УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫЙ СОПОЛИМЕР-1 И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2003 года по МПК C08G69/10 A61K31/785 A61P43/00 

Уровень техники
Сополимер-1 - синтетический полипептидный аналог основного белка миелина (ОБМ), который является природным компонентом миелиновой оболочки. Он был предложен в качестве потенциального терапевтического средства против рассеянного склероза (Eur J.lmmunol. [1971] 1:242; and J.Neurol. Sci. [1977] 31: 433). Все приведенные здесь ссылки полностью включены в эту заявку. Интерес к сополимеру-1 как иммунотерапевтическому средству против рассеянного склероза возник в 1950-х годах, когда обнаружили, что компоненты миелина, такие как ОБМ, предотвращают или задерживают экспериментальный аутоиммунный инцефаломиелит (ЭАИ). ЭАИ является заболеванием, имеющим сходство с рассеянным склерозом, которое может быть вызвано у подверженных этому заболеванию животных.

Сополимер-1 был разработан докторами Села, Арноном и их коллегами в институте Вейсмана (Реховот, Израиль). Было показано, что он подавляет ЭАИ (Eur. J.lmmunol. [1971] 1:242, U.S. Patent 3849550). В последнее время было показано, что сополимер-1 оказывает благоприятное воздействие на пациентов с обостряющейся и ослабевающей формой рассеянного склероза (N. Engl. J.Med. [1987] 317: 408). У пациентов, которым ежедневно вводили сополимер-1, отмечено меньше случаев обострения и меньшее возрастание нетрудоспособности по сравнению с контрольными пациентами.

Сополимер-1 - это смесь полипептидов, состоящих из аланина, глутаминовой кислоты, лизина и тирозина в молярном соотношении примерно 6:2:5:1 соответственно. Его синтезируют, полимеризуя эти четыре аминокислоты с образованием продуктов со средней молекулярной массой 23000 Да (Патент США 3849550).

Задачей изобретения является получение усовершенствованной композиции сополимера-1.

Краткое описание сущности изобретения
Изобретение относится к композиции сополимера-1, по существу свободной от сополимера-1, с молекулярной массой более 40 кДа.

Кроме того, изобретение относится к сополимеру-1, в котором молярная доля с молекулярной массой примерно от 2 кДа до примерно 20 кДа превышает 75%.

Дополнительно, изобретение относится к сополимеру-1 со средней молекулярной массой примерно от 4 кДа до примерно 8,6 кДа.

Изобретение также относится к фармацевтической композиции и к способу лечения рассеянного склероза с применением описанного сополимера-1.

Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 показано распределение молекулярной массы трех проб сополимера-1 и пропорция видов с молекулярной массой выше 40 кДа. На фиг.2 показаны те же данные, относящиеся к молярной доле.

Подробное описание сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к композиции сополимера-1, по существу свободной от сополимера-1, имеющего молекулярную массу более 40 кДа. Эта композиция предпочтительно содержит менее 5% сополимера-1, имеющего молекулярную массу 40 кДа или более. Более предпочтительно композиция содержит менее 2,5% сополимера-1, имеющего молекулярную массу 40 кДа или более.

Изобретение относится также к сополимеру-1, в котором молярная фракция с молекулярной массой примерно от 2 кДа до примерно 20 кДа превышает 75%.

Дополнительно, изобретение относится к сополимеру-1 со средней молекулярной массой от примерно 4 до примерно 8,6 кДа. В частности изобретение относится к сополимеру-1 со средней молекулярной массой от примерно 4 до примерно 8 кДа и к сополимеру-1 со средней молекулярной массой от примерно 6,25 до примерно 8,4 кДа.

Сополимер-1 согласно изобретению может быть получен известными способами, например способом, изложенным в патенте США 3849550, согласно которому N-карбоксиангидриды тирозина, аланина, у-бензилглутамата и Е-N-трифторацетиллизина полимеризуют при температуре окружающей среды в безводном диоксане с диэтиламином в качестве инициатора. Деблокирование у-карбоксильной группы глутаминовой кислоты осуществляют бромистым водородом в ледяной уксусной кислоте с последующим удалением трифторацетильных групп из остатков лизина 1 М-ным пиперидином. В заявке термины "температура окружающей среды" и "комнатная температура" следует понимать как температуру от примерно 20 до примерно 26^oС.

Сополимер-1 с требуемым профилем молекулярной массы может быть получен по существу любым известным способом. Такие способы включают хроматографию сополимера-1, содержащего высокомолекулярные виды, и сбор фракций без нежелательных видов, или частичный кислый или ферментативный гидролиз для удалений высокомолекулярных видов с последующей очисткой диализом или ультрафильтрацией. Другой способ получения сополимера-1 с желаемым профилем молекулярной массы заключается в получении желаемого вида с защищенными аминокислотами и последующем получении необходимого вида непосредственно при снятии защиты. Композиции согласно изобретению могут быть составлены общеизвестными способами. Предпочтительно композицию лиофилизуют или готовят в виде водного раствора, пригодного для подкожной инъекции. Альтернативно, сополимеру-1 можно придать любую из форм, известных для приготовления пептидных лекарств для перорального, назального, буккального или ректального введения.

Обычно пациентам, страдающим рассеянным склерозом, сополимер-1 вводят ежедневно в дозах по 20 мг.

Изобретение описано в примерах, не ограничивающих его объем.

Пример 1
Хроматографический способ получения низкотоксичного сополимера-1
Две пробы сополимера-1 получили известным способом, например, по патенту США 3849550.

Затем одну пробу подвергли хроматографическому разделению, как описано ниже.

Колонку для гельфильтрации FRACTOGEL TSK HWSS (600•26 мм) приготовили в патроне Superbormance 26 Merck согласно инструкции изготовителя. Колонку уравновесили водой и впрыснули раствор ацетона для определения общего объема. Колонку уравновесили 0,2 М-ным буфером ацетата аммония с pH 5,0, нанесли на нее 30 мл проб сополимера-1 (20 мг/мл, в 0,2 М-ном буфере ацетата аммония, pH 5,0), и каждые 10 мин отбирали фракции. Фракция со средней молекулярной массой 7-8 кДа была выделена между 120-130 минутами (Проба А).

Анализ молекулярной массы
Поглощение ультрафиолетового света (ПУС) при 275 нм определяли на спектрофотометре UVIKON 810. Образцы разбавляли для достижения уровня ПУС ниже 1 единицы поглощения. Молекулярное распределение 2-х проб определяли на калиброванной гельфильтрационной колонке (Superose 12).

Было обнаружено, что проба А сополимера-1 имела среднюю молекулярную массу 7-8 кДа. В этой пробе из всех видов сополимера-1 2,5% имели молекулярную массу выше 32 кДа, и не было видов сополимера-1 с молекулярной массой более 40 кДа.

Средняя молекулярная масса другой, не подвергнутой хроматографическому разделению пробы сополимера-1 составила 12 кДа. В этой пробе из всех видов сополимера-1 2,5% имели молекулярную массу выше 42 кДа, а 5% - более 40 кДа.

Пример 2
Анализ на токсичность
A: In Vivo
Три пробы сополимера-1 со средней молекулярной массой 7,3, 8,4 кДа (менее 2,5% сополимера-1 имеет массу более 40 кДа) и 22 кДа (более 5% сополимера-1 имеет массу более 40 кДа) подвергли тесту на токсичность, как описано ниже. В каждом случае использовали по 5 мышей в каждой экспериментальной группе.

Методика
Сополимер-1 растворили в дистиллированной воде для получения раствора с концентрацией активного ингредиента 2 мг/мл. Каждой мыши ввели 0,5 мл испытуемого раствора а вену хвоста. Мыши находились под наблюдением в течение более 48 часов для определения смертности и соответствующих клинических признаков. Результаты наблюдений записывали через 10 мин, 24 часа и 48 часов после инъекции Если к исходу 48 часов все животные были живы и никаких неблагоприятных признаков не было обнаружено, то такая проба считалась "нетоксичной". Если же одна или более чем одна мышь погибла или проявляла неблагоприятные признаки, то такая проба считалась "токсичной".

Пробы со средней молекулярной массой 7,3 и 8,4 кДа были отнесены к "нетоксичным", а в экспериментах с пробой со средней молекулярной массой 22 кДа 3 из 5 мышей погибли к исходу 48 часов, и поэтому ее признали "токсичной".

В: In Vitro
Тест на БЛК - дегрануляцию
I. Введение. Высвобождение из базофильных клеток гистамина (или серотонина) in vitro моделью повышенной чувствительности немедленного типа.

Была получена линия базофильных лейкозных клеток крыс (БЛК-2Н₃), которая представляла собой высоко чувствительную, однородную, легко поддерживаемую в культуре и репродуктивную систему (E.L.Basumian, C.Isersky, M.G.Petrino and R. P. Siraganian. Eur.J.Immunol. 11, 317 (1981)). Физиологический стимул для высвобождения гистамина предполагает связывание антигена с мембранно-связанными молекулами IgE, в результате чего возникают поперечные сшивки последних и последующий запуск сложного биохимического каскада. Кроме этих физиологических иммуноглобулинопосредствованных механизмов запуска дегрануляция может быть вызвана различными не-IgE-опосредствованными причинами. Среди них различные пептиды и синтетические полимеры, например полилилзин (R. P. Siraganian. Trends in Pharmacological Sciences, October 432 (1983)). Поэтому тест на БЛК-дегрануляцию используют, чтобы отобрать те пробы сополимера-1, которые вызывают существенную дегрануляцию и, таким образом, могут вызывать нежелательные локальные и/или системные побочные эффекты.

II. Основы методики испытаний. К базофильным лейкозным клеткам крыс (БЛК-2Н₃) добавляли [³H-серотонин и смесь инкубировали со 100 мг исследуемого сополимера-1. Пробы сополимера-1, вызывающие неспецифическую дегрануляцию, высвобождали [³Н]-серотонин в среду. Радиоактивность в среде определяли сцинтилляционным счетчиком, а общее количество включенного в клетки серотонина определяли в осажденных клетках. Степень дегрануляции вычисляли в процентном отношении высвобожденного из клеток серотонина к общему количеству включенного в клетки.

III. Результаты. Четыре пробы сополимера-1 со средней молекулярной массой в интервале 6250-14500 исследовали для определения в процентах доли видов с молекулярной массой более 40 кДа и на БЛК-дегрануляцию. Результаты обобщены в таблице.

Как видно, когда % сополимера-1 с высокой молекулярной массой низок (<2,5),% выделенного как индикатор токсичности серотонина низок, и наоборот.

Пример 3
Получение трифторацетилсополимера-1
Защищенный сополимер-1 получали, как описано Тейтельбаумом и др. (Eur. J. Immun. Vol.1 p.242 (1971)) из растворенных в 3,5 л диоксана 18 г N-карбоксиангидридов тинозина, 50 г аланина, 35 г у-бензилглутамата и 83 г трифторацетиллизина.

Процесс полимеризации инициировали добавлением 0,01-0,02% диэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов, а затем вливали в 10 литров воды. Продукт (защищенный сополимер-1) отфильтровывали, промывали водой и высушивали. Удаление гамма-бензильных блокирующих групп из остатков глутамата осуществляли обработкой защищенного сополимера-1 33%-ной бромистоводородной кислотой при комнатной температуре в течение 6-12 часов при перемешивании. Продукт вливали в избыточное количество воды, отфильтровывали, промывали и высушивали, получая на выходе трифторацетилсополимер-1.

Пример 4
Получение трифторацетилсополимера-1
Защищенный сополимер-1 получают, как описано Тейтельбаумом (Eur. J.Immun. Vol.1 p.242 (1971)) из растворенных в 3,5 литрах диоксана N-карбоксиангидридов тинозина (18 г), аланина (50 г), τ-бензилглутамата (35 г) и трифторацетиллизина (83 г).

Процесс полимеризации инициировали добавлением 0,01-0,02% диэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов, а затем вливали в 10 л воды. Продукт (защищенный сополимер-1) отфильтровывали, промывали водой и высушивали.

Защищенный сополимер-1 обрабатывали 33%-ной НВr в уксусной кислоте, удаляя защитную омега-бензильную группу из 5-карбоксилатного остатка глутамата, и расщепляли полимер на более короткие полипептиды. Время, необходимое для получения сополимера-1 с молекулярной массой 7000±2000 Да, зависит от температуры реакции и размера защищенного сополимера-1. При температуре между 20-28^oС тест-реакцию проводили для каждой пробы в течение разных периодов времени, например от 10-50 часов.

Результаты, касающиеся молекулярных масс, в этих маломасштабных реакциях подсчитывали и строили кривую зависимости молекулярной массы от времени. Время, необходимое для получения молекулярной массы 7000±2000 Да, рассчитывали по кривой, и этот показатель использовали при реакциях большего масштаба. В среднем при 26^oС время составляет 17 часов. Продукт вливали в избыточное количество воды, отфильтровывали, промывали и высушивали, получая на выходе трифторацетилсополимер-1.

Получение низкотоксичного сополимера-1
20 г трифторацетилсополимера-1 диспергировали в 1 л воды и добавляли 100 г пиперидина. Смесь перемешивали в течение 24 часов при комнатной температуре и фильтровали. Раствор сырого сопопимера-1 распределяли в камеры для диализа и диализовали при 10^o-20^oC против воды до достижения pH=8. Затем проводили диализ против 0,3% уксусной кислоты и снова против воды до получения pH=5,5-6,0. Затем раствор концентрировали и лиофилизовали.

Описывается способ изготовления сополимера-1, представляющего собой смесь полипептидов, состоящих из аланина, глутаминовой кислоты, лизина и тирозина в молярном соотношении примерно 6:2:5:1, с молекулярной массой примерно от 5 до 9 кДа, при котором осуществляют взаимодействие защищенного сополимера-1 с бромистоводородной кислотой с образованием трифторацетилсополимера-1, обработку указанного трифторацетилсополимера-1 водным раствором пиперидина с образованием сополимера-1 и очистку указанного сополимера-1 с получением сополимера-1 с молекулярной массой примерно от 5 до 9 кДа, а также сополимер-1, полученный этим способом. Сополимер-1 предназначен для лечения рассеянного склероза. 2 с. и 4 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл.

1. Способ изготовления сополимера-1, представляющего собой смесь полипептидов, состоящих из аланина, глутаминовой кислоты, лизина и тирозина в молярном соотношении примерно 6:2:5:1, с молекулярной массой примерно от 5 до 9 кДа, при котором осуществляют взаимодействие защищенного сополимера-1 с бромистоводородной кислотой с образованием трифторацетилсополимера-1, обработку указанного трифторацетилсополимера-1 водным раствором пиперидина с образованием сополимера-1, и очистку указанного сополимера-1 с получением сополимера-1 с молекулярной массой примерно от 5 до 9 кДа. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что взаимодействие указанного защищенного сополимера-1 с бромистоводородной кислотой осуществляют в течение примерно 10-50 ч при температуре примерно 20-28^oС. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что взаимодействие указанного защищенного сополимера-1 с бромистоводородной кислотой осуществляют в течение примерно 17 ч при температуре примерно 26^oС. 4. Сополимер-1, представляющий собой смесь полипептидов, состоящих из аланина, глутаминовой кислоты, лизина и тирозина в молярном соотношении примерно 6:2:5:1, с молекулярной массой примерно от 5 до 9 кДа, полученный способом, включающим взаимодействие защищенного сополимера-1 с бромистоводородной кислотой с образованием трифторацетилсополимера-1, обработку указанного трифторацетилсополимера-1 водным раствором пиперидина с образованием сополимера-1, и очистку сополимера-1 с получением сополимера-1 с молекулярной массой примерно от 5 до 9 кДа. 5. Сополимер-1 по п.4, отличающийся тем, что взаимодействие указанного защищенного сополимера-1 с бромистоводородной кислотой осуществляют в течение примерно 10-50 ч при температуре примерно 20-28^oС. 6. Сополимер-1 по п.5, отличающийся тем, что взаимодействие указанного защищенного сополимера-1 с бромистоводородной кислотой осуществляют в течение примерно 17 ч при температуре примерно 26^oС.