СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА Российский патент 1998 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к лабораторным исследованиям, касается способа выявления микобактерий туберкулеза и может быть использовано для диагностики туберкулеза.

Известны различные способы выявления микобактерий туберкулеза:
бактериоскопический, основанный на кислотоустойчивости микобактерий, включающий окрашивание мазков по Цилю-Нильсену и их микроскопию;
бактериологический, основанный на способности микобактерий размножаться на искусственных средах.

Однако современные способы лечения туберкулеза вызывают изменения биологии микобактерий. Под влиянием лекарственных веществ микобактерии частично утрачивают свойство кислотоустойчивости, что затрудняет их выявление бактериоскопическим способом, снижается их жизнеспособность, в результате чего они не могут расти на питательных средах, что исключает их выявление бактериологическим способом.

Наиболее близким к предлагаемому является биологический способ выявления микобактерий, основанный на способности микобактерий размножается в организме чувствительных видов животных (морских свинок, кроликов, белых мышей) и вызывать у них специфические изменения.

Недостатками известного способа являются длительность и связанные с ней материальные затраты. Кроме того, под влиянием антибиотикотерапии у микобактерий снижается вирулентность, что приводит к отрицательным результатам биологического способа.

Цель изобретения ускорение способа при поддержании высокой чувствительности.

Сущность способа заключается в том, что морским свинкам, сенсибилизированным микобактериями, внутрикожно в качестве патологического материала вводят мокроту, которую последовательно обрабатывают щелочью, механическим воздействием, органическим растворителем и кипячением, с последующие учетом аллергических реакций.

Предлагаемый способ основан на свойстве микобактерий антигенов вызывать при внутрикожном введении местные аллергические реакции у сенсибилизированных микобактериями животных.

Осуществимость способа подтверждается примерами.

Пример 1. Морских свинок весом 250 г и выше сенсибилизируют 5 мг бактерийной массы вакцинного штамма БЦЖ (M.bovis). Бактерийную массу в количестве 5 мг тщательно растирают в пробирке с 0,5 мл вазелинового масла, стерилизуют в течение 15 мин в кипящей водяной бане и вводят внутрикожно в две точки на животе (по 0,25 мл). Через три недели определяют степень сенсибилизации животного введением 2 TE туберкулина внутрикожно в заднюю лапу. При размерах реакции 7 мм и выше морские свинки используются в течение 6 7 месяцев. Патологический материал обрабатывают следующим образом. В банки со свежей утренней порцией мокроты (в количестве не менее 10 мл) наливают 30 35 мл 0,1 н. раствора NaOH и тщательно встряхивают со стеклянными бучами. Затем содержимое банок переносят в узкогорлые флаконы емкостью 250 мл и помещают на 30 мин в водяную баню при 60^oC. После этого во флаконы приливают по 1 мл толуола (или бензола), доводят содержимое флакона до 100 мл и плотно закрывают резиновыми пробками. Смесь тщательно встряхивают в течение 10 мин, затем заполняют флаконы дистиллированной водой доверху и оставляют отстаиваться на 45 мин. Верхний слой "флотационное кольцо" собирают в пенициллиновые флаконы, нейтрализуют щелочную среду 0,1н. раствором HCl и высушивают при 35-45^oC в течение 24 ч. Сухой остаток разводят в 0,5 мл физиологического раствора при растирании стеклянной палочки. Суспензию помещают в пробирки или пенициллиновые флаконы и кипятят в течение 3 ч на водяной бане для удаления остатков растворителя. Шерсть на обоих боках морских свинок удаляют. Исследуемый материал вводят внутрикожно в количестве 0,1 мл. При наличии в исследуемом материале антигенов микобактерий у сенсибилизированных морских свинок развивается реакция гиперчувствительности замедленного типа. Учет реакций проводят через 48 ч. Наличие папулы в 5 мл и выше считают положительной реакцией. По окончании опыта животных забивают. Повторное их использование нежелательно.

Пример 2. В табл. 1 и 2 приводятся данные по сравнительной эффективности известных и предлагаемого способов.

Данные, приведенные в табл. 1 и 2, подтверждают более высокую эффективность предлагаемого способа по сравнению с известными, применяемыми в настоящее время в лабораторной практике для выявления микобактерий в патологическом материале. Так, в 16,4 ±2,7% всех излученных образцов патологического материала предлагаемый способ позволил выявить микобактерии при отрицательных результатах двух известных способов. Возможно, что реакция гиперчувствительности замедленного типа, развивающаяся у морских свинок в ответ на внутрикожное введение экстрактов патологического материала, обусловлена наличием в патологическом материале антигенов клеток микобактерий со слабой жизнеспособностью, продуктов лизиса бактериальной клетки, туберкулина или L-форм микобактерий.

Пример 3. Учитывая возможность наличия у микобактерий антигенов, общих с другими микроорганизмами, обсеменяющими мокроту, на морских свинках, сенсибилизированных микобактериями, как в примере 1, исследуют антигены различных микроорганизмов. В экстрактах мокроты, полученных, как в примере 1, определяют белок по методу O.H. Zoiory (1951). Количество белка в экстрактах мокроты колеблется от 213 до 343 мкг/мл. Используют готовые антигены, изготовленные в Казанском научно-исследовательском институте микробиологии и эпидемиологии: аллерген кишечной палочки, аллерген протея мирабилис, аллерген гемолитического стрептококка, аллерген гемолитического стафилококка, кандидозный аллерген, аспергиллезный антиген. В испытуемых антигенах определяют количество белка, перед введением внутрикожно морским свинкам доводят его изотоническим раствором NaCl до 300-320 мгк/мл. Реакцию учитывают через 24 и 48 ч. Ни один из аллергенов не дает положительных реакций у сенсибилизированных микобактериями морских свинок.

Пример 4. Патологический материал от 114 больных с бронхолегочными заболеваниями нетуберкулезной этиологии хронический бронхит 7, экссудативный плеврит 3, бронхиальная астма 7, саркоидоз 1, рак легкого 1, заболевания простудного характера 95 исследуют в соответствии с предлагаемым способом как в примере 1. В 112 случаях получают отрицательные результаты. В 2 случаях диагноз: хронический бронхит, бронхиальная астма, наблюдают положительные кожные реакции размером 7 и 10 мм. При дальнейшем обследовании у больных выявляют ограниченные поражения органов дыхания туберкулезного характера.

Пример 5. Патологический материал от 49 больных туберкулезом обрабатывают, как в примере 1, и вводят внутрикожно 12 интактным морским свинкам с последующим учетом реакции. Во всех случаях получают отрицательные результаты.

Пример 6. Экстракты из тканей здорового легкого исследуют на 5 интактных и 5 сенсибилизированных микобактериями морских свинках. Ткань легкого весом 15,0 мг здорового, погибшего от травмы человека гомогенизируют в 1 мл изотонического раствора NaCl, растирают в фарфоровой ступке. Полученную суспензию обрабатывают так же, как патологический материал в примере 1, и вводят внутрикожно морским свинкам. Положительных кожных реакций не отмечают ни у интактных, ни у сенсибилизированных микобактериями морских свинок.

Предлагаемый способ имеет следующие преимущества по сравнению с известными, применяемыми преимущественно в лабораторных условиях для выявления микобактерий туберкулеза при диагностике заболевания:
1. Высокая эффективность. Способ позволяет обнаруживать в патологическом материале микобактерии, утратившие под влиянием антибиотиокотерапии свои основные свойства тинкториальные, культуральные, вирулентность, а также продукты метаболизма и различные морфологические состояния (зернистые формы, L-формы).

2. Быстрота. Время постановки теста 4 суток. При выявлении микобактерий бактериологическим способом посевы выдерживают в термостате в течение 3 месяцев, при выявлении микобактерий биологическим способом результат можно получить только через 6 месяцев.

3. Экономичность. Одно животное может использоваться для одномоментного исследования 10-12 образцов патологического материала из разных субъектов. Кроме того, в работу могут быть взяты животные, вышедшие из различных опытов с положительной реакцией на туберкулин.

Способ заключается в том, что морским свинкам, сенсибилизированным микробактериями туберкулеза, внутрикожно вводят в качестве патологического материала мокроту, которую последовательно обрабатывают щелочью, механическим воздействием, органическим растворителем и выдерживанием на водяной бане при 60^oС. Реакцию учитывают через 48 ч. Способ чувствителен, прост в осуществлении, обеспечивает получение результата в течение 4 дней, экономичен. 2 табл.

Способ выделения микобактерий туберкулеза, включающий внутрикожное введение морским свинкам, сенсибилизированным микобактериями туберкулеза, антигенного материала с последующим учетом аллергической реакции, отличающийся тем, что в качестве антигенного материала используют мокроту, обработанную для обеззараживания и разрушения предполагаемых микобактерий до состояния водорастворимых антигенов.