавки составляла от 2 до 500 мкм, глубина составляла от 1 до 500 мкм, площадь поперечного сечения составляла от 2 до 250000 мкм2, еще более предпочтительно, чтобы ширина канавки составляла от 2 до 200 мкм, глубина составляла от 1 до 200 мкм, и площадь поперечного сечения составляла от 2 до 40000 мкм2.
Для плоского пластинчатого элемента из органического полимера согласно настоящему изобретению точность размера канавки, которую элемент имеет на своей поверхности, специально не ограничивается. Однако, при осуществлении анализов ультрамикрокомпонентов и количественного анализа, точность размеров предпочтительно является хорошей. То есть для достижения точности работы и воспроизводимости среди отдельных анализаторов точность размера канавки предпочтительно имеет точность размера (точность соблюдения размера при переносе) в пределах ±5% по ширине и глубине и в пределах ±7% по площади поперечного сечения для выпуклой конфигурации формы (переносится при формовании, при этом, в случае плоского пластинчатого элемента, формируются канавки). Для осуществления количественного анализа с высокой точностью является еще более предпочтительным, чтобы точность размеров составляла в пределах ±2% по ширине и глубине и в пределах ±4% по поперечному сечению.
Кристалл, включающий капилляр, согласно настоящему изобретению получается путем ламинирования двух плоских пластинчатых элементов, по меньшей мере, один из которых имеет на своей поверхности канавку, в который течет флюид, и при этом описанная выше канавка находится на их внутренней стороне, с использованием ультразвукового соединения, теплового соединения, адгезии с помощью адгезивов, таких как расплавляемые адгезивы и УФ адгезивы, адгезии со склеиванием с помощью склеивающего агента, соединение прессованием, осуществляемого непосредственно или через тонкий эластичный лист. В любом случае, используется вакуумный ламинатор, предоставляющий возможность осуществления обжима в вакуумной системе, и способы, в которых обжим осуществляется от центра к периферии, при этом используют отталкивание пузырей для предотвращения захвата пузырьков во время ламинирования.
В качестве плоского пластинчатого элемента, не имеющего канавок (далее упоминается как "покрывающая пластина"), могут быть использованы плоские пластинчатые листы из смолы, такой как метакриловая смола, поликарбонат и полистирол, или стеклянные листы (тонкая стеклянная пластинка), и тому подобное. Толщина этих листов специально не ограничивается, если только не возникает проблем с фототермическим анализом, таких как проблема с поглощением света, описанных ниже, но предпочтительно она находится в диапазоне от 0,05 до нескольких мм.
Кроме того, кристалл имеет отверстие для введения пробы или реагента и установки электрода в одном из двух плоских пластинчатых элементов, которые будут ламинироваться, в виде сквозного отверстия. Является желательным, чтобы сквозное отверстие было предусмотрено в конце каждого канала плоского пластинчатого элемента или было предусмотрено в части другого плоского пластинчатого элемента, который должен ламинироваться, которая соединяется с описанным выше концом каждого канала. Размер сквозного отверстия не является специально ограниченным, но диаметр отверстия предпочтительно находится в диапазоне от 0,1 до нескольких мм.
Технологичность при формовании является важным элементом при выборе материала на основе органического полимера, используемого для плоского пластинчатого элемента, имеющего канавки. Материалы, которые могут предпочтительно быть использованы с точки зрения технологичности при формовке, включают в себя прозрачные термопластичные смолы, к которым может быть применен общий процесс плавления, и прозрачные смолы, получаемые с помощью УФ отверждения и теплового отверждения. Более того, первое является более предпочтительным для того, чтобы плоские пластинчатые элементы, имеющие канавки на поверхности, могли получаться в больших количествах и недорого. Из этих смол предпочтительными являются некристаллические термопластичные смолы, термопластичные сплавы полимеров, имеющие некристаллическую смолу в качестве главного компонента, или часть кристаллических термопластичных смол, имеющих низкую долю кристалличности. Смолы, которые, в частности, могут быть использованы предпочтительно, являются жесткими смолами, конкретно включая смолы типа стирола, такие как полистирол и сополимеры стирола-акрилонитрила, метакриловые смолы, такие как полиметилметакрилат (ПММА) и сополимеры метилметакрилата-стирола, поликарбонат (ПК), полисульфон, простой полиэфирсульфон, простой полиэфиримид, полиарилат, полиметилпентен, поливинилхлорид, полициклогексадиен и полиэстер.
Также, предпочтительно используются полимеры типа 1,3-циклогексадиена. Полимеры типа 1,3-циклогексадиена могут быть гомополимерами, но могут также использоваться и сополимеры. Эти сополимеры включают в себя сополимеры алифатических мономеров с сопряженными диенами, таких как 1,3-бутадиен, изопрен, 1,3-пентадиен и 1,3-гексадиен, ароматические виниловые мономеры, такие как стирол, α- метилстирол, р-метилстирол, 1,3-диметилстирол, винилнафталин и винилстирол, полярные виниловые мономеры, такие как метилметакрилат, метилакрилат, акрилонитрил, метилвинилкетон и метил α- цианакрилат, или полярные мономеры, такие как этиленоксид, пропиленоксид, циклический лактон, циклический лактам и циклический силоксан, или мономеры типа этилена или α- олефина. Отношение сополимеризации в этом случае составляет предпочтительно 1,3-циклогексадиеновый мономер/сомономер = от 75/25 до 100/0 по массе. Полимеры типа циклогексадиена с высоким коэффициентом пропусканием света подробно описаны в заявке на патент Японии 9-277045. Такие полимеры могут также детектироваться с помощью источника света с короткой длиной волны, поскольку они имеют малое поглощение на длине волны 200 нм или больше в виде материалов и они являются аморфными С-Н полимерами.
У кристаллов согласно настоящему изобретению, которые выполнены из этих полимерных исходных материалов, каждый из пары плоских пластинчатых элементов, составляющих собой кристалл, состоит из материалов, которые делают возможным прохождение света, и, по меньшей мере, один из двух плоских пластинчатых элементов состоит из материала, который дает возможность прохождению света возбуждения. Анализатор согласно настоящему изобретению состоит из такого кристалла и детектирующего устройства на основе фототермического преобразования, тем самым является возможным детектирование с высокой чувствительностью даже веществ-объектов детектирования, имеющих поглощение только в ультрафиолетовой области, которые представляют сложности для измерений с помощью анализатора, использующего обычные кристаллы из смолы, и его универсальность является высокой. Это обстоятельство является очень важным при использовании для анализов, предназначенных для медицинской диагностики, поскольку многие биологические вещества имеют поглощение только в ультрафиолетовой области (то есть являются бесцветными для глаза человека).
Теперь будут представлены несколько дополнительных объяснений относительно анализа веществ, имеющих поглощение только в ультрафиолетовой области. Органический полимер (смола) превосходит стекло в качестве материала для кристалла в отношении технологичности, стоимости и переработки отходов. Однако органический полимер, как правило, имеет поглощение в ультрафиолетовой области. Таким образом, когда определяют вещество-объект с использованием абсорбциометрического способа, который является общим способом детектирования, поглощение материала кристалла является настолько большим, что корректно измеренное значение не может быть получено. Более того, при длине оптического пути в 100 мкм или около этого является трудным определение малого количества компонента, даже если используется такая длина волны, на которой материал кристалла не поглощает. Детектирование может осуществляться с помощью флуоресценции, но вещества-объекты детектирования при этом ограничиваются веществами, испускающими флуоресценцию, что ведет к ограничению универсальности.
Наоборот, для способа детектирования с фототермическим преобразованием длина волны детектируемого света может свободно выбираться среди длин волн, которые органическое вещество не поглощает настолько, насколько свет возбуждения поглощается в веществе-объекте. В кристалле, состоящем из пары плоских пластинчатых элементов, когда оба плоских пластинчатых элемента являются "прозрачными" для детектируемого света с длиной волны, которая не поглощается органическим полимером (как правило, видимый свет), и один из пары плоских пластинчатых элементов имеет коэффициент прохождения, дающий возможность прохождения достаточного количества света возбуждения, так что вещество-объект возбуждается, могут осуществляться измерения общего назначения. Одним из конкретных примеров является случай, где толщина плоского пластинчатого элемента, имеющего канавки, находится в пределах от около 1 до 5 мм, плоский пластинчатый элемент (покрывающая пластинка), который будет ламинироваться с плоским пластинчатым элементом, имеющим канавки, является тонким листом с толщиной от около 500 мкм или менее, и этот лист состоит из материала, имеющего высокий коэффициент пропускания для света возбуждения. В этом случае свет возбуждения поступает со стороны тонкого листа, предоставляя возможность детектирования вещества-объекта детектирования с высокой чувствительностью, даже если плоский пластинчатый элемент, имеющий канавки, имеет низкий коэффициент пропускания для света возбуждения.
Органический полимер, предназначенный для использования согласно настоящему изобретению, должен быть смолой, имеющей прозрачность для света с длинами волн, используемыми в фототермическом способе. Принимая во внимание потери мощности лазера, желательными являются материалы, имеющие пропускание 80% или более высокое, предпочтительно, 90% или более высокое, на длинах волн возбуждения и детектирования для лазера, используемого при фототермическом детектировании. Учитывая длину волны лазера для возбуждения и детектирования, как правило, материалы, имеющие коэффициент пропускания света 80% или более высокий, предпочтительно 90% или более высокий, являются желательными при измерениях в диапазоне длин волн от 600 до 800 нм, предпочтительно от 400 до 800 нм, согласно ASTM D1003.
Указанный выше коэффициент пропускания света является величиной, получаемой путем вычитания суммы коэффициента отражения на поверхности кристалла и его коэффициента поглощения органического полимера из 100%. Свет, рассеиваемый на поверхности кристалла, не оказывает воздействия на органический полимер, в то время как свет, поглощаемый органическим полимером, обладает воздействием, приводя к генерации тепла в органическом полимере. Следовательно, эффект, подобный тепловой линзе, производится, когда свет проходит через органический полимер, что ведет к появлению фона в выходном сигнале способа детектирования с тепловой линзой, тем самым вызывая ошибку в измерениях. Таким образом, необходимо оценивать материал органического полимера перед изготовлением реального кристалла и определять диапазон коэффициента поглощения, не имеющего воздействия на реальный способ детектирования с тепловой линзой.
В случае детектирования с помощью поглощения, если около 10% поглощается органическим полимером, общее количество света сокращается только до 90%, оказывая только небольшое влияние на чувствительность детектирования. Однако, в случае фототермического способа детектирования, даже 10% или менее поглощения имеет значительное воздействие на измерение из-за тепловой линзы, формируемой в смоле.
С точки зрения измерений, представленных в примерах, описанных ниже, в случае, когда анализатор с тепловыми линзами согласно настоящему изобретению используется для применения, предназначенного для осуществления количественных измерений, доказано, что процент света возбуждения, поглощенного органическим полимером на всем оптическом пути, на котором свет возбуждения проходит через кристалл, должен составлять 5% или менее.
Однако в случае, когда требуется высокая чувствительность измерения, например в случае, когда концентрация измеряемого объекта является низкой и капилляр является тонким (канавка является мелкой), даже небольшая величина поглощения может привести к появлению фона, который имеет отрицательное воздействие на измерение веществ в капилляре.
В случае, когда объект измерения является компонентом крови и в качестве реагентов используется доступный в продаже набор реагентов, часто проводятся измерения, в которых коэффициент поглощение для 1 см кюветы составляет около 0,1. Полагая, что это измерение производится с использованием кристалла из органического полимера согласно настоящему изобретению, которое содержит 50 мкм капилляр (то есть длина оптического пути составляет 50 мкм), коэффициент поглощения 0,1 для длины оптического пути 1 см является эквивалентом 0,103% для коэффициента поглощения в случае 50 мкм капилляра. Коэффициент поглощения был бы 1%, если бы поглощение в кристалле из органического полимера (образование тепловой линзы) было бы в 10 больше, и коэффициент поглощения был бы 0,2%, если бы поглощение было бы 2 раза больше.
То есть для проведения измерения, в котором коэффициент поглощения для длины оптического пути 1 см составляет около 0,1 с использованием анализатора согласно настоящему изобретению, является желательным, чтобы поглощение света органическим полимером, образующим кристалл, было 1% или меньше, более предпочтительно 0,2% или меньше.
Однако эти величины могут изменяться в зависимости от наборов реагентов и различий в длине капилляров. Например, увеличение коэффициента поглощения для 1 см кюветы до около 0,5 не является особенно сложным с использованием современных технологий. В этом случае коэффициент поглощения для 50 мкм капилляра является эквивалентом 0,342%, и коэффициент поглощения был бы около 3,5%, если бы коэффициент поглощения кристалла из органического полимера (образование тепловой линзы) возрос до 10 раз, и коэффициент поглощения был бы немного меньшим, чем 1%, если бы оптическая плотность возросла до 2 раз.
Также, что касается детектируемого света, из опасений относительно изменения его собственного оптического пути из-за поглощения, является желательным, чтобы, подобным же образом, процент света, поглощаемого органическим полимером на всей оптической длине пути, который свет проходит через кристалл, был доведен до нескольких процентов или меньше.
Таким образом, доказывается, что в случае, когда анализ и измерения осуществляются с использованием способа детектирования с тепловой линзой, материал, составляющий кристалл, должен выбираться соответствующим образом. В случае либо света возбуждения, либо детектируемого света приемлемый коэффициент поглощения полимерной подложки изменяется в зависимости от концентрации или коэффициента поглощения измеряемых объектов. Таким образом, поглощение света возбуждения и детектируемого света материалом, составляющим кристалл, должно находиться на таком уровне, чтобы измерение с помощью способа детектирования с тепловой линзой не подвергалось какому-либо существенному влиянию. Рассматривая систему с биохимической реакцией в качестве примера, является желательным, чтобы коэффициент поглощения полимерной подложки составлял несколько процентов или меньше.
Плоский пластинчатый элемент, состоящий из органического полимера, выбранного на основе указанных выше критериев, может быть изготовлен с помощью таких методов, как процесс резания и процесс травления с помощью лазера и тому подобное, УФ отверждения и теплового отверждения мономеров и/или макромономеров в форме, и процесса плавления, и процесса пластификации термопластичной смолы. Методами формования, которые могут быть использованы предпочтительно, являются процесс плавления и процесс пластификации термопластичной смолы, с помощью которых плоский пластинчатый элемент, имеющий канавки на поверхности, может формоваться в больших количествах и недорого. Способы, которые могут быть использованы предпочтительно, кроме того, включают литьевое формование термопластичной смолы с использованием форм и/или способ прямого прессования и метод прессового формования. Способ литьевого формования, включая компрессионное литьевое формование, представляет собой способ формования, который является превосходным при массовом производстве и по экономии. Прямое прессование проигрывает при массовом производстве по сравнению с литьевым формованием, но дает возможность формирования формованной поверхности с хорошей воспроизводимостью. Конкретно, термопластичная смола, которая заранее формируется в форме пластинки, помещается в форму, а затем термопластичная смола нагревается до температуры размягчения с помощью нагреваемого пресса. Затем осуществляется прессующая компрессия (прессование) и формируется формованная поверхность, затем нагретому прессу дают возможность охладиться, и происходит охлаждение и отверждение термопластичной смолы при температуре размягчения или более низкой. В частности, способ литьевого формования, в котором литьевое формование производится при одновременном понижении температуры отверждения поверхности смолы, находящейся в контакте с формой, во время процесса заполнения смолой полости формы (выложенный патент Японии 10-128783, заявка на патент Японии 10-50719), может быть особенно предпочтительным способом формования, поскольку плоские пластинчатые элементы из органического полимера, имеющие тонкие канавки с высокой технологичностью, могут производиться с хорошей производительностью. Конкретные примеры этого способа литьевого формования включают способы, в которых перед осуществлением литьевого формования полость заполняется двуокисью углерода. Давление двуокись углерода предпочтительно составляет 10 мПа или ниже, а более предпочтительно, от 0,3 до 2 мПа, с учетом компромисса между предотвращением захвата газа и эффектом понижения температуры отверждения на поверхности смолы.
Кроме того, способы литьевого формования, в которых поверхность формы нагревается для осуществления формования, например способы литьевого формования, в которых поверхность формы нагревается с помощью высокочастотного индукционного нагрева непосредственно перед формованием (описывается в публикации Японского патента 62-58287, патенте США 4439492), и способы литьевого формования, в которых поверхность формы нагревается с помощью нагрева излучением непосредственно перед формованием (описывается Molding Symposia 1995, 241 <1995>, Molding 1996, 69 <1996>, Synthetic Resin, Vol. 42 (1), 48 <1992> и тому подобное), являются способами, предпочтительными при производстве плоских пластинчатых элементов из органического полимера согласно настоящему изобретению. Это вызвано тем, что описанные выше способы формования являются способами, в которых температура формования поддерживается низкой, и только поверхность формы селективно нагревается непосредственно перед формованием с помощью источника тепла, например высокочастотного индукционного нагрева и галогеновой лампы, таким образом, делая возможным достижение совместимости между воспроизводимостью поверхности формы и временем цикла формования.
Плоские пластинчатые элементы из органического полимера согласно настоящему изобретению могут также производиться на основе Method of Producing Circuit Board из выложенного патента Японии 6-283830. Согласно этому способу направление рассеянных частиц лучше ориентируется с помощью толстых резистов в вертикальном направлении, чем с помощью обычных тонких резистов, тем самым делая возможной более глубокую формовку с получением канавок с высоким соотношение по положению. Далее, может быть также применен способ, в котором подложка из смолы покрывается фоточувствительными резистами, и части, иные, чем канавки, подвергаются воздействию света с последующим удалением неотвержденных частей для формирования конфигурации резиста с канавками на подложке.
Что касается форм, предпочтительно могут быть использованы металлические формы, состоящие из материалов на основе железа или стали, содержащих железо в качестве главного компонента, алюминия или сплавов, содержащих алюминий в качестве главного компонента, сплавов цинка, сплавов бериллия - меди, никеля или им подобных, которые, как правило, используются для формования синтетической смолы.
Представим один из примеров способов изготовления формы. Сначала изготавливают одну матрицу, имеющую конфигурацию поверхности, соответствующую плоскому пластинчатому элементу из органического полимера, имеющему желаемые тонкие канавки, из такого материала, как металл, пластик, кремний или стекло, с помощью такого метода, как процесс резания и процесс травления, или процесса фотолитографии, из УФ-отверждаемой смолы. Затем из этой матрицы изготавливают форму с использованием электрохимического осаждения никеля.
Кроме того, форма может быть изготовлена с помощью описанного выше способа формирования конфигурации резиста, описанного в выложенном патенте Японии 6-283830. Конфигурация резиста формируется на металлической подложке, с последующим заполнением части, не имеющей резиста, с помощью осаждения металла. Затем резист удаляется для формирования металлической пластины, имеющей тонкую структуру, сформированную на поверхности подложки. Смолу можно обрабатывать с использованием этой пластины в качестве формы.
Кроме того, на кристалл, включающий плоский пластинчатый элемент из органического полимера, согласно настоящему изобретению в качестве обработки, ингибирующей адсорбцию белков, полиэтиленгликоль может быть нанесен на внутреннюю поверхность капилляра с помощью полимеризации. Кроме того, в случае, когда описанный ниже электроосмотический поток используется в качестве средства для ввода жидкости, поверхность капилляра может быть обработана раствором гидроксида натрия с тем, чтобы генерировать стабильный электроосмотический поток. Когда в качестве органического полимера используют ПММА, в частности, обработка гидроксидом натрия вызывает гидролиз сложного эфира на поверхности со снятием защиты с карбоновых кислот, при этом делая электроосмотический поток более сильным и стабильным, что является предпочтительным.
Кроме того, когда в качестве средств для введения жидкости используется электроосмотический поток (ЭОП), описанный ниже, кристалл может иметь на своей поверхности металлический электрод, состоящий из металлических игл, металлических пластин, металлической фольги и тому подобного, электрод из неорганического или органического полимера, к которому применена обработка, увеличивающая его проводимость, или электрод, нанесенный с помощью печати проводящей краской. В этом случае является предпочтительным, чтобы электрод, находящийся в контакте с резервуарами (в которые вводятся реагенты, пробы, буферы, сток жидкости и тому подобное), расположенными в капилляре и на конце или в некоторой средней точке капилляра, электрод, который может быть соединен с детектирующим устройством и проводники между электродами были также включены в кристалл.
В случае, когда вставляется металлическая игла, острие, игла, пистон из платины, меди, латуни, алюминия, железа или чего-то подобного, что имеет диаметр от 0,1 до 2,5 мм и длину, необходимую для достижения положения вблизи канавки плоского пластинчатого элемента, предпочтительно закрепляется в сквозном отверстии.
В случае нанесения печати проводящей краской электрод может быть сформирован, например, с помощью сеткографии, с использованием краски, содержащей мелкие частицы золота, серебра, меди, никеля, сажи, графита и тому подобного. Для нанесения с помощью печати электрода на внутреннюю стенку сквозного отверстия с помощью сеткографии может быть использована технология печати в сквозных отверстиях с помощью проводящей краски, с использованием устройства для сеткографии, которое применяется для продолжения каждого слоя современных многослойных печатных плат. Нанесение электрода с помощью печати в сквозном отверстии производится путем помещения образца, на котором должна производиться печать, на координатный стол, при этом сквозное отверстие образца позиционно совмещается с отверстием координатного стола, предназначенным для отсоса, и отсасываемая краска захватывается в окрестности сквозного отверстия, вызывая стекание краски по внутренне стенки сквозного отверстия во время нанесения электродов на образец с помощью печати или после него.
Золото или платина осаждается путем вакуумного осаждения и распыления, в случае либо всей внутренней стенки сквозного отверстия, либо ее части, или наносится с помощью печати достаточно глубоко для того, чтобы достигать положения вблизи канавки плоского пластинчатого элемента. В этом случае, если сквозное отверстие имеет форму конуса, электрод может быть сформирован на внутренней стенке сквозного отверстия без приведения плоского пластинчатого элемента в наклонное положение.
Кроме того, в дополнение к описанным выше электродам, электроды, предназначенные для соединения с клеммами источника питания в детектирующем устройстве, размещаются на кристалле, и проводники между этими электродами могут быть сформированы с использованием проводящей краски, вакуумного осаждения и нанесения распылением. Также они могут быть сформированы путем наклеивания тонкой пластинки, такой как медная пластинка, а затем формирования конфигурации проводников путем травления, и перенесение или наклеивание на пластину медной фольги, на которой сформирована конфигурация проводников.
Кроме того, путем формирования электродов и/или проводников на третьем плоском пластинчатом элементе и изготовленном элементе, ином, чем плоский пластинчатый элемент, имеющий канавки, и плоский пластинчатый элемент, который должен быть ламинирован с ним (покрывающая пластина), используя способ, описанный выше, а затем ламинируя этот третий плоский пластинчатый элемент и изготовленный элемент с ними, может быть создано устройство, снабженное электродами и/или проводниками.
В любом случае, материал и размеры должны быть выбраны таким образом, чтобы тепло, генерируемое, когда прикладывается высокое напряжение, могло контролироваться, чтобы оно не имело влияния на электрофорез.
(Флюиды)
Флюиды, которые настоящее изобретение предназначает для анализа, принципиально являются жидкостями и газами, и особенно водными растворами их всех. Могут обрабатываться органические растворители и газообразные вещества, но в любом случае они не должны вызывать коррозию, растворение, побеление смолы материалов кристалла и адгезивов. В случае электрического введения жидкости водные растворы являются особенно предпочтительными объектами.
(Тепловые линзы)
В кристалле анализатора согласно настоящему изобретению скорость потока пробы точно контролируется с помощью электроосмотического потока, электрофореза или других соответствующих средств. Затем, после того как проба разбавляется и взаимодействует с другими реагентами, если это необходимо, вещество-объект детектируется ниже по течению в его канале с использованием способов, описанных ниже.
Фиг. 1 демонстрирует принцип способа детектирования с использованием тепловой линзы, сформированной на основе фототермического эффекта. Когда проба облучается лучом лазера (свет возбуждения), сжатым с помощью линзы, тепло генерируется с помощью света возбуждения от объекта измерения, содержащегося в пробе (фототермический эффект), коэффициент преломления вблизи фокальной точки лазерного луча из-за нагрева уменьшается. Затем формируется пространственное распределение коэффициента преломления благодаря таким эффектам, как теплопроводность. Свет, проходящий через эту область, не распространяется по прямой линии из-за неоднородности коэффициента преломления, но нагрев вызывает некоторые оптические эффекты, подобно линзе. Эти эффекты виртуальной линзы называются эффектами тепловой линзы. Например, в случае таких веществ, как вода, у которой температурный коэффициент коэффициента преломления вблизи комнатной температуры является отрицательным, возникают некоторые такие же эффекты, как в случае вогнутой линзы. Сила эффектов линзы (степень линзы) является пропорциональной количеству генерируемого тепла, а именно числу возбужденных молекул. Затем, когда вводится еще один лазерный луч для детектирования (детектируемый свет), детектируемый лазерный луч расширяется и сжимается по сравнению с исходным оптическим путем благодаря эффектам линзы. Из величины этих изменений для детектируемого лазерного луча может быть измерено количество генерируемого тепла, или количество света, поглощенного измеряемым объектом, и становится возможной количественная характеристика измеряемого объекта. В принципе, поскольку тепловая линза формируется вблизи фокальной точки возбуждающего лазерного луча, не требуется длинного оптического пути, и это является пригодным для детектирования проб в микрообластях.
Путем создания детектирующего устройства с тепловой линзой в настоящем анализаторе становится возможным измерение концентрации веществ, которые должны определяться, которое является сложным для измерения с помощью устройств, известных из уровня техники, поскольку длина оптического пути является настолько же малой, как и вертикальная ширина верхнего элемента кристалла (угол падения не обязательно является прямым углом), а именно настолько же малой, как и глубина канавки (около от 1 до 1000 мкм).
Как описано ранее, ширина и глубина канавки плоского пластинчатого элемента из органического полимера составляют от около 1 до 1000 мкм, и следовательно, длина оптического пути в направлении, вертикальном по отношению к поверхности пластины (угол не обязательно должен быть прямым углом по отношению к поверхности кристалла), а именно в направлении, вертикальном или наклонном по отношению к потоку флюида, является настолько же малой, как и глубина канавки. Однако, используя способ детектирования с тепловой линзой, вещество-объект может детектироваться с адекватной чувствительностью даже при этом уровне длины оптического пути. Таким образом, поскольку фототермический способ детектирования не требует сложных конфигураций каналов для обеспечения длинного оптического пути, стоимость кристалла может быть снижена. Кроме того, детектирование может проводиться с использованием компактного, недорого и простого устройства для оптического детектирования, такого как сочетание полупроводникового лазера и фотодиода. Однако, что касается материала кристалла, который должен использоваться для детектирования, существует то требование, чтобы коэффициент поглощения для света возбуждения был малым. В противном случае, как показано на фиг.1, в дополнение к тепловой линзе для основного детектирования концентрации возникают области, соответствующие тепловым линзам, тем самым вызывая ошибку.
В качестве детектирующего устройства, использующего фототермический способ детектирования, является необходимым источник света возбуждения, имеющий длину волны, которую поглощает вещество-объект детектирования, и имеющий необходимую выходную мощность для образования тепловой линзы. Свет возбуждения может быть светом с необходимой длиной волны, которую получают от ксеноновой лампы с использованием призмы, или от лазера, имеющего длину волны, способную возбуждать вещество-объект детектирования. В качестве лазеров используют He-Ne лазеры, Аr лазеры, лазеры на двуокиси углерода, АИГ лазеры и тому подобное, но использование полупроводниковых лазеров дает возможность получить компактное устройство для детектирования, которое является пригодным для использования в анализах НМЛ и в измерениях окружающей среды. Источник детектируемого света может иметь выходную мощность, меньшую, чем у света возбуждения, и его длина волны может быть идентичной или отличной от света возбуждения. Предпочтительно как свет возбуждения, так и детектируемый свет фокусируются в канале капилляра или вблизи капилляра, и в этом случае необходимы конденсорные линзы.
Свет возбуждения превращается с помощью прерывателя в импульсы света длительностью от около 0,1 до 10 мс. Затем детектируемый свет, захватываемый фотодиодом, цифровой камерой, фотоумножителем, подвергается обработке с помощью синхронного усилителя, синхронизированного с описанным выше прерывателем, и отбирается только его часть, связанная с изменением, вызванным тепловой линзой. Далее, для детектирования детектируемого света, с точки зрения миниатюризации устройства, является удобным использование фотодиодов.
Синхронный усилитель может быть упрощен с помощью работающих просто полупроводниковых элементов. Затем, для получения импульсов света возбуждения полупроводниковый лазер может модулироваться электрически. Затем, при детектировании детектируемого света, как правило, используют синхронный усилитель, но поток света вблизи осей света возбуждения и детектируемого света может быть ограничен с помощью пластинки-экрана, с использованием способа фототермического спектрального анализатора с темным полем, описанного в выложенном Японском патенте 9-229883, при этом детектируя только детектируемый свет, испускаемый тепловой линзой. Альтернативно, он может быть заменен на БИС, концентрирующие функциональность импульсов света возбуждения.
Затем, в настоящем изобретении абсолютная чувствительность, включающая подсчет количества молекул в микрообластях, не требуется, но единственным, что требуется, является концентрация вещества в капилляре, которая может быть измерена с высокой чувствительностью. То есть требуется высокая чувствительность по концентрации. Другими словами, тепловая линза должна быть распределена по всей площади поперечного сечения капилляра, где только возможно, чтобы увеличивалось количество молекул веществ-объектов измерения, находящихся в ней, и усиливался эффект тепловой линзы.
Более того, заданное поперечное сечение представляет собой поперечное сечение плоскостью, включающей оптическую ось, среди плоскостей, перпендикулярных к плоскости, включающей направление потока флюида в капилляре и описанную выше оптическую ось света возбуждения. Более того, эта оптическая ось предпочтительно является перпендикулярной, но может быть и наклонной по отношению к направлению потока флюида в капилляре.
Однако количество света на единицу объема понижается, и эффект тепловой линзы уменьшается из-за влияния тепловой диффузии, если возбуждение слишком распространяется, и, следовательно, существует оптимальное значение для ширины луча света возбуждения. В случае представленного примера 1 линза объектива с NA=0,4 используется для капилляра глубиной 50 мкм, и диаметр луча света возбуждения (13,5% для максимального количества света) в центре по направлению глубины капилляра равен 38 мкм, обеспечивая максимальное значение выходного сигнала для способа детектирования с тепловой линзой. Когда тепловая линза расширяется, тогда тепловая линза формируется также в кристалле из органического полимера, тем самым вызывая появление фона и заметно уменьшая чувствительность измерений, как описано выше.
Таким образом, тепловая линза должна быть сформирована в части описанного выше заданного поперечного сечения таким образом, чтобы чувствительность к концентрации заданного компонента была чувствительностью, достаточной для анализа описанного выше заданного компонента. Для этой цели свет возбуждения должен быть отрегулирован таким образом, чтобы он имел соответствующую степень сжатия света возбуждения и сходился в фокус в соответствующем положении.
Существуют разнообразные способы для настройки шкалы этой тепловой линзы (пределов, в которых происходит изменение температуры), но она может также достигаться путем настройки числовой апертуры линзы объектива, через которую капилляр облучается светом возбуждения. Когда нормальная линза, например система микроскопических линз, описанная в Japan Analytical Chemical Association 44th Meeting (1995) Abstracts IC05, непосредственно используется для кристалла согласно настоящему изобретению, чувствительность при детектировании вещества-объекта необязательно является высокой. Размер капилляра в области детектирования для тепловой линзы предпочтительно составляет приблизительно 20 мкм или больше
как по ширине, так и по глубине. С другой стороны, как описано, в микроскопической тепловой линзе, описанной выше, диаметр луча света возбуждения около 4 мкм достигается при увеличении в 70 раз, и в дальнейшем повышается увеличение микроскопа, а диаметр луча уменьшается до долей микрона для увеличения абсолютной чувствительности. Авторы настоящего изобретения, измеряя выходной сигнал способом детектирования с тепловой линзой со светом возбуждения, имеющим диаметр луча около 4 мкм, используя кристалл с размером капилляра области детектирования, составляющим 50 мкм по глубине и 50 мкм по ширине, обнаружили, что чувствительность детектирования является низкой.
Затем, числовая апертура уменьшалась до около 0,1 с увеличением диаметра луча до около 50 мкм в результате экспериментов, использующих различные значения числовой апертуры конденсорной линзы, и как обнаружено, в представленном примере чувствительность детектирования улучшилась. Это может происходить за счет того факта, что в обычных способах детектирования с тепловой линзой свет возбуждения сильно сфокусирован с помощью оптической конденсорной линзы, чтобы сконденсировать свет на растворе пробы, а толщина сформированной тепловой линзы уменьшается для повышения абсолютной чувствительности, где является важным то, сколько молекул вещества может, как минимум, детектироваться в микропространствах, чувствительность по концентрации для количественной характеристики количества вещества в фиксированном объеме раствора пробы является низкой.
С другой стороны, в областях медицинской диагностики, анализа окружающей среды и тому подобного, является важным, чтобы была высокой чувствительность по концентрации, а не абсолютная чувствительность. Поэтому, в отличие от обычных способов детектирования с тепловой линзой, степень сжатия света возбуждения понижается, и тепловая линза расширяется для достижения площади, приблизительно равной площади поперечного сечения канала, обеспечивающей стабильный электроосмотический поток, при этом становится возможным увеличение чувствительности по концентрации и детектирование веществ с высокой чувствительностью в капилляре с малой площадью поперечного сечения, что дает возможность получения стабильного электроосмотического потока.
Далее будут описаны процедуры для реального анализа вещества в капилляре, сформированном в кристалле согласно настоящему изобретению, с использованием метода детектирования с тепловой линзой.
Каждая оптическая часть, включая микроскоп, показанный на фиг.2, помещается на стабилизированном лабораторном столе. Лабораторный стол, желательно, обладает противовибрационным действием. Кроме того, микроскоп, позволяющий собирать лазерные лучи, содержит входную часть, которая делает возможным непосредственное введение лазерных лучей извне. Далее, частота прерывателя, расположенного на оптическом пути света возбуждения, устанавливается равной 116 Гц. Это значение может изменяться постольку, поскольку принимаются меры предосторожности для предотвращения захвата шума от источника шума, такого как источник электрического питания.
Сначала настраиваются оптические оси света возбуждения, детектируемого света и расширителей лучей, помещенных в некоторых средних точках на соответствующем оптическом пути света возбуждения и детектируемого света. Для детектируемого света, в частности, проводится точная настройка так, чтобы оптическая ось не сдвигалась даже тогда, когда изменяется степень коллимации луча. В это время степень увеличения расширителя луча устанавливается таким образом, чтобы она составляла 10 раз. Затем, эти два лазерных луча делаются коаксиальными с использованием дихроичного зеркала. Дихроичное зеркало имеет коэффициент пропускания 90% или выше для света возбуждения и коэффициент отражения 80% или выше для детектируемого света. Благодаря этим характеристикам является возможным сделать как свет возбуждения, так и детектируемый свет, коаксиальными, при этом понижая потери количества света. После того как они сделаны коаксиальными, степень коллимации расширителя луча детектируемого света изменяется, и, с помощью визуального наблюдения под микроскопом, свойство коаксиальности света возбуждения и детектируемого света увеличивается до такого уровня, что свойство коаксиальности со светом возбуждения не уменьшается.
Кристалл, используемый для измерения, помещается под микроскоп, и измеряемая проба вводится в капилляр, сформированный в кристалле. Затем производится настройка по высоте, так что фокальная точка света возбуждения находится в центре, в направлении по глубине капилляра. Линза объектива может быть настроена в диапазоне NA от 0,2 до 0,8, если глубина (ширина) капилляра находится в пределах от 50 до 100 мкм, и чувствительность изучается при трех значениях NA: 0,2, 0,4 и 0,6. Настройка по высоте осуществляется с помощью небольшого перемещения кристалла вверх и вниз, при одновременном наблюдении отражения на границе раздела воздух/подложка или на границе раздела подложка/капилляр. В этом случае может возникать ошибка, приблизительно равная фокальной глубине света возбуждения, из-за визуального наблюдения, и пределы ошибки в случае линзы объектива, у которой числовая апертура равна 0,4, могут составлять 2 мкм, но ошибки на этом уровне не вызывают проблем. Сначала высота положения кристалла, в который вводится проба, устанавливается так, как описано выше, используя линзу объектива, у которой числовая апертура равна 0,2. В это время расширитель луча настраивается таким образом, что разница между фокальными позициями света возбуждения и детектируемого света почти равна глубине капилляра, и фокальная позиция детектируемого света сдвинута по отношению к фокальной позиции света возбуждения в направлении линзы объектива. Разница в этом случае составляет около 50 мкм. Расширитель луча настраивается таким образом, что детектируемый свет сходится, и фокальная позиция детектируемого света сдвинута по отношению к свету возбуждения в направлении линзы объектива. В этих условиях проверяется выходной сигнал синхронного усилителя, а именно выходной сигнал в способе детектирования с тепловой линзой. В это время устанавливается временная константа синхронного усилителя, равная одной секунде. В этих условиях для обеспечения того, что генерируется достаточно значительная величина и что паразитный свет от света возбуждения не поступает в детектор света, уменьшается ли указанный выше выходной сигнал в достаточной степени в способе детектирования с тепловой линзой, проверяется при условии, что вводится только свет возбуждения. Затем настраивается угол сходимости расширителя луча для детектируемого света, и он устанавливается в положении, в котором сигнал достигает своего максимума, когда выходной сигнал наблюдается с помощью способа детектирования с тепловой линзой. Рассмотренные выше операции производятся для трех точек, 0,2, 0,4 и 0,6, и выбирается числовая апертура, обеспечивающая оптимальную чувствительность. Принимая в качестве примера капилляр глубиной 50 мкм, когда используется линза объектива, у которой числовая апертура равна 0,4, может быть получена самая высокая чувствительность по концентрации для способа детектирования с тепловой линзой.
Более того, объекты, которые могут детектироваться с помощью способа детектирования с тепловой линзой, не являются ограниченными настолько, насколько они поглощают свет возбуждения, но они должны быть отделены от других веществ в пробе, особенно от веществ, поглощающих свет возбуждения, и веществ, поглощающих детектируемый свет, или имеющих флуоресценцию на длине волны детектируемого света, перед тем как осуществляется фототермическое преобразование. Уровень поглощения детектируемого света, с точки зрения чувствительности, предпочтительно находится в диапазоне молярного поглощения от 1000 до 100000.
Вещества-объекты детектирования, не поглощающие или слабо поглощающие свет возбуждения, преобразуются в вещества, поглощающие свет возбуждения (пигмент, в случае видимого света), для измерения с помощью сочетания взаимодействий с использованием ферментов, для которых вещество-объект детектирования при объединении является субстратом. Альтернативно, используя антитело против вещества-объекта детектирования, антитело или вторичное антитело метится веществом, поглощающим свет возбуждения, и измеряется свет возбуждения, генерируемый непосредственно или как результат ферментативной реакции.
В случае, когда биологические материалы детектируются в качестве веществ-объектов детектирования, например, является возможным преобразование их в конечном счете в следующие вещества с помощью взаимодействий с использованием ферментов, для которых вещество-объект детектирования является субстратом, при объединении (Aoyama, N. Clinical Examination, 41:1014 (1997)). То есть происходит преобразование в вещества, поглощающие свет возбуждения, которые являются продуктами конденсации
N-этил-N-(3-метилфенил)-N'-ацетилэтилендиамина (ЕМАЕ),
N-этил-N-(3-метилфенил)-N'-сукцинилэтилендиамина (EMSE),
N-этил-N-(3-сульфопропил)-3,5-диметоксианилина (DAPS),
N-(3-сульфопропил)-3,5-диметоксианилина (HDAPS),
N-этил-N-(2-гидрокси-3-сульфопропил)-3,5-диметоксианилина (DAOS),
N-(2-гидрокси-3-сульфопропил)-3,5-диметоксианилина (HDAOS),
N-(2-гидрокси-3-сульфопропил)-3,5-диметоксианилина (HSDA),
N-этил-N-(2-гидрокси-3-сульфопропил)-3-метиланилина (TOPS),
N-этил-N-(2-гидрокси-3-сульфопропил)-3-метиланилина (TOOS),
N-этил-N-(2-гидрокси-3-сульфопропил)-3,5-диметиланилина (MAPS),
N-этил-N-(2-гидрокси-3-сульфопропил)-3,5-диметиланилина (MAOS),
N,N-бис(4-сульфобутил)-3,5-диметиланилина (MADE),
N,N-бис(4-сульфобутил)-3,5-диметоксианилина (DADB)
и тому подобное, и 4-аминоантипирина, или вещества, поглощающего свет возбуждения, такого как
бис{ 4-[N-3'-сульфо-н-пропил] -N-н-этил} амино-2,6-диметилфенил} метан (Bis-MAPS-C2),
бис{4-[N-3'-сульфо-н-пропил]-N-н-пропил}
амино-2,6-диметилфенил}метан (Bis-MAPS-С3) и
бис{4-[N-3'-сульфо-н-пропил]-N-н-бутил}
амино-2,6-диметилфенил}метан (Bis-MAPS-C4).
Когда эти взаимодействия осуществляются в кристалле, растворы реагентов могут вводиться извне кристалла с использованием пробирки и иглы. Альтернативно, собираются растворы реагентов, содержащиеся в маленьких контейнерах, таких как пластиковые мешки (материалами могут быть полиэтилен, полипропилен, полиэстр, найлон, поливинилхлорид и тому подобные, настолько, насколько они не взаимодействуют с реагентом), а затем такие мешки могут разрываться при выдавливании пластиковых мешков с иглами в кристалл для переноса растворов реагентов извне в резервуары для реагентов в кристалл. Далее, существует способ среди других, в котором реагент содержится в кристалле в виде высушенного твердого продукта, а затем вода из кристалла или вне его, или вода или буфер из резервуара для буфера вводится в отделения, в которых содержатся твердые реагенты, для получения реагентов при заданных концентрациях.
Кроме того, проба может непосредственно вводиться в кристалл. Также, в случае анализа загрязнений в реке и анализа мочи, проба может концентрироваться в качестве предварительной обработки с использованием мембранного фильтра, который может разделять их по молекулярной массе. Также проба может вводиться в капилляр после того как удаляются частички пыли и клетки крови, путем снабжения кристалла фильтром.
(Отношение скоростей потоков)
В капилляре кристалла согласно настоящему изобретению могут быть сделаны части канала, предназначенные для различных операций, как для главных целей, часть за частью, такие как часть канала, предназначенная, главным образом, для подготовки заданного количества образца, часть канала, предназначенная, главным образом, для смешивания реагентов и проб, и часть канала, предназначенная, главным образом, для переноса реагентов и проб. В случае, когда в качестве средства для введения жидкости используется электроосмотический поток, часть канала, предназначенная, главным образом, для электрофоретического разделения, также может быть создана в дополнение к указанным выше частям каналов. Разумеется, одна часть канала может иметь два или более назначений, если не принимать во внимание средства для введения жидкости, такие как введение с помощью насоса, и электроосмотический поток, с помощью которого вводится жидкость. Также для кристалла согласно настоящему изобретению канал может состоять из части канала, предназначенной, главным образом, для одной операции, но может также состоять из комбинации множества частей канала, которые предназначены, главным образом, для различных операций. Таким образом, может быть создано устройство, делающее возможным не только простой качественный анализ, но и анализ высокого уровня, включающий количественный анализ, и реакцию, которая должна быть осуществлена.
Конфигурация части канала, предназначенная, главным образом, для приготовления заданного количества пробы, представляет собой конфигурацию, показанную на фиг. 3, в которой два канала пересекаются друг с другом в форме креста, или конфигурацию, показанную на фиг.4, в которой два канала сливаются с одним каналом в форме буквы Т, соответственно, и конфигурация, показанная на фиг.4, является предпочтительной. В канале, имеющем конфигурацию, показанную на фиг.3, приготовление заданного количества пробы производится путем протекания пробы от точки А по направлению к точке В, с последующей остановкой потока в направлении В, а затем протекание пробы от точки А по направлению к точке D в течение определенного периода времени, с последующей остановкой потока от точки А, и дальнейшего протекания флюида от точки С до точки D. В этом случае приготовление заданного количества пробы производится с помощью площади поперечного сечения, скорости потока и времени.
Также в канале, имеющем конфигурацию, показанную на фиг.4, приготовление заданного количества пробы производится путем протекания пробы от точки А к точке В, с последующей остановкой потока, и затем протекание флюида от точки С к точке D. В этом случае приготовление заданного количества пробы производится с помощью площади поперечного сечения капилляра и длины участка между точкой слияния Т-образного канала Е и точкой слияния Т-образного канала F. Для такой конфигурации количество приготовленной пробы определяется только площадью поперечного сечения капилляра и длиной участка между точкой слияния Е и точкой слияния F, безотносительно к скорости потока флюида и периода времени, в течение которого протекает флюид, настолько, насколько капилляр изготовлен с хорошей точностью задания размеров. Более того, это может быть более предпочтительным методом приготовления пробы, поскольку количество пробы для приготовления может устанавливаться произвольным образом путем изменения площади поперечного сечения капилляра и длины участка между точками слияния Е и F.
Форма части канала, главным образом, предназначенной для смешивания и разбавления реагентов и проб, включает форму с расширенной и/или углубленной областью в некоторой средней точке канала (может быть предпочтительным, чтобы размер этого участка устанавливался в пределах порядка от миллиметров до сантиметров) для осуществления смешивания и разбавления в сочетании с приготовлением пробы. Более того, является предпочтительным, чтобы использовались гомогенизирующие процессы временного прекращения введения жидкости, с тем чтобы сделать флюид однородным с помощью диффузии, или сделать флюид однородным с помощью механического перемешивания и тому подобного. В частности, является предпочтительной структура, делающая возможным механическое перемешивание (например, помещают брусок-мешалку и перемешивание осуществляют с использованием магнитной силы), при котором это перемешивание происходит, не требуя значительного времени для того, чтобы сделать флюид однородным.
Кроме того, в зависимости от структур каналов, конфигурации каналов, предназначенных, главным образом, для смешивания и разбавления проб и реагентов, могут включать конфигурацию, в которой один канал сливается с другим каналом, и конфигурацию, в которой множество каналов сливается с одним каналом в одной точке. Путем слияния одного канала с другим каналом или со множеством каналов с получением одного канала операции смешивания и разбавления могут осуществляться только с помощью конфигурации канала. Кроме того, в это время может осуществляться смешивание и разбавление с различными отношениями путем изменения скорости каждого потока. В случае введения жидкости с использованием насосов является возможным механическое изменение скорости потоков каждого из каналов, которые будут сливаться. Кроме того, в случае введения жидкости с использованием электроосмотических потоков скорость потока в каждом из каналов, которые будут сливаться, может быть изменена путем изменения величины поперечного сечения и длины каждого из каналов, которые будут сливаться, изменяя последовательность приложения напряжений к каждому каналу и изменяя плотность заряда на внутренней поверхности каждого канала с помощью обработки поверхности. Кроме того, в случае, когда насос расположен на внешней стороне, вид насоса не ограничивается, включая систему, в которой давление воздуха создается с помощью плунжерного насоса, и флюид выдавливается наружу с помощью этого давления, систему с отсосом. В этом случае является предпочтительным, чтобы в области слияния была предусмотрена структура отражателей и после участка слияния был предусмотрен канал, предназначенный для того, чтобы сделать жидкость однородной с помощью диффузии. Конфигурации частей каналов, предназначенных для того, чтобы сделать флюид однородным, включают такие конфигурации, как линейная конфигурация и изогнутая конфигурация, подобная меандру и спиралям. Кроме того, является необходимым обеспечение времени, необходимого и достаточного для смешанного флюида, чтобы осуществить заданное взаимодействие, но необходимое взаимодействие осуществляется без использования дополнительных средств для измерений времени взаимодействий путем создания дистанции в канале между некоторой точкой слияния и следующей точкой слияния или областью детектирования, которая будет требуемой дистанцией, соответствующей заданной скорости потока, полученной после смешивания.
Что касается средств для транспортировки флюидов, могут быть использованы механические средства, такие как насосы, или электрические средства, такие как электроосмотические потоки.
В случае, когда флюид в капилляре переносится с использованием насосов для введения жидкости или насосов отрицательного давления, которые работают с помощью управления вне пределов кристалла (также включая случай, когда насосы в кристалле работают с помощью управления вне пределов кристалла), скорость потока может контролироваться с помощью скорости поступления или отсоса насосов или может контролироваться с помощью механических средств, включая использование клапанов для контроля скорости потока.
Более того, в противоположность тому, что описано выше, может также достигаться расхождение путем создания канала, разветвляющегося на множество каналов (расхождение канала).
Конфигурации частей канала, предназначенных, главным образом, для электрофоретического разделения, в случае, когда в качестве средства для введения жидкости используется электроосмотический поток, включают линейные конфигурации и изогнутые конфигурации, подобные меандру и спиралям. Изогнутая конфигурация, подобная меандру и спиралям, может увеличить разделительную способность по сравнению с линейной конфигурацией, поскольку становится возможным сделать длину канала для разделения большей, чем длина самой длинной стороны кристалла.
Анализатор согласно настоящему изобретению может быть использован для множества аналитических целей путем изменения структур каналов (конфигураций). Например, является возможным создание конфигурации, основанной на канале, предназначенном, главным образом, для смешивания и разделения при использовании в качественном анализе, создание конфигурации с каналом, предназначенным, главным образом, для количественного приготовления пробы, и в сочетании с каналом, предназначенным, главным образом, для разделения, создание конфигурации, основанной на канале, предназначенном, главным образом, для количественного смешивания, для использования при количественном анализе, включающем разделение, и при количественном анализе, включающем взаимодействие, создание конфигурации с каналом, предназначенным, главным образом, для количественного приготовления пробы и в сочетании с каналом, предназначенным, главным образом, для смешивания, и в сочетании с каналом, предназначенным, главным образом, для разделения, для использования при количественном разделении и анализе, включающем взаимодействия, и создание конфигурации, принципиально включающей канал, предназначенный, главным образом, для количественного приготовления пробы и канал, предназначенный, главным образом, для смешивания, для использовании при анализе, который не включает слишком много разделения.
В кристалле анализатора согласно настоящему изобретению пробы контролируются с помощью электроосмотического потока, электрофореза или других соответствующих средств и производится разбавление и взаимодействие с другими реагентами. Кроме того, для таких операций, как слияние этих флюидов, временной график должен в целом контролироваться достаточно точно. Было обнаружено, что выполнение этих операций точно, просто и без использования дополнительных устройств, таких как таймеры, может быть реализовано путем смешивания и взаимодействия соответствующих флюидов с заданной скоростью потока и с приданием капилляру длины, необходимой и достаточной для протекания в течение периода времени, необходимого для смешивания и взаимодействия слившегося флюида, протекающего с заданной скоростью потока. Это будет описано подробно ниже. Далее, скорость потока согласно настоящему изобретению означает объем флюида, движущийся в капилляре в течение определенного момента времени.
Используя чертежи, часть этой методики, связанная со смешиванием и взаимодействием, далее будет описана подробно. В следующем далее описании для целей упрощения предполагается, что все каналы имеют одинаковую глубину, но в случае реального осуществления их глубина может различаться для разных каналов. Подобным же образом для целей упрощения предполагается, что скорость потока флюида перед слиянием, а именно расстояние, пройденное за единицу времени, равно v для всех флюидов. Также и в этом случае в случае реального осуществления она может различаться для каждого флюида. В последующем описании предполагается, что каждый из флюидов перед слиянием движется непрерывно со скоростью v и никогда не останавливается.
Фиг.5 демонстрирует канал, в котором флюид 1 и флюид 2 сливаются в точке слияния 1, и смешивание и взаимодействие осуществляется в течение заданного времени, с последующим слиянием флюида 3 со смесью флюида 1 и флюида 2. На фиг. 5 ширина W каналов, через которые флюид 1 и флюид 2 протекают до достижения точки слияния 1, является равной а, и ширина канала от точки слияния 1 до точки слияния 2, после того как они сольются, также равна а. При этом условии является очевидным, что скорость потока смеси флюидов 1 и 2, протекающих между точкой слияния 1 и точкой слияния 2, равна 2v. Также является очевидным, что отношение смешивания флюида 1 и флюида 2 составляет 1:1. Полагая, что длина канала между точкой слияния 1 и точкой слияния 2 равна k, время, необходимое для слившегося флюида для того, чтобы пройти от точки слияния 1 до точки слияния 2, должно составлять k/(2v). Поскольку значения k и v могут устанавливаться индивидуально путем подбора размещения капилляра и средств для введения жидкости и тому подобного, k и v подбираются таким образом, чтобы обеспечить время, адекватное для смешивания и взаимодействия, тем самым делая возможным точную регулировку времени перед слиянием с флюидом 3, следующим процессом, без обращения к внешним таймерам. Далее, когда число флюидов, которые будут сливаться, составляет, в конечном счете, три или более, эти три флюида или более могут сливаться в одной и той же точке. Это остается неизменным в следующем далее описании.
Фиг. 6 демонстрирует другой пример, и на этой фигуре ширина W каналов, через которые протекают флюид 1 и флюид 2, равна а, как и в случае фиг.5, но ширина W канала после их слияния в точке слияния 1 равна 2а. При этом условии является очевидным, что скорость потока смеси флюидов 1 и 2, протекающей между точкой слияния 1 и точкой слияния 2, поддерживается равной v. В этом случае, если время, необходимое для смешивания и взаимодействия флюида 1 и флюида 1, является идентичным времени, описанному для фигу.5, в порядке осуществления этого длина канала между точкой слияния 1 и точкой слияния 2 может быть подобрана таким образом, чтобы она была равна k/2, как показано на фиг. 6, или отношение скорости потока v на фиг.6 к скорости потока v на фиг.5 должно быть равно 2:1, при этом поддерживая длину при значении k. Использовать ли одно или другое соответствующее сочетание величин, если используются v и k, можно решать, по существу, свободно, хотя иногда это может ограничиваться размерами кристалла и средств для введения жидкости. Более того, если ширина W канала от точки слияния 1 до точки слияния 2 равна величине иной, чем 2а, возможный диапазон значений параметров может быть дополнительно расширен. Далее, также и в этом случае отношение смешивания флюида 1 и флюида 2 составляет 1:1.
Фиг. 7 демонстрирует еще один пример, и на этой фигуре ширина W каналов, через которые протекают флюид 1 и 2, равна а и b соответственно, в отличие от случаев на фиг. 5 и 6, ширина W канала после того, как они сливаются в точке слияния 1, равна а+b. Также и при этом условии является очевидным, что скорость потока смеси флюидов 1 и 2, протекающих между точкой слияния 1 и точкой слияния 2, поддерживается равной v. В этом случае, если время, необходимое для смешивания и взаимодействия флюида 1 и флюида 2, является идентичным времени, описанному для фиг.5 и фиг.6, в порядке осуществления этого, длина канала от точки слияния 1 до точки слияния 2 может быть равна k/2, как описано для фиг.6, или отношение скорости потока v на фиг.7 к скорости потока на фиг. 5 может быть равно 2:1. Будет ли использоваться одно или другое соответствующее сочетание величин v и k, можно решать, по существу, свободно, хотя это может ограничиваться размерами кристалла и средств для введения жидкости. Более того, если ширина W канала между точкой слияния 1 и точкой слияния 2 равна значению иному, чем a+b, возможный диапазон значений параметров может быть дополнительно расширен, как описано для фиг.6. Таким образом, является возможным смешивание флюидов 1 и 2 при отношении смешивания a: b и осуществления необходимого взаимодействия без использования сложного механизма.
Фиг. 8 демонстрирует пример, дополнительно расширяющий фиг.5-7. Значение ширины каналов, через которые протекают флюиды 1-4, равно а, b, с и d, соответственно, и они сливаются в точках 1-3, соответственно, и расстояние между точками слияния равны k/2 и j, соответственно. Также ширина канала от точки слияния 1 до точки слияния 2 равна a+b, а ширина канала от точки слияния 2 до точки слияния 3 равна a+b+с. Разумеется, из-за некоторого ограничения, налагаемого на диффузионную длину, необходимую для смешивания, и размер кристалла, эти величины являются объектами компромисса ширина канала/длина канала и могут изменяться на стадии реального конструирования. Представляя объяснение, соответствующее фигуре, скорость потока после слияния равна v, как описывается для фиг.5-7, и время между слиянием флюида 1 и флюида 2 и последующим слиянием флюида 3 с ними равно k/(2v), и время между слиянием флюида 3 со смесью флюида 1 и флюида 2 и последующим слиянием флюида 4 с ними равно j/v. Значения k/(2v) и j/v, которые определяются длиной, требуемой для смешивания, и временем, требуемым для взаимодействия, могут быть идентичными, но необязательно являются идентичными. Таким образом, является возможным последовательное смешивание флюидов 1-4 с отношением смешивания a: b:с:d и в заданном временном интервале. Затем, даже если количество флюидов, которые будут смешиваться, увеличивается, необходимые флюиды могут смешиваться тем же самым способом последовательно при заданном отношении смешивания, в заданном временном интервале и непрерывно.
Воплощение для осуществления приведенного выше описания будет далее поясняться подробно, с использованием фиг.9-11.
В следующем далее описании в качестве средства для введения жидкости используется электроосмотический поток.
Капилляр согласно этому воплощению формируется путем ламинирования пары плоских пластинчатых элементов друг с другом и состоит из пластины 31 с канавками, имеющей на своей поверхности канавки, проделанные на плоскости в соответствии с заданными каналами, и покрывающую пластину 32, ламинируемую со стороной пластины с канавками, несущей на поверхности канавки. В следующем далее описании эта пластина 31 с канавками и покрывающая пластина 32, ламинированные друг с другом, будут называться кристаллом. Фиг.9 представляет собой вид сверху, показывающий сторону поверхности этой пластины 31 с канавками, несущую канавки, фиг.10 представляет собой вид сверху, показывающий поверхность, противоположную по отношению к стороне поверхности, несущей канавки, этой пластины 31 с канавками, и фиг.11 представляет собой частичный вид в разрезе кристалла и соответствует разрезу по линии а-а' на фиг.10.
Соответствующие позиции, которые соответствуют областям для введения жидкости и для сбора стока жидкости из канавки, образующей канал пластины 31 с канавками, снабжены сквозными круговыми отверстиями 19-22, прорезанными сквозь поверхность пластины. Из этих сквозных отверстий сквозные отверстия 19-21 на стороне, где вводится жидкость, используются в качестве резервуаров для проб, реагентов и тому подобное, сквозное отверстие 22 используется в качестве резервуара для буфера и резервуара для стока жидкости. Эта пластина 31 с канавками может быть легко сформирована из ПММА с помощью литьевого формования с использованием формы, снабженной на поверхности полости выступами и углублениями, соответствующими канавке на поверхности, соответствующей определенному каналу.
Как показано на фиг.9, этот капилляр содержит канал для пробы 23, соединенный с резервуаром для введения пробы 19, первый канал 24 для реагента, соединенный с первым резервуаром 20 для введения реагента, второй канал 26 для реагента, соединенный со вторым резервуаром 21 для введения реагента, первый канал 25 для смешивания, имеющий длину, соответствующую времени взаимодействия между пробой и первым реагентом, и второй канал 27 для смешивания, имеющий длину, соответствующую времени взаимодействия между пробой и вторым реагентом, и использует срез на стороне резервуара 22 для буфера/стока жидкости второго канала 27 для смешивания в качестве области 29 детектирования для детектора.
Затем, канал 23 для пробы, первый канал 25 для смешивания и второй канал 27 для смешивания (включая область 29 детектирования) формируются в виде прямых непрерывных линий, точка 5 слияния первого канала 24 для реагента задается в определенном положении вверх по течению в этом непрерывном канале в виде прямой линии, и расстояние от точки 5 слияния равно длине, соответствующей времени взаимодействия между пробой и первым реагентом. Кроме того, точка 6 слияния второго канала 26 для реагента задается таким образом, чтобы расстояние между областью 29 детектирования второго канала 27 для смешивания и вверх по течению было равно длине, соответствующей взаимодействию между пробой и вторым реагентом. Также первый канал 24 для реагента и второй канал 26 для реагента сливаются под острым углом с каналом в виде прямой линии.
Далее, средства для смешивания реагентов состоят из первого канала 24 для реагента, точки 5 слияния и первого канала 25 для смешивания и второго канала 26 для реагента, точки 6 слияния и второго канал 27 для реагента, соответственно.
Как показано на фиг.11, на внутренней поверхности сквозного отверстия 20 создается электрод 30, это отверстие является эквивалентом верхнего по течению края первого канала 24 для реагента. Подобным же образом электроды создаются также на внутренних поверхностях сквозного отверстия 19, которое является эквивалентом верхнего по течению среза канала 23 для пробы, сквозного отверстия 21, которое является эквивалентом верхнего по течению среза второго канала 26 для реагента, и сквозного отверстия 22, которое является эквивалентом нижнего по течению среза канала 27 для смешивания.
Как показано на фиг.10, каждый из электродов 30 присоединен к одному из электродов 33, которые создаются на срезе, с той стороны, где вводится жидкость, пластины 31 с канавками, с различными проводниками 28. Эти электроды 33 соединяются с клеммами источника энергии для детектора и расположены таким образом, что напряжение подается по отдельности от каждого из электродов 33 на участки между сквозным отверстием 19 и сквозным отверстием 22, между сквозным отверстием 20 и сквозным отверстием 22 и между сквозным отверстием 21 и сквозным отверстием 22. Напряжение, которое должно подаваться на каждый из электродов 33, контролируется в ответ на каждую заданную скорость потока в канале 23 для пробы, в первом канале 24 для реагента, втором канале 26 для реагента с помощью устройства, управляющего напряжением в детекторе.
Далее, эти электроды 30, 33 и проводники 28 формируются с помощью печати на поверхности, противоположной поверхности, несущей канавки, этой пластины 31 с канавками с помощью проводящей краски, содержащей такие частицы, как серебро и медь, после ламинирования пластины 31 с канавками с покрывающей пластиной 32 с помощью адгезива. Также, как показано на фиг.11, сечение сквозного отверстия 20 имеет форму конуса, при этом сторона, ближняя к поверхности, на которой находятся канавки, является более узкой, при этом становится возможным создание электрода 30 на внутренней поверхности сквозного отверстия 20 с помощью печати, при этом поддерживая в горизонтальном состоянии поверхность пластины 31 с канавками.
В случае использования этого анализатора сначала заданное количество буфера добавляется в указанный выше резервуар 22 для буфера кристалла с целью заполнения буфером всех каналов 23-27, а затем заданное количество первого реагента, второго реагента и пробы вводится в первый резервуар 20 для реагента, во второй резервуар 21 для реагента и в резервуар 19 для пробы, соответственно. Затем, напряжение, генерирующее электроосмотические потоки, соответствующие заданному значению скорости потока в каждом канале, прикладывается по отдельности к участкам между сквозным отверстием 19 и сквозным отверстием 22, между сквозным отверстием 20 и сквозным отверстием 22 и между сквозным отверстием 21 и сквозным отверстием 22 посредством установки напряжения устройства, управляющего напряжением. На этот раз установленное значение скорости потока устанавливается таким образом, что отношение скорости потока в канале 23 для пробы к скорости потока в первом канале 24 для реагента соответствует отношению смешивания пробы и первого реагента, и отношение скорости потока в первом канале 25 для смешивания к скорости потока во втором канале 26 для реагента соответствует отношению смешивания пробы и первого реагента со вторым реагентом.
Таким образом, жидкость в каждом канале протекает со скоростью потока, соответствующей заданному значению для каждого канала, посредством электроосмотических потоков. Конкретно, проба и первый реагент движутся к точке 5 слияния со скоростью потока, соответствующей отношению смешивания, и смешиваются с отношением, соответствующим отношению их скоростей потоков в первом канале 25 для смешивания. Затем они достигают точки 6 слияния, после того как взаимодействие между пробой и первым реагентом завершается, и они протекают через второй канал 27 для смешивания. Также второй реагент движется от второго канала 26 реагента к точке 6 слияния со скоростью потока, соответствующей отношению смешивания для пробы, смешивается со смесью пробы и первого реагента при отношении, соответствующем описанному выше отношению смешивания во втором канале 27 для смешивания, и протекает через область детектирования 29 после того, как взаимодействие между пробой и вторым реагентом завершается.
Таким образом, в соответствии с этим анализатор, как только этот кристалл устанавливается в детекторе, который будет описан позднее, автоматически осуществляется смешивание и взаимодействие пробы с первым и вторым реагентами при заданном отношении. Детектирование производится для области 29 определения с использованием детектора, который будет описан позднее, с целью автоматического анализа компонентов.
Для того чтобы описать настоящее изобретение более ясно и конкретно, будет описан в качестве примера случай пробы и двух реагентов, например измерения общего уровня холестерина в крови, то есть один из конкретных случаев измерения для медицинской диагностики.
Обычно проба взвешивается и отбирается с использованием, например, 3 мкл пипетки и смешивается, например, с 200 мкл раствора первого реагента (реагент 1), который взвешивается и отбирается, и им позволяют взаимодействовать, например, в течение трех минут. После чего 100 мкл раствора второго реагента (реагент 2), который взвешивается и отбирается, добавляется к раствору реагентов и смешивается. После того как им позволяются взаимодействовать друг с другом в течение заданного времени, например десяти минут, измеряется коэффициент поглощения реагента-красителя в реакционной смеси, тем самым определяется количество вещества-объекта детектирования (такого как холестерин) в пробе.
Для осуществления этого с использованием способа согласно настоящему изобретению канал, через который реагент 1 протекает со скоростью потока 2000 нл/мин, сливается с каналом, через который проба протекает со скоростью потока 30 нл/мин, при этом обеспечивается скорость потока 2030 нл/мин, и длина канала подбирается так, что может быть получено время взаимодействия три минуты. Затем этот канал для смешивания реагента 1 и пробы сливается с каналом, через который реагент 2 протекает со скоростью потока 1000 нл/мин, обеспечивая скорость потока 3030 нл/мин, и длина канала подбирается таким образом, что может быть получено время взаимодействия десять минут, и, наконец, осуществляется определение, например фототермическое определение.
Таким образом, скорость потока может точно контролироваться с помощью насосов, напряжений и тому подобного, тем самым делая возможным осуществление смешивания и взаимодействия при заданном отношении без взвешивания и отбора заданного объема раствора. В частности, в случае, когда жидкость с продуктами реакции может собираться непосредственно в детекторе без осуществления какого-либо специального разделения, настоящее изобретение является особенно пригодным для использования, например, при измерениях Biochemical Items I для медицинской диагностики.
Далее, в указанном выше объяснении, линейная скорость может изменяться путем изменения площади поперечного сечения капилляра посредством изменения глубины настолько, насколько это необходимо и так далее, так же, как описано выше.
Пример конфигурации канала показан на фиг.12. Резервуар 1 является резервуаром для пробы, резервуар 2 является резервуаром для реагента 1, резервуар 3 является резервуаром для реагента 2, и резервуар 4 является резервуаром для стока жидкости. Проба смешивается с реагентом 1 в точке 5 слияния, а затем смешивается с реагентом 2 в точке 6 слияния. Угол, образуемый двумя канавками, в этом случае является прямым углом, но, как показано на фиг. 13, они могут сливаться под острым углом, при этом становится возможным дальнейшее уменьшение влияния изменения скоростей потоков вследствие давления, возникающего при слиянии различных потоков, и таким образом улучшение осуществления смешивания. Более того, для осуществления более эффективного смешивания выступ, такой как отражатель, для возмущения потока, может быть предусмотрен в области слияния, или смешивание может осуществляться посредством диффузии, при этом ширина канавки в области слияния увеличивается и время пребывания повышается.
В случае, когда детектирование может осуществляться без необходимости в разделении после взаимодействия между пробой и реагентом, как описано выше, особенно в случае Biochemical Examination Items, процессы могут осуществляться непрерывно в одном и том же канале от смешивания до взаимодействия и до детектирования без взвешивания и отбора заданного количества для разделения. Как правило, например, в случае, когда компонент, который необходимо детектировать, может детектироваться без помех со стороны других загрязнений, в зависимости от длин волн поглощения, и в случае, когда вещество, которое необходимо детектировать, не подвергается изменениям, как в случае, когда гидроксильные группы в пробе окисляются, и образующиеся в результате карбонильные группы определяются с помощью спектрофотометра, процессы могут осуществляться в одном и том же канале, от смешивания с заданным отношением потоков до взаимодействия и определения без разделения.
Способ согласно настоящему изобретению может осуществляться непрерывно в течение многих часов, но его не обязательно осуществлять в течение многих часов. Например, при описании предыдущего параграфа, полагая, что детектирование занимает десять секунд, реагент 1 и проба могут слиться в течение 10 секунд, как минимум (как правило, немного дольше, то есть около 20 секунд), и, через три минуты, они могут слиться с реагентом 2 в течение десяти секунд, как минимум, таким же способом. Затем, через десять минут, осуществляется определение. Таким образом, в способе согласно настоящему изобретению скорости потоков программируемым образом регулируются со временем, при этом создается возможность эффективного проведения микроанализа с минимальным количеством реагента и пробы и без взвешивания и отбора заданного объема. Таким образом, важными являются точность и программируемость контроля скорости потока и быстрый отклик системы. При калибровке отношения потоков коррекция может легко осуществляться путем пропускания стандартной пробы вместо реальной пробы. Альтернативно, размер канала в кристалле калибруется по частям заранее, и могут использоваться его откорректированные значения.
Используя способ согласно настоящему изобретению, не только один объект, но также и множество объектов в пробе могут измеряться путем разделения канала, а именно с помощью простой конструкции канала (фигура 14). То есть в указанном выше иллюстративном примере реагент 1 и проба взаимодействуют друг с другом в течение необходимого времени, а затем через малый временной интервал, канал с пробой при заданной скорости потока (необязательно идентичной скорости потока при смешивании с реагентом 1) сливается с каналом для реагента 3, протекающего с другой заданной скоростью потока. Затем, после взаимодействия в течение заданного времени, с ним сливается реагент 4 и измеряется продукт взаимодействия пробы с реагентами 1, 2, а затем продукт взаимодействия пробы с реагентами 3, 4 может определяться с использованием того же самого канала для детектирования.
Когда непосредственно определяется количество в пробе таких веществ, как общий холестерин, триглицерид и билирубин, продукт взаимодействия может измеряться в так называемой конечной точке, и определение может осуществляться только в одной точке, как минимум. С другой стороны, когда измеряется активность в пробе крови ферментов, таких как GOT, GPT и γ-GTP, определение может осуществляться в одной точке, но множество измерений (определение) предпочтительно осуществляется в течение некоторого времени в порядке обеспечения высокой точности (кинетические исследования).
В этом случае определение может осуществляться во множестве точек в канале, через который протекает конечная реакционная смесь, а именно во множестве точек канала, при
этом расстояние от точки слияния с конечным реагентом (то есть время взаимодействия) различаются. Для этой цели множество детектирующих систем могут быть размещены в канале для конечной реакционной смеси с детектором, или, в случае одной детектирующей системы, детектирующая система (оптическая система) или кристалл могут сдвигаться. Система детектирования с тепловой линзой сдвигается вдоль канала, или множество срезов для детектирования с тепловой линзой размещаются в канале, при этом становится возможным понимание изменений со временем, происходящих за короткое время или мгновенно. То есть длина канала соответствует времени взаимодействия. Это трудно осуществить для стереокристаллов, которые обладают трехмерной архитектурой, но легко осуществить путем плоского кристалла согласно настоящему изобретению с высокочувствительным устройством с тепловой линзой.
(Электрическое введение жидкости)
В этом воплощении изобретения для введения жидкости может быть приспособлено множество средств, таких как механические насосы и электрические средства, поскольку каждый флюид смешивается с заданным отношением потоков. Среди них прецизионные и простые средства, контролирующие введение жидкости, включают электрические средства, такие как электроосмотические потоки, в качестве предпочтительных конфигураций. Более того, электрические средства, рассматриваемые здесь, средства для контроля напряжения и средства для контроля тока также могут использоваться по отдельности, если это необходимо.
Способы, в которых введение жидкости контролируется с помощью управляющего напряжения, включают способ, в котором электрическое поле прилагается к жидкости в капилляре для введения жидкости посредством электрофореза и электроосмотического потока (описано в деталях в "Capillary electrophoresis" Kodansha Co., Ltd.). Электроосмотический поток является способом, в котором жидкость движется, поскольку движутся ионы на внутренней поверхности капилляра, и в случае, когда капилляр выполнен из стекла и кремния, протоны кремниевой кислоты на поверхности стекла обеспечивают движущую силу. Более того, даже в случае, когда никакой конкретный вид ионов не существует на внутренней поверхности капилляра, в кристалле, выполненном из органического полимера, такого как ПММА и ПХ, является возможной адсорбция электролита из жидкости на внутренней поверхности капилляра и генерация электроосмотического потока с помощью движения электролита, в зависимости от состава жидкости, протекающей в капилляре. Для генерации стабильного электроосмотического потока на внутреннюю поверхность капилляра может быть добавлен посредством прививочной полимеризации органический полимер, имеющий сульфоновые группы и карбоновые группы.
В случае введения жидкости с помощью электроосмоса скорость потока в каждом из каналов, которые будут сливаться, может изменяться путем изменения длины и размера сечения каждого канала, путем изменения последовательности приложения напряжения к каждому каналу и путем изменения плотности заряда на внутренней поверхности каждого канала-капилляра путем обработки поверхности.
Теоретически электроосмотический поток пропорционален ξ потенциалу, зависящему от материала стенки капилляра, и разности потенциалов, приложенной к капилляру. Для определения скорости электроосмотического потока, беря воду при 20oС в качестве примера, когда 100 В/см прикладывается к капилляру, имеющему ξ потенциал 75 мВ, для скорости электроосмотического потока получается значение, немного превышающее 0,5 мм/с. Для генерации электроосмотического потока никаких специальных функций от источников питания не требуется, но принимая во внимание тот факт, что в зависимости от длины капилляра могут генерироваться разности потенциалов, большие, чем 1 кВ, или еще большие, источники питания, способные производить высокое напряжение на выходе (1 кВ или выше), могут быть предпочтительными.
Эти высоковольтные источники питания предпочтительно имеют возможность подсоединения, непосредственно или через интерфейсную плату, к внешнему компьютеру для осуществления контроля. Таким образом, может программно задаваться временной график для приложения разности потенциалов с целью генерации электроосмотического потока, и может осуществляться более удобный контроль электроосмотического потока. В кристалле для анализатора согласно настоящему изобретению проба с высокой точностью контролируется посредством электроосмотического потока и/или электрофореза, проходит через стадии разделения и взаимодействия с другими реагентами, а затем подвергается фототермическому анализу ниже по течению в канале. В особенности, с точки зрения точного контроля, поскольку электроосмотический поток предоставляет возможность контролировать скорость потока с высокой степенью точности и с быстрым откликом с помощью контроля напряжения и в точном соответствии с заданной программой, использование электроосмотического потока представляет собой одно из предпочтительных воплощений для применений, в которых хорошо контролируется отношение потоков для осуществления необходимых химических реакций.
Далее в способах, в которых продукт реакции, соответствующий заданному времени после начала взаимодействия, определяемый количественно, в таких как кинетическое исследование, используется для определения веществ, происходящих из организма, с использованием ферментов, может возникнуть проблема точности измерений в случае введения жидкости с помощью насосов, вызывающих неоднородность скоростей потока по сечению капилляра. При электроосмотическом потоке, как описано выше, однако, является возможным точное определение, поскольку поток жидкости является, в принципе, ламинарным потоком, не имеющим неоднородности скоростей по поперечному сечению капилляра.
Кроме того, в случае использования насоса возникает ламинарный поток с максимальной скоростью в центре потока, и методом определения с тепловой линзой может определяться различие в концентрации вещества между областями потока с максимальной и минимальной скоростью, но при использовании электроосмотического потока создается плоский ламинарный поток флюида, и таким образом становится возможным стабильное определение, что также может быть причислено к дополнительным особенностям.
При введении жидкости с помощью насосов, однако, принимая меры для облегчения смешивания и диффузии составляющих жидкостей с помощью отражателя, создаваемого в капилляре, и предусматривая длину канала, достаточную для ферментативной реакции, можно также сделать определение достаточно точным.
В качестве источников питания для генерации электроосмотических потоков используют высоковольтные источники питания (например, Mode 1 HCZE-30PNO, 25, Matsusada Precision Co., Ltd., способные производить до 30 кВ), и выходное напряжение этих устройств может контролироваться с помощью внешних компьютеров через интерфейсные платы (например, DAQCard-1200, CB-50 Connector Block, National Instruments Co., Ltd.). Программы для применения заданных временных графиков приложения напряжения, и тому подобное, могут быть созданы с использованием, например, NI-DAQ Drive Software, LabVIEW, и тому подобное.
Использование анализатора согласно этому воплощению, описанного выше, делает возможным проведение диагностики у постели больного и непосредственно на месте работы врача, и информировать пациентов о результатах в тот же самый день, когда они получают диагноз, тем самым делая возможным выбор средств и терапии на основе результатов, которые получаются быстро. Также количественный и качественный анализ загрязнений в реках и опасных веществ в отходах, и тому подобное, может легко осуществляться в загрязненных местах. Далее, являются возможными выявление загрязнений во время таможенного осмотра и непосредственный анализ в местах приготовления пищи для импортируемых пищевых продуктов.
Вещества-объекты определения включают химические вещества, белки, нуклеиновые кислоты, и тому подобное, без особых ограничений, но и загрязняющие окружающую среду химикалии, биологическое вещество в крови/спинномозговой жидкости/слюне и моче, биологическое вещество, происходящее из органов/тканей/ слизи, белки, такие как бактерии и вирусы, создающие источники инфекции, ДНК, РНК, аллергены и различные виды антигенов могут быть объектами.
Преимущества настоящего изобретения будут описаны далее конкретно с использованием примеров.
Пример 1.
В качестве примера согласно настоящему изобретению будет продемонстрирован пример, в котором количественные измерения общего количества холестерина в сыворотке крови осуществляются с помощью исследования в конечной точке, с контролем потоков в целом трех растворов, которые представляют собой стандартную сыворотку для измерения липоидов и двух растворов реагентов для определения взаимодействия из набора для определения общего уровня холестерина (название продукта: Cholesterol E-HA TESTWAKO (производство Wako Chemical Co. , Ltd. ). Введение жидкости осуществляется с использованием электроосмотического потока путем приложения напряжения.
(Изготовление кристалла)
Сначала будет описано изготовление кристалла, содержащего капилляр.
Оптическая плотность пластинчатой подложки из органического полимера измеряется для предсказания влияния на тепловую линзу, с тем чтобы предоставить основные данные для выбора материала, пригодного для использования полимера. Способ измерения и результаты будут описаны.
В качестве измерительного устройства используется UV-2200A (UV-VIS Recording Spectrophotometry) производства Shimadzu Co., Ltd. Для способа измерений изготавливают пробы из одинаковых материалов, которые имеют различную толщину, и их разрезают с размером, достаточным для покрытия всего оптического пути, с последующим распрямлением пробы на вставке в измерительную ячейку, так что поверхность пластины является перпендикулярной оптическому пути, без использования измерительной ячейки. Сначала из полученных пластин, выполненных из одинаковых материалов, используют две самых тонких пластины для получения исходной коррекции. В реальном измерении оптическую плотность измеряют с использованием самых тонких пластин для опорных измерений и пластин, у которых толщина различна, как проб для измерения. В качестве длин волн для измерений используют три длины волны 488 нм, 633 нм и 780 нм. Детали, такие как используемые материалы, будут описаны ниже.
(1) Пробы для измерения
(a) Метакриловая смола (Delpet 560 F: t=2 мм, 3 мм), производство Asahi Chemical Industry Co., Ltd.
(b) Акриловая смола (Clarex: t=0,3 мм, 0,5 мм), производство Nitto Jushi Kogyo Co., Ltd.
(c) Акриловая смола (Sumipex: t=4,5 мм, 10 мм), производство Sumitomo Chemical Co., Ltd.
(d) Метакриловая смола (Acrylite: t=2 мм, 5 мм), производство Mitsubishi Rayon Co., Ltd.
(e) Поликарбонатная смола (Panlite AD 5503: t=1 мм, 2 мм), производство Teijin Chemical Co., Ltd.
(f) Метакриловая смола (Deraglass A: t=2 мм, 3 мм), производство Asahi Chemical Industry Co., Ltd.
(g) Поликарбонатная смола (Eupilon/Sheet: t=0,5 мм, 1,0 мм, 2,0 мм), производство Mitsubishi Engineering Plastics Co., Ltd.
(h) Поликарбонатная смола (PCSM PS600: t=0,5 мм, 1 мм), производство Takiron Co., Ltd.
(i) Поликарбонатная смола (Rectangle Plate; t=1 мм, 3 мм), производство Takiron Co., Ltd.
(j) Полиэфирная смола (РЕТЕС РЕТ6010: t=1 мм, 3 мм), производство Takiron Co., Ltd.
(k) Поливинилхлоридная смола (ESS8800A: t=1 мм, 3 мм) производство Takiron Co., Ltd.
(l) Ламинатная пленка (MS Poutch: t=100 мкм, 150 мкм), производство Meiko Shokai Co., Ltd.
(2) Результаты измерений
Сводка результатов измерений представлена на фиг.15. Далее, для подложек (а)-(l) выходной сигнал детектирования с тепловой линзой измеряют вместе. В измерении возбуждающий свет и детектируемый свет прикладываются только к полимерным подложкам, на которых будут проводиться измерения, и записываются значения при фокальных позициях, обеспечивающих самый высокий сигнал при определении с тепловой линзой. В это время измеряются пробы, имеющие толщину, самую близкую к толщине реального кристалла (2 мм), или усредняются результаты измерений для двух проб, различных по толщине.
Далее, для поликарбонатной смолы производства Mitsubishi Engineering Plastic Co. , Ltd. (g) разброс выходного сигнала при определении с тепловой линзой при измерениях в различных положениях является значительным, и может быть предсказано неоднородное распределение веществ, таких как микрокристаллы, поглощающие свет.
Из результатов, показанных на фиг.15, становится очевидным, что существует корреляция между коэффициентом поглощения (преобразованным из оптической плотности), которой обладают полимерные подложки, по существу, и сигналом, получаемым с помощью определения с тепловой линзой. (Длина волны возбуждающего света при детектировании с тепловой линзой: 633 нм).
При осуществлении измерения, когда ксилолцианоловый пигмент (концентрация 5 мкМ) размещен между двумя стеклянными пластинами, в качестве сравнительного измерения, выходной сигнал при определении с тепловой линзой составляет около 20 мВ.
Затем поликарбонатная подложка, имеющая канавки на поверхности, покрывается указанной выше ламинатной пленкой (t=100 мкм) производства Meiko Shokai Co. , Ltd., и ксилолцианоловый пигмет (концентрация 5 мкМ) предназначается для измерений подобным же образом с использованием кристалла, имеющего канавки, сформированные в виде капилляра, но в качестве фона определяется сигнал 10 мВ, и из-за этого фона точное измерение становится сложным. Согласно описанным выше измерениям, оптическая плотность используемой ламинатной пленки равна 0,0085 для t=50 мкм (150 мкм-100 мкм), что составляет около 4% для t=100 мкм, если преобразовывать в коэффициент поглощения. В этом случае, однако, для ламинирования использованной пленки применялся термоусадочный адгезив, и наблюдается разброс значений фона, который может быть приписан его неравномерному распределению. При измерении оптической плотности, однако, поскольку этот разброс усредняется, возможно, что эта парциальный коэффициент поглощения является большим, чем 4%. Кроме того, рассматривая ту возможность, что измеряется проба, имеющая более высокую концентрацию, чем описанный выше ксилолцианоловый пигмент, приемлемый коэффициент поглощения возбуждающего света полимерной подложки в случае измерения в этом диапазоне концентраций может составлять 5%. Это значение является разумным, если сравнивать с оценкой значений, описанной ниже.
Измеренное значение 20 мВ в описанном выше сравнительном измерении является совершенно стандартным значением при измерении биохимических веществ, осуществляемом в медицинской диагностике, и значение 0,0005 получается как величина оптической плотности, если преобразовывать для капилляра глубиной 50 мкм, используемого в измерении. В детекторе с тепловой линзой, используемом в настоящем примере, выходной сигнал синхронного усилителя как предел детектирования, когда используется синтетический кварц, рассматриваемый, как наиболее идеальный прозрачный материал подложки (фон=0 мВ), составляет около 0,5 мВ. Таким образом, является возможным измерение с высокой чувствительностью, при котором концентрация дополнительно уменьшается в один-десять раз, и придание еще более высокой чувствительности к реально измеряемым величинам является предпочтительным при поддержании точности измерительной системы, независимо от того, относится она к медицинской диагностике или нет. Однако, как показано на фиг.5, если полимерная подложка, предназначенная для самого кристалла, имеет поглощение для возбуждающего света, в качестве фона генерируется выходной сигнал от определения с тепловой линзой, вызывая при этом ошибку. Полагая, что по отношению к выходному сигналу от тепловой линзы в 20 мВ для описанного выше ксилолцианолового пигмента (концентрация 5 мкм), полученное измерение составляет до одной десятой от концентрации, и что является возможным принять сигнал, максимально, в десять раз, желательно, максимально, в пять раз, и более желательно, максимально, в два раза более высокий по сравнению с сигналом от измерения вещества-объекта, в качестве приемлемых пределов фона, выходной сигнал был бы 20 мВ, принимая, что до десяти раз, 10 мВ, принимая, что до пяти раз и 4 мВ, принимая, что до двух раз. Глядя на эти значения вместе со значениями измерений, представленными на фиг.15, где учитывается разброс измерений, коэффициент поглощения может быть, желательно, 5% или ниже, предпочтительно 2% или ниже, и более предпочтительно 1% или ниже.
Затем вычисляется разумное численное значение. Предполагая, что это представляет собой реальное значение, измеряется вещество-объект с оптической плотностью в пределах от 2 до 0,01 как величина оптической плотности, преобразованная для случая, когда используется кювета с длиной оптического пути 1 см. Этот значение соответствует от 1 до 97,7% для коэффициента пропускания и от 99 до 2,27% для коэффициента поглощения. Предполагая, что поглощение происходит однородно по всей длине оптического пути, коэффициент поглощения должен составлять от 0,495 до 0,011% вдоль всей длины оптического пути 50 мкм. Предполагая, что является возможным принять сигнал, превышающий до десяти раз, желательно, до пяти раз, и еще более желательно, до двух раз сигнал от измеряемого вещества-объекта в качестве фона, и что уменьшение эффекта тепловой линзы из-за отклонения от фокальной позиции возбуждающего света уменьшается наполовину, могут быть получены значения от 9,9 до 0,22%, считая, что максимально в десять раз, от 4,95 до 0,11%, считая, что максимально в пять раз, и от 1,98 до 0,044%, считая, что максимально в два раза.
То есть эти значения демонстрируют коэффициент поглощения возбуждающего света между его входом и выходом из пластинчатого элемента, образующего кристалл, который принимается в случае, когда вещество с оптической плотностью от 2 до 0,01 в кювете, имеющей длину оптического пути 1 см, помещается в капилляр глубиной 50 мкм для измерения тех же параметров с помощью определения с тепловой линзой. Далее, это означает, что, если коэффициент поглощения возбуждающего света между его входом и выходом из кристалла достигает 10%, измерение веществ, которые могут быть измерены с помощью измерителя коэффициента поглощения при использовании кюветы в 1 см, становится невозможным, даже если можно принять максимальное значение фона. Таким образом, верхний лимит приемлемого диапазона значений реальных коэффициентов поглощения может составлять от 2 до 5%. Это значение может быть разумным, если сравнивать соотношение между описанным выше реальным коэффициентом поглощения полимерной подложки и выходным сигналом при определении с тепловой линзой.
Однако при измерении в будущем вещества, имеющего оптическую плотность, гораздо большую, чем 2, преобразованную для случая, где используется кювета, имеющая длину оптического пути 1 см, величина коэффициент поглощения приемлемых полимерных смол может быть дополнительно увеличена. Однако нет нужды говорить, что, даже если глубина капилляра увеличивается, получаются подобные же эффекты, и коэффициент поглощения используемой полимерной смолы может быть увеличен.
Далее, это является очевидным, что не существует влияния описанного выше фона, в случае, когда оптическая ось детектируемого света сильно сдвинута по отношению к оптической оси возбуждающего света в области кристалла.
Теперь будет описан способ изготовления кристалла, используемого для детектирования реальной биохимической системы.
Плоский пластинчатый элемент, составляющий кристалл, формуется с помощью литьевого формования. Смола, используемая для литьевого формования, является метакриловой смолой (Delpet 560 F производства Asahi Chemical Industry Co., Ltd. ). Что касается газа, используется двуокись углерода с чистотой 99%. В качестве формовочной машины используют SG 50 производства Sumitomo Heavy Industries Co., Ltd. Устройство, показанное на фиг.16, используется в качестве устройства для формовки.
На фиг. 16 вокруг полости 103 формы 101 находится щель 104 для отсоса и выбросов, предназначенная для отсоса и вывода двуокиси углерода из полости 103 формы через зазор 102 поверхности разъема, и такая щель 104 для отсоса и выбросов соединена с источником подачи двуокиси углерода через отверстие 105 для внешней аэрации. Вне пределов полости 103 формы существует кольцевой паз 106 для поддержания полости 103 формы под давлением, в котором помещена кольцевая прокладка 107. Отверстие 105 для внешней аэрации присоединено к источнику 109 двуокиси углерода через газопровод 111. Датчик 110 давления и предохранительный клапан 108 соединены с газопроводом 111.
Поверхность формы формируется путем вставки блока или пуансона 112, и поверхность такого пуансона или матрицы 112 обрабатывается с получением конфигурации тонких капилляров. Эта конфигурация представляет собой конфигурацию, представленную на фиг. 17, и форма канавки в поперечном сечении по линии а-а' представляет собой трапецию (выступ) шириной 301 мкм, глубиной 50 мкм и площадью поперечного сечения 14500 мкм2.
Смолу вводят из порта через литник в полость литейной формы 103.
Изменение условий формируемой поверхности оценивается путем наблюдения с помощью оптического микроскопа и измерений формы с помощью лазерного микроскопа.
Кроме того, формованные продукты наблюдаются путем наблюдения с помощью оптического микроскопа, наблюдения формы канавок в поперечном разрезе с помощью оптического микроскопа и электронного микроскопа, измерение формы с помощью лазерного микроскопа.
С использованием устройства для формовки, показанного на фиг.16, в форму вводится двуокись углерода, при этом температура поверхности полости формы составляет 80oС, а давление в форме 5,0 мПа. Затем метакриловая смола с температурой смолы 240oС инжектируется в форму, смола в цилиндре поддерживается при давлении 80 мПа в течение десяти секунд и охлаждается в течение двадцати секунд, а затем сформованный продукт удаляется. Двуокись углерода, введенная в форму, выпускается в атмосферу одновременно с завершением заполнения смолой, и формуется плоский пластинчатый элемент, имеющий канавки на поверхности.
Поверхность полученного формованного продукта является гладкой, и штампованная канавка, по форме поперечного сечения соответствующая поперечному сечению штампа по линии а-а', имеет ширину 303,0 мкм, глубину 49,7 мкм и площадь поперечного сечения 14300 мкм2. Таким образом, канавка штампуется с точностью по размерам в пределах 2% по ширине и глубине и в пределах 4% по площади поперечного сечения.
Сформованный плоский пластинчатый элемент имеет длину 120 мм и 80 мм, ширину и толщину 2 мм и снабжен канавками, имеющими конфигурацию, представленную на фиг.18. В четырех точках предусмотрены сквозные отверстия диаметром 3 мм для хранения жидкости, и резервуар 213 представляет собой резервуар для пробы, резервуар 214 представляет собой резервуар для реагента 1, резервуар 215 представляет собой резервуар для реагента 2 и резервуар 216 представляет собой резервуар для стока жидкости. Резервуар 213 снабжен фильтром для отделения клеток крови, и когда по каплям вводится проба (цельная кровь), клетки крови, затрудняющие детектирование, удаляют, и плазма крови вводится в капилляр. Что касается размера канавок, канавка 217 имеет ширину 15 мкм, глубину 10 мкм и длину 1 см, канавка 218 имеет ширину 200 мкм, глубину 50 мкм и длину 1 см, канавка 219 имеет ширину 203 мкм, глубину 50 мкм и длину 3 см, канавка 220 имеет ширину 100 мкм, глубину 50 мкм и длину 4 см и канавка 221 (отрезок между точкой слияния с канавкой 220 и областью детектирования) имеет ширину 303 мкм, глубину 50 мкм и длину 5 см. Этот формованный продукт ламинируется с листом из метакриловой смолы толщиной 300 мкм с использованием расплавляемого адгезива с получением кристалла.
Затем для целей усиления электроосмотического потока и очистки внутренней поверхности капилляра в кристалле внутреннее пространство капилляра заполняется 1н раствором NaOH (производство Wako Chemical Co., Ltd.) и нагревается при 60oС в течение двадцати четырех часов. После чего внутреннее пространство капилляра промывается очищенной водой (Kyoei Pharmaceutical Co. , Ltd. ), используя рН как индикатор, до тех пор, пока не наступит нейтрализация, и сушится.
Далее создаются проводники и электроды для соединения с клеммами источника питания в детекторе с помощью наносимой путем печати проводящей краски (MSP-600F, производство Mitsui Chemical Co., Ltd.), содержащей серебряные частицы, на противоположной стороне (стороне со сквозными отверстиями) плоского пластинчатого элемента, и покрытая платиной петелька, выполненная из латуни, устанавливается в качестве электрода для резервуара, завершая кристалл (фигура 19).
Фиг. 20 представляет собой вид поперечного разреза по линии c-c', показанной на фиг. 19. Анализатор снабжен источником электрического питания, способным к приложению заданного напряжения к резервуарам 213-216, детекторам, способным осуществлять детектирование путем фототермического детектирования в положении, обозначенном номером 223 на фиг.19, и принтером для вычисления, а также вывода данных измерений по данным детектирования.
<Количественное определение общего уровня холестерина сыворотки крови>
(Приготовление стандартной сыворотки)
Способ приготовления стандартной сыворотки для измерения липидов от Kyowa Medix Co., Ltd. частично модифицируется, и приготавливается стандартная сыворотка. Конкретно, один флакон высушенного замораживанием продукта растворяют с использованием 851 мкл прилагаемого стандартного раствора для растворения сыворотки и приготавливают таким образом, чтобы общий уровень холестерина был равен 800 мг/дл, как вычисленное значение, таким образом, создается исходный раствор. Затем исходный раствор разбавляется прилагаемым стандартным раствором для сыворотки с получением растворов, содержащих 200 мг/дл и 50 мг/дл общего уровня холестерина, как вычисленное значение.
(Приготовление набора для детектирования)
НА Test Wako Cholesterol E-HA Test Wako (Wako Chemical Industry Co., Ltd.) используется, следуя прилагаемому протоколу.
(Детектирование общего уровня холестерина)
Около 14 мкл буфера добавляют по каплям в резервуар 216, с тем чтобы заполнить весь капилляр буфером, затем по каплям добавляют около 14 мкл реагента 1 в резервуар 214, около 14 мкл реагента 2 в резервуар 215 и около 14 мкл пробы в резервуар 213. Напряжение 100 В по отношению к резервуару 216 прикладывают к электродам резервуаров 213-215, и генерируется электроосмотический поток от резервуаров 213-215 к резервуару 216. В это время производятся точные регулировки, с тем чтобы скорость потока в каждой канавке составляла 1,5 нл/мин в канавке 217, 100 нл/мин в канавке 218, 101,5 нл/мин в канавке 219, 50 нл/мин в канавке 220 и 151,5 нл/мин в канавке 221. Для измерения скорости потока измеряют скорости движения в потоке неполярных шариков (производство Otsuka Electronics, диаметр: 520 нм) для целей удобства эксперимента. Взаимодействие между пробой и реагентом 1 занимает три минуты, но длина канала и приложенное напряжение выбираются с запасом, так что взаимодействие завершается в то время, когда проба смешивается с реагентом для движения в канавке. Подобным же образом, взаимодействие между пробой и реагентом 2 занимает пять минут, но длина канала и приложенное напряжение задаются с запасом, так что взаимодействие завершается в то время, когда проба движется в канавке. Проба, завершившая взаимодействие, определяется в области 223 определения, показанной на фиг.19, с помощью фототермического детектирования, используя лазер с длиной волны 633 нм как источник возбуждающего света, и лазер с длиной волны 780 нм как источник детектируемого света, как будет описано позднее.
В случае, когда объем канала должен корректироваться, в кристалле вблизи резервуара 213 для проб создается резервуар для стандартных проб, стандартная проба вместе с реагентами 1, 2 вводится, ей дается возможность взаимодействовать, и она измеряется, затем делается корректировка, исходя из результатов.
Далее, в качестве источника электрического питания для генерации электроосмотических потоков, высоковольтный источник питания (Model HCZE-30PNO, 25, Matsusada Precision) соединяют с внешним компьютером, и напряжение контролируется с помощью этого компьютера. В это время выходное напряжение высоковольтного источника питания контролируется с помощью интерфейсной платы (DAQCard-1200, 1200CB-50 Connector Block, National Instrument), и программы для управления временным графиком приложения напряжения создаются с использованием программного обеспечения (Nl-DAQ Drive Software, LabVIEW).
(Конфигурация фототермического детектора)
Детектор на основе принципа фототермического преобразования, который используется, показан на фиг. 21 (детали оптических узлов опущены). Что касается микроскопа, используется инверсионный микроскоп (1х70, производство Olympus Co. , Ltd. ), если рассматривать случай манипуляций с пробами на предметном столике. Это также может быть микроскоп с падающим лучом. Этот микроскоп уже модифицирован таким образом, что могут вводиться лазерные лучи, которые являются коаксиальными. Что касается лазеров, He-Ne лазер (633 нм, 10 мВт, производство Edmund Scientific) используют для возбуждения, а инфракрасный полупроводниковый лазер (780 нм, 15 мВт, DL-4034-151, производство Sanyo Electric Co., Ltd.) - для детектирования. Вместо этих лазеров могут быть использованы другие лазеры с соответствующей частотой в зависимости от используемых реагентов и спектра поглощения продуктов взаимодействия.
Тип лазеров включает газовый, твердотельный и полупроводниковый тип без какого-либо ограничения. В оптических системах, таких как зеркала и расширители луча, используются исключительно продукты производства Melles Griot Co. , Ltd. Лазерный луч для возбуждения модулируется прерывателем света, а затем с помощью дихроичного зеркала делается коаксиальным с лазерным лучом для детектирования и вводится в микроскоп для приложения к пробе.
После того как лазерный луч подводится к пробе, при этом возбуждающий свет и детектируемый свет являются коаксиальными, возбуждающий свет удаляется с помощью фильтра, а детектируемый свет подводится к фотосенсору. В качестве элементов принимающей части для лазерного луча из соображений удобства обращения используется усилитель с фотосенсором и с оптоволокном (С6386, производство Hamamatsu Photonics Co., Ltd.). Воспринимающая свет часть этого фотосенсора покрыта крышкой, имеющей маленькое сквозное отверстие. Выходные сигналы от фотосенсора и усилителя сенсора усиливаются с помощью малошумящего предварительного усилителя (LI-75A, производство NF Circuit Block Co., Ltd.), а затем подводятся к синхронному усилителю для обработки сигнала.
Процедуры для детектирования условий в капилляре с использованием этого детектора являются следующими. Как показано на фиг.21, сначала кристалл помещается на предметный столик инверсионного микроскопа. При фокусировке линзы объектива производится фокусировка в положениях верхнего среза и нижнего среза конфигурации капилляров, при этом, обращаясь к экрану монитора, с использованием лазера для возбуждения, а затем средняя точка между верхним и нижним срезами конфигураций капилляра определяется как центральное положение капилляра для достижения фокусировки.
Далее, как описано выше, когда глубина капилляра находится в диапазоне от 50 мкм до 100 мкм, линза объектива может быть юстирована в диапазоне значений NA=0,2-0,8, числовая апертура может быть выбрана из значений 0,2, 0,4 и 0,6, так что может быть получена оптимальная чувствительность. В настоящем примере, однако, глубина капилляра составляет 50 мкм, и наивысшая чувствительность по концентрации может быть получена при использовании детектирования с тепловой линзой, когда используется линза объектива с числовой апертурой 0,4. В этих условиях, в порядке обеспечения получения достаточно эффективного значения и того, чтобы возбуждающий свет не проникал в детектор света, производится проверка для того, чтобы увидеть, что выходной сигнал указанного выше детектирования с тепловой линзой адекватно уменьшается при условии, что поступает только возбуждающий свет. Затем угол сходимости расширителя луча детектируемого света устанавливается в таком положении, чтобы обеспечивался максимальный сигнал, при этом наблюдая выходной сигнал при тепловом детектировании.
В это время, в порядке определения оптимального фокального положения для настоящего примера, кристалл помещается на X-Z предметный столик (производство Sigma Koki), дающий возможность контроля положения кристалла в Z направлении с точностью до мкм, и исследуется изменение выходного сигнала при детектировании с тепловой линзой при изменении положения кристалла в Z направлении. Результат показан на фиг.22. В случае настоящего примера, поскольку акцент делается скорее на чувствительность по концентрации в заданной области, чем на измерение в ультрамикрообласти, фокальная точка возбуждающего света не обязательно находится в центре капилляра. С точки зрения чувствительности по концентрации это возбуждение более выгодно подводить в направлении, перекрывающем весь капилляр, но если возбуждение распределено слишком широко, интенсивность возбуждающего света в области измерений, наоборот, понижается, и теплопроводность воздействует на выходной сигнал детектирования с тепловой линзой таким образом, что он ослабляется, так что существует некоторое оптимальное значение. В случае настоящего примера, как показано на фиг.22, выходной сигнал с помощью детектирования с тепловой линзой получается в пределах ±50 мкм вокруг фокального положения возбуждающего света, а именно в положении на расстоянии 160 мкм от капилляра в плоском пластинчатом элементе, противоположном капилляру, если смотреть со стороны облучения. Это оптимальное значение, разумеется, изменяется в зависимости от ширины и глубины капилляра, и является все еще предпочтительным, чтобы область изменения температуры расширялась в порядке увеличения чувствительности по концентрации.
После осуществления фокусировки проба и реагент поступают в кристалл, осуществляется смешивание и взаимодействие пробы и реагента, и раствор, содержащий продукт взаимодействия, вводится в область для детектирования, как описано выше.
Лазер для возбуждения модулируется с помощью прерывателя света на частоте, например, 116 Гц, а затем продукт взаимодействия, содержащийся в растворе, протекающем в область детектирования, возбуждается с выделением тепла. Частота модуляции этого прерывателя света может изменяться из-за отношения сигнал/шум. Поскольку фокальное положение лазера для детектирования сдвигается из-за тепловой линзы, генерируемой с помощью этого выделения тепла, и, следовательно, количество света, получаемого фотосенсором через малые отверстия, изменяется в зависимости от величины тепловыделения, заданный компонент, содержащийся в пробе, может анализироваться по этому изменению.
Хотя поток пробы может быть либо остановлен, либо продолжаться во время измерения, в настоящем примере измерение производится после остановки потока пробы. Сигнал от фотосенсора обрабатывается с помощью синхронного усилителя, используя в этом случае временную константу в одну секунду, и только сигналы, имеющие ту же частоту, что и прерыватель света - 116 Гц, селективно используются в качестве выходного сигнала. Выходное напряжение синхронного усилителя является пропорциональным концентрации продукта взаимодействия, возбуждаемого возбуждающим светом, тем самым делая возможной количественную характеристику продукта взаимодействия.
Для результата настоящего примера построена калибровочная кривая по пяти измерениям с использованием стандартных сывороток, содержащих 800 мг/дл и 50 мг/дл общего уровня холестерина. Измерение стандартных сывороток, содержащих общий уровень холестерина, равный 200 мг/дл, производится двадцать раз, и получается среднеквадратичный разброс 3%. Согласно описанному выше результату с использованием такого "анализатора" общий уровень холестерина в пробе может детектироваться с хорошей воспроизводимостью.
Пример 2.
В качестве одного из примеров согласно настоящему изобретению будет представлен пример, в котором в целом два раствора, стандартной сыворотки и реагента, полученного путем модификации набора для измерения активности аспарта-аминотрансферазы (GOT) (TA-LN Kainos (Kainos Laboratories Inc.)), контролируются с помощью потока с осуществлением количественного определения аспарта-аминотрансферазы (GOT) в сыворотке, которая измеряется с помощью кинетических исследований. Поскольку это кинетическое исследование, раствор для остановки реакции не используется.
(Изготовление анализатора, содержащего кристалл)
Сначала кристалл формуется с помощью литьевого формования таким же способом, как в примере 1, за исключением того, что выполнены модификации, например давление, при котором двуокись углерода вводится в форму, составляет 2,0 мПа, в качестве метакриловой смолы используется 70 NHX, и пуансон и матрица, имеющие конфигурацию, представленную на фиг.23, используются в примере 1.
Плоский пластинчатый элемент, определяющий собою кристалл, имеет длину 12 см, ширину 8 см и толщину 2 мм и имеет канавки конфигурации, представленной на фиг. 23, сформированные в нем. В трех точках предусмотрены сквозные отверстия с диаметром 3 мм для приема жидкости, резервуары 319, 320 и 321 являются резервуарами для пробы, реагента 1 и стока 2, соответственно. Резервуар 319 снабжен фильтром для отделения клеток крови, и когда по каплям вводится проба (цельная кровь), клетки крови, мешающие детектированию, удаляются, и плазма крови вводится в капилляр. Что касается размеров канавок, канавка 301 имеет ширину 30 мкм, глубину 30 мкм и длину 1 см, канавка 302 имеет ширину 30 мкм, глубину 30 мкм и длину 1 см, канавка 303 имеет ширину 60 мкм, глубину 30 мкм и длину 5 см.
Затем для целей очистки внутренней поверхности капилляров в кристалле внутреннее пространство капилляра заполняется 1н раствором NaOH (Wako Chemical Co. , Ltd.), и нагревается при 60oС в течение двадцати четырех часов. После этого внутреннее пространство капилляра промывается очищенной водой (Kyoei Pharmaceutical Co., Ltd.), используя рН в качестве индикатора до тех пор, пока не будет достигнута нейтрализация, и сушится.
Этот плоский пластинчатый элемент ламинируется с покрывающей пластинкой из ПММА (плоский пластинчатый элемент), имеющей такой же размер, как и указанный выше плоский пластинчатый элемент, и толщину 200 мкм, с использованием адгезива, с образованием капилляра. Затем, в порядке того, чтобы это также могло быть использовано для электрификации с целью введения жидкости, проводники, электроды для резервуаров для жидкости и электрод для соединения с клеммами источника питания наносятся путем печати с помощью проводящей краски (MSP-600F, производство Mitsui Chemical Co., Ltd.), содержащей частицы серебра, на противоположную сторону (сторона со сквозными отверстиями) плоского пластинчатого элемента для выполнения кристалла для анализа (фигура 24). Резервуар формируется в форме конуса, так что нанесение путем печати может производиться на внутренней стенке без приведения кристалла в наклонное положение.
Фиг.25 представляет собой вид в поперечном разрезе по линии а-а' на фиг. 24. Анализатор снабжен источниками электрического питания, способными прикладывать заданное напряжение к резервуарам 319-321. Эти узлы электродов не используются в примере 2, но используются в примере 4, в котором электроосмотический поток используется в качестве средства для введения жидкости. Кроме того, оно снабжено детектором, так что детектирование может осуществляться с использованием фототермического детектирования в положении 329 на фиг. 24, а затем с помощью принтера для вычисления, а также вывода результатов измерений по данным детектирования.
(Приготовление набора для детектирования)
В качестве набора для детектирования используется TA-LN Kainos (Kainos Laboratories Inc.), который авторы специально попросили изготовить в Kainos Laboratories Inc. и купили. Набор отличается от имеющихся в продаже продуктов, в нем раствор натрий 2 3,5-диметокси-N-этил-N-(2-гидрокси-3-сульфопропил)-анилина(DAOS) (Dojin Chemical Laboratory Co. , Ltd.) растворяют в реагенте для детектирования, полученном путем удаления только натрий N-этил-N-(2-гидрокси-3-сульфопропил)-м-толуидина (TOOS) из GOT субстратного буфера таким образом, чтобы при концентрации 10 мМ он использовался как GOT субстратный буфер.
Затем, один флакон реагента GOT растворяют в 8 мл GOT субстратного буфера для создания реагента 1. Эта операция производится таким образом, что отношение смешивания реагента 1 с разбавленной сывороткой, описанной позже, составляет 1:1. Далее, раствор для остановки реакции, используемый в стандартном протоколе TA-LN Kainos, не используется, поскольку осуществляется детектирование для кинетических исследований.
(Приготовление стандартной сыворотки)
В настоящем примере вместо цельной крови используется сыворотка.
Способ приготовления Suitrol А (производство Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) частично модифицируется для приготовления стандартной сыворотки. Конкретно, один флакон полученного сушкой вымораживанием продукта растворяют, используя 1174 мкл очищенной воды (производство Kyoei Pharmaceutical Co., Ltd.), и приготовление производится так, что активность GOT равна 600 единиц Karmen (KU), как вычисленное значение, с получением исходного раствора. Затем исходный раствор разбавляется очищенной водой (производство Kyoei Pharmaceutical), и получают растворы сыворотки (далее упоминаемые как разбавленные сыворотки GOT), включающие уровни GOT с активностью 300 KU, 150 KU и 75 KU, как вычисленные значения. Далее, разбавленные сыворотки GOT, которые соответствуют 75 KU, 150 KU и 300 KU, которые уже были модифицированы, разбавляют в 26 раз по объему субстратным буфером GOT из модифицированного TA-LN Kainos и используют для оценки детектирования GOT. Другими словами, приготавливают раствор из 250 мкл модифицированного субстратного буфера GOT, добавленного к 10 мкл разбавленного раствора GOT.
(Детектирование GOT)
На верхнем срезе капилляра Y-конфигурации микрошприцы (производство Hamilton Co. , Ltd.), в которых помещены реагент 1 и разбавленная сыворотка, соответственно, соединены с использованием тефлоновой трубки и резиновой пробки.
Раствор для использования заранее предварительно нагревают до 37oС, микрошприц соединяют с плунжерным насосом (производство Harvard Co., Ltd.), и вводят раствор.
В это время скорость потока в каждой канавке составляет 1,5 нл/мин в канавке 301, 1,5 нл/мин в канавке 302, и 3,0 нл/мин в канавке 303.
Измерения производятся, начиная от области, где реакция завершается, до каждой точки прохождения реакции, путем сканирования с постоянной скоростью, начиная от резервуара 321 к точке слияния резервуара 319 и резервуара 320, с помощью фототермического детектирования, используя возбуждающий свет с длиной волны 633 нм и детектируемый свет с длиной волны 780 нм.
То есть точка измерения концентрации с помощью фототермического детектирования передвигается со скоростью 1,5 см/с вдоль канавки. Конкретно, позиционирование производится прецизионно путем опознавания позиционирующего маркера, расположенного вблизи канавки, через одну секунду движения, фокусирование достигается визуально, и детектирование осуществляется с помощью фототермического метода в каждой точке измерения в течение десяти секунд. То есть в примере скорость изменения определяемых значений, характеризующих кинетическое исследование, может определяться через короткое время, в зависимости от интервалов между положениями позиционирующих маркеров.
В случае, когда объем канала необходимо корректировать, в кристалле вблизи резервуара для пробы приготавливают резервуар для стандартной пробы, стандартная проба вместе с реагентом 1 вводятся, вступают в реакцию и измеряются до или после измерения пробы, и по этим результатам производится корректировка.
(Конфигурация фототермического детектора)
В качестве детектора, основанного на принципе фототермического преобразования, используется такой же детектор, как в примере 1 (фигура 21).
Что касается микроскопа, используется инверсионный микроскоп (1х70, производство Olympus Co., Ltd.), если рассматривать случай манипуляций с пробами на предметном столике. Это также может быть микроскоп с падающим лучом. Этот микроскоп уже модифицирован таким образом, что могут вводиться лазерные лучи, которые являются коаксиальными. Что касается лазеров, He-Ne лазер (633 нм, 10 мВт, производство Edmund Scientific) используют для возбуждения, а инфракрасный полупроводниковый лазер (780 нм, 12 мВт, DL-4034-151, производство Sanyo Electric Co., Ltd.) - для детектирования. Вместо этих лазеров могут быть использованы другие лазеры с соответствующей частотой, в зависимости от используемых реагентов и спектра поглощения продуктов взаимодействия.
Тип лазеров включает газовый, твердотельный и полупроводниковый тип без какого-либо ограничения. В оптических системах, таких как зеркала и расширители луча, используются исключительно продукты производства Melles Griot Co. , Ltd. Лазерный луч для возбуждения модулируется прерывателем света, а затем с помощью дихроичного зеркала делается коаксиальным с лазерным лучом для детектирования и вводится в микроскоп для приложения к пробе.
После того как лазерный луч подводится к пробе, при этом возбуждающий свет и детектируемый свет являются коаксиальными, возбуждающий свет удаляется с помощью фильтра, а детектируемый свет подводится к фотосенсору. В качестве элементов воспринимающей части для лазерного луча из соображений удобства обращения используется усилитель с фотосенсором и с оптоволокном (С6386, производство Hamamatsu Photonics Co., Ltd.). Воспринимающая свет часть этого фотосенсора покрыта крышкой, имеющей маленькое сквозное отверстие. Выходные сигналы от фотосенсора и усилителя сенсора усиливаются с помощью малошумящего предварительного усилителя (LI-75A, производство NF Circuit Block Co., Ltd.), а затем подводится к синхронному усилителю для обработки сигнала.
Процедуры для детектирования условий в капилляре с использованием этого детектора являются следующими. Как показано на фиг.21, сначала кристалл помещается на предметный столик инверсионного микроскопа. Проба и реагент вводятся в кристалл, осуществляется смешивание и взаимодействие пробы и реагента, как описано выше. Для осуществления измерения производится прецизионное позиционирование путем передвижения предметного столика со скоростью 0,5 см/с и опознавания позиционирующего маркера, помещенного рядом с канавкой, после одной секунды движения. При фокусировке линзы объектива производится фокусировка в положениях верхнего среза и нижнего среза конфигурации капилляров, при этом, обращаясь к экрану монитора, используя лазер для возбуждения, а затем средняя точка между верхним и нижним срезами конфигураций капилляра определяется как центральное положение капилляра для достижения фокусировки.
Лазер для возбуждения модулируется с помощью прерывателя света на частоте 114 Гц, а затем продукт взаимодействия, содержащийся в растворе, протекающим в область детектирования, возбуждается с выделением тепла. Частота модуляции этого прерывателя света может изменяться из-за отношения сигнал/шум и тому подобного. Поскольку фокальное положение лазера для детектирования сдвигается из-за тепловой линзы, генерируемой с помощью этого выделения тепла, и, следовательно, количество света, получаемого фотосенсором через малые отверстия, изменяется в зависимости от величины тепловыделения, заданный компонент, содержащийся в пробе, может анализироваться по этому изменению.
Сигнал от фотосенсора обрабатывается с помощью синхронного усилителя, используя в этом случае временную константу в одну секунду, и только сигналы, имеющие ту же частоту, что и прерыватель света 114 Гц, селективно используются в качестве выходного сигнала. Выходное напряжение синхронного усилителя является пропорциональным концентрации продукта взаимодействия, возбуждаемого возбуждающим светом, тем самым делая возможной количественную характеризацию продукта взаимодействия.
Для результатов настоящего примера построена калибровочная кривая по пяти измерениям с использованием стандартных сывороток, содержащих GOT, демонстрирующих активность 300 KU и 75 KU, и измерение разбавленных сывороток GOT, демонстрирующих активность GOT, равную 150 KU, производится двадцать раз, и получается среднеквадратичный разброс 1%. Согласно описанному выше результату, с использованием такого "анализатора" общий уровень холестерина в пробе может детектироваться с хорошей воспроизводимостью.
Пример 3.
Измерение общего уровня холестерина осуществляется с использованием фототермического детектора, подобного тому, который используется в примере 2, используя кристалл с Y-образной конфигурацией каналов, сделанный из ПММА (фигура 23), изготовленный с помощью литьевого формования, как и в случае примера 2, за исключением того, что в качестве детектируемого света используется Аr лазер, имеющий испускание на 488 нм. Ширина и глубина канавок в канале Y-образной конфигурации в таком кристалле составляют 200 мкм и 50 мкм, соответственно. Cholesterol E-Test Wako производства Waco Chemical Co., Ltd. используют в качестве реагента. Микрошприцы (производство Hamilton Co., Ltd. ), в которых находятся красящий реагент и разбавленная стандартная сыворотка, соответственно, соединяют с обоими срезами в верхней части канала Y-образной конфигурации с использованием тефлоновой трубки. Препарат изготавливается таким образом, что концентрация реагента равна концентрации, определенной для набора реагентов, когда красящий реагент смешивается с разбавленной стандартной сывороткой с отношением потоков 1:1. То есть красящий реагент растворяется с использованием половины заданного количества буфера, а стандартная сыворотка, приготовленная с использованием способа из примера 1, разбавляется буфером в 75 раз. Для введения жидкости используют плунжерный насос (производство Harvard Co. , Ltd.), скорости потоков каждого красящего реагента и разбавленной стандартной сыворотки уравнивают, скорость потока подбирают таким образом, что время взаимодействия после смешивания составляет три минуты, и раствор прокачивается в направлении резервуара для стока на нижнем срезе канала Y-образной конфигурации. Медную пластину и листовой нагреватель помещают под кристаллом и устанавливают такие параметры с помощью термостата и контроллера температуры, что температуру поддерживают при 30oС.
Результат измерений выходного сигнала при детектировании с тепловой линзой представлены на фиг.26.
Пример 4.
Взаимодействие для детектирования общего уровня холестерина осуществляют с использованием оборудования и кристалла, подобных тем, которые используются в примере 3, за исключением того, что в качестве способа введения жидкости используют электроосмотический поток, и Cholesterol E-HA Test Wako от Waco Co., Ltd. используют в качестве детектируемого реагента. На каждом срезе канала Y-образной конфигурации (фиг.23) помещают цилиндрический резервуар с высотой и диаметром около 6 мм и 4 мм, соответственно, на поверхности кристалла, на стороне, противоположной канавкам, с помощью сквозного отверстия. Затем, для целей усиления электроосмотического потока и очистки внутренней поверхности капилляра в кристалле, внутреннее пространство капилляра заполняется 1н раствором NaOH (производство Wako Chemical Co., Ltd.) и нагревается при 60oС в течение двадцати четырех часов. После чего внутреннее пространство капилляра промывается очищенной водой (Kyoei Pharmaceutical Co. , Ltd.), используя рН как индикатор до тех пор, пока не наступит нейтрализация, и сушится.
Затем плоский пластинчатый элемент ламинируется с покрывающей пластинкой (плоский пластинчатый элемент), имеющей такой же размер, как и указанный выше плоский пластинчатый элемент, и толщину 200 мкм, с использованием адгезива, с образованием капилляра. Затем, в порядке того, чтобы это также могло быть использовано для электрификации с целью введения жидкости, проводники, электроды для резервуаров для жидкости и электрод для соединения с клеммами источника питания наносятся путем печати с помощью проводящей краски (MSP-600F, производство Mitsui Chemical Co., Ltd.), содержащей частицы серебра, на противоположную сторону (сторона со сквозными отверстиями) плоского пластинчатого элемента для выполнения кристалла для анализа (фигура 24). Далее, резервуар формируется в форме конуса, так что нанесение путем печати может производиться на внутренней стенке без приведения кристалла в наклонное положение.
Фиг.25 представляет собой вид в разрезе по линии с-c' на фиг.19.
Раствор фермента А и разбавленной стандартной сыворотки, полученный согласно способу примера 1, смешивают заранее, и они взаимодействуют при 37oС в течение пяти минут, а затем помещаются в резервуар 319 на верхней стороне канала Y-образной конфигурации. Затем раствор фермента В помещается в резервуар 320 на другом срезе верхней стороны. Препараты приготавливают таким образом, что концентрация реагента сравнивается с концентрацией, определенной для набора реагентов, когда раствор в резервуаре 319 смешивается с раствором в резервуаре 320 при отношении 1:1. Нижний конец Y-образной конфигурации канала используют в качестве резервуара для стока, канал и резервуар для стока заполняют буфером для растворение раствора фермента А, прилагаемого к набору реагентов, и высота уровня жидкости устанавливается таким образом, что различие в уровне жидкости для каждого резервуара устраняются. Платиновые проволочные электроды помещаются в каждый резервуар, напряжение прикладывается к электродам резервуара 319 для пробы и раствора фермента А и к электроду резервуара 320 для раствора фермента В, при этом резервуар для стока поддерживается при 0 В, при условии формирования градиента потенциала 25 В/см как основы, и напряжение устанавливается таким образом, что отношение скорости потока от резервуара 319 к резервуару 321 к скорости потока от резервуара 320 к резервуару 321 составляет 1:1.
Что касается температуры, для удобства экспериментов устанавливается комнатная температура (26oС).
Результат измерения выходного сигнала с помощью детектирования с тепловой линзой представлены на фиг. 27.
Анализатор согласно настоящему изобретению является анализатором, состоящим из кристалла, выполненного из органического полимера, имеющего тонкие капилляры, через которые протекает флюид, с хорошими свойствами при обращении и массовом производстве, и с фототремическим детектором, который имеет высокую чувствительность и легко миниатюризируется, таким образом становится возможным создание анализатора, который является превосходным по заменяемости кристаллов, способен производить анализы недорого, просто и за короткое время, и является пригодным для анализов НМЛ и тому подобных.
В анализаторе, характеризуемом наличием кристалла и детектора, кристалл представляет собой элемент из органического полимера, имеющий тонкий капилляр, через который протекают проба флюида или проба флюида и флюид-реагент; может осуществляться химическое взаимодействие пробы в капилляре без использования специальных средств взвешивания. Детектор является детектором с фототермическим преобразованием для измерения изменения физической величины, например изменения коэффициента преломления, вызванного частичным изменением температуры пробы и реагента, с помощью приложения возбуждающего света к веществу, которое необходимо измерить. Технический результат: создается малый анализатор, превосходный в отношении переработки использованных кристаллов, способный производить анализ недорого, просто и за короткое время. 12 з.п. ф-лы, 27 ил.
| US 5126022 А, 30.06.1992 | |||
| Ипульсный параметрический стабилизатор постоянного тока | 1977 |
|
SU708331A1 |
| УСТРОЙСТВО ДЛЯ АНАЛИЗА БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ | 1996 |
|
RU2079131C1 |
| US 4316388 А, 23.02.1982. | |||
