ШТАММ СОД ВИРУСА ТЯЖЕЛОГО ОСТРОГО РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА РОДА CORONAVIRUS, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ РАЗРАБОТКИ СРЕДСТВ И МЕТОДОВ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЗАЩИТЫ Российский патент 2005 года по МПК C12N7/00 C12N7/00 C12R1/93 

Изобретение относится к области вирусологии.

Изобретение может быть использовано в вирусологических, серологических, иммунологических и молекулярно-биологических методах исследования для специфического выявления РНК коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома (далее - ТОРС) с помощью полимеразной цепной реакции, антител к нему с помощью иммуноферментного анализа, а также разработки средств и методов биологической защиты.

В марте 2003 года специалистами в Центрах по контролю и профилактике заболеваний (CDC) во Вьетнаме, Сингапуре, Таиланде, Китае (Гонконге), Канаде, Тайване и США был впервые выделен возбудитель вирусной природы из биопроб от больных людей с подозрением на тяжелый острый респираторный синдром ("атипичную пневмонию"). В результате ПЦР-анализа, электронной микроскопии, а также секвенирования всего генома выделенных штаммов возбудителя идентифицирован новый коронавирус, отнесенный к четвертому генотипу [1, 2].

В Российской Федерации, по данным Госсанэпиднадзора, зафиксировано 27 случаев заболевания с подозрением на ТОРС, но подтвердился лишь один. Так, в мае 2003 года из элюата носоглоточного смыва больного С., госпитализированного в районную больницу г.Благовещенска, специалистами ВЦ НИИМ МО РФ был выделен и идентифицирован возбудитель ТОРС, получивший название штамм СоД и относящийся к новому коронавирусу человека IV генотипа [3].

Возможность возникновения повторной эпидемии ТОРС, вызванной новым коронавирусом, обуславливает необходимость разработки средств идентификации возбудителя и диагностики вызываемого им заболевания, а также поиска эффективных средств и методов биологической защиты с использованием выделенного штамма СоД.

В практике диагностических исследований для решения этих задач наиболее часто применяют серологические и молекулярно-биологические методы, чувствительность и специфичность которых во многом определяется качеством антигенсодержащего субстрата. В настоящее время широкое распространение получили методы ИФА и ПЦР, основанные на использовании инактивированных антигенов возбудителей, обеспечивающие высокую специфичность, чувствительность методов и воспроизводимость результатов.

Необходимым элементом при конструировании диагностических тест-систем для идентификации возбудителя и диагностики вызываемого им заболевания, а также поиска эффективных средств и методов биологической защиты в отношении ТОРС является наличие культуры штамма иммунологически полноценного антигена биологически активного вируса, обладающего выраженными патогенными, иммуногенными и протективными свойствами. Такого рода исследования предполагают разработку методики выделения возбудителя из клинического материала, выбор оптимального субстрата накопления вируса ТОРС, получения культуры штамма и рабочих культур, способа концентрирования и очистки, а также метода щадящей инактивации. Кроме того, необходимо провести выбор животных-продуцентов гипериммунных сывороток по отношению к возбудителю ТОРС и методов получения высокоочищенных препаратов антител к нему. Для оценки эффективности имеющихся и разработки новых неспецифических и специфических медицинских средств защиты необходимо выбрать наиболее чувствительный вид животного к возбудителю ТОРС, воспроизводящий основные патогенетические синдромы и симптомы заболевания.

Выделенный штамм СоД вируса ТОРС не имеет аналогов в Российской Федерации.

Целью настоящего изобретения является получение штамма нового коронавируса IV генотипа, предназначенного для приготовления антигенсодержащего субстрата в ИФА при идентификации данного возбудителя и диагностики вызываемого им заболевания, а также идентификации РНК вируса ТОРС в ОТ-ПЦР и оценки эффективности средств и методов биологической защиты в отношении возбудителя ТОРС.

Сущность изобретения состоит в том, что впервые в Российской Федерации в результате вирусологических исследований выделен в мае 2003 г. новый коронавирус IV генотипа - вирус ТОРС, штамм СоД из носоглоточного смыва больного человека, госпитализированного в городе Благовещенске Амурской области. Штамм СоД обладает биологическими характеристиками, позволяющими использовать данный коронавирус в конструировании иммунобиологических препаратов (диагностических тест-систем, иммуноглобулина, вакцины) и оценке их эффективности.

Биологическая активность эталонной культуры возбудителя ТОРС в культуре клеток Vero Е6 составила 7,1 lg ЦПД₅₀·см^-3. Принадлежность к новому коронавирусу человека IV генотипа доказана с помощью ОТ-ПЦР-тест-системы, иммуноэлектронной микроскопии, а также путем секвенирования генома выделенного штамма возбудителя.

Штамм СоД вируса ТОРС размножается в культурах клеток Vero E6 и GMK-AH-1(D). Он не вызывает гибели кроликов, белых мышей (в том числе новорожденных) при подкожном, внутримышечном, интраназальном, внутрибрюшинном и пероральном способах его введения. К новому коронавирусу чувствительны сирийские хомяки массой от 50 до 70 г, инфицированные перорально.

Пример выполнения

Полученный штамм СоД коронавируса возбудителя ТОРС обладает нижеописанными характеристиками.

1. Родословная штамма СоД вируса ТОРС представлена в соответствии с чертежом.

2. Число пассажей к моменту паспортизации 1.

3. Стандартные условия выращивания in vitro

Множественность инфицирования in vitro от 0,0004 до 0,01 БОЕ·кл^-1. Среда культивирования - культура клеток Vero-Е6. Температура культивирования вируса ТОРС (37±0,5)°С.

4. Биологические свойства штамма

Отличительной характеристикой возбудителя ТОРС от других коронавирусов человека является высокая репродуктивная способность в постоянной (перевиваемой) культуре клеток почки африканской зеленой мартышки (Vero-Е6). Оказывает цитопатическое действие на культуру клеток Vero-Е6 через время от 24 до 72 часов после инфицирования.

5. Устойчивость штамма

Хранение в течение 5 месяцев (срок наблюдения) лиофилизированной эталонной культуры штамма СоД при температуре минут (20±2,0)°С вызывает снижение биологической активности вируса на 0,2 IgБОЕ см^-3. Хранение в течение пяти месяцев (срок наблюдения) жидкой рабочей культуры штамма СоД при температуре минус (20±2)°С вызывает снижение биологической активности вируса на (0,6±0,2) lgБОЕ см^-3.

6. Контроль контаминации культуры штамма

Грибковая и бактериальная микрофлора в культуре штамма СоД вируса ТОРС отсутствует.

7. Способ лиофилизации

10% вируссодержащей суспензии культуры клеток Vero-Е6 на 10% растворе сахарозы в дистиллированной воде с 10% желтка куриного яйца.

8. Характеристика эталонного штамма СоД вируса ТОРС представлена в таблице.

Примером наилучшего использования штамма СоД вируса ТОРС может являться его использование в качестве основы для конструирования ИФА-тест-системы, предназначенной для определения антител к вирусу ТОРС в крови людей и ПЦР-тест-системы, предназначенной для выявления РНК вируса ТОРС в биопробах, полученных от больных людей.

Ампулу с культурой штамма извлекают из холодильника, температура хранения (20±2)°С. Монослой клеток Vero E6 инфицируют вирусом ТОРС в дозе 0,005 БОЕ·кл^-1. Продолжительность культивирования составляет 48 часов при температуре (37±0,5)°С.

Вируссодержащую культуральную жидкость сливают, клеточный детрит осаждают с помощью низкоскоростного центрифугирования (2000 об/мин в течение 10 минут). Вирус концентрируют при использовании системы полиэтиленгликоль - 6000 - NaCl (7%-0,3 М) 24 часа при температуре (4±2)°С и осаждают центрифугированием при 2500 об·мин^-1 в течение 20 минут. Осадок ресуспендируют в NTE-буфере и вирус осаждают в ступенчатом градиенте концентрации сахарозы от 10 до 60%. Центрифугирование проводят в роторе SW 27 в течение 2,5 часов при 25000 об·мин^-1 при температуре (4±2)°С.

Культуру штамма СоД вируса ТОРС извлекают шприцем из опалесцирующего кольца на границе раздела раствора сахарозы от 10 до 60%-ной концентрации и диализуют против NTE-буфера в течение 24 часов при температуре (4±2)°С.

Полученный препарат представляет собой концентрированный очищенный препарат вируса ТОРС штамм СоД, который может быть использован:

- в качестве диагностикума в ИФА-тест-системе для определения антител к вирусу ТОРС в крови людей;

- в качестве положительного контрольного образца в ПЦР-тест-системе для выявления РНК вируса ТОРС.

Штамм СоД вируса ТОРС депонирован в Специализированную коллекцию вирусов Вирусологического центра НИИ микробиологии Министерства обороны Российской Федерации за №1136.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. N.Lee, D.Hui, A.Wu, P.Chan et al. A Major Otbreak of Severe Acute Respiratory Syndrome on Hong Kong// N.Engl. J.Med. - 2003. - Vol.348. - №20.

2. T.G.Ksiazek, D.Erdman, C.S.Goldsmith, S.R.Zaki et al. A Novel Coronavirus Associated with Severe Acute Respiratory Syndrome// N.Engl. J.Med. - 2003. - Vol.348, №20. - Р. - 1947.-1958.

3. Онищенко Г.Г., Марков В.И., Максимов В.А. и др. Выделение и идентификация возбудителя тяжелого острого респираторного заболевания от больного атипичной пневмонией// ЖМЭИ. - 2003. - №5. - С.109-112.

Изобретение относится к области вирусологии. Предложен штамм СоД вируса тяжелого острого респираторного синдрома. Штамм выделен из элюата носоглоточного смыва больного человека. Штамм депонирован в Специализированной коллекции вирусов Вирусологического центра НИИ микробиологии Министерства обороны Российской Федерации под №1136. Предложенный штамм является первым выделенным штаммом коронавируса IV генотипа на территории Российской Федерации. Обладает биологической активностью в клетках Vero E6 7,1 lg ЦПД₅₀·см^-3. Предложенный штамм может быть использован в качестве диагностикума в ИФА-тест-системе для определения антител к вирусу ТОРС в крови людей. Кроме того, может использоваться в качестве положительного контрольного образца в ПЦР-тест-системе для выявления РНК вируса ТОРС. 1 ил., 1 табл.

Штамм вируса тяжелого острого респираторного синдрома (ТОРС) рода Coronaviridae, депонированный в Специализированной коллекции вирусов Вирусологического центра НИИ микробиологии Министерства обороны Российской Федерации под №1136, предназначенный для приготовления на его основе диагностических тест-систем для специфического выявления РНК коронавируса ТОРС с помощью полимеразной цепной реакции и антител к нему с помощью иммуноферментного анализа, а также разработки средств и методов биологической защиты в отношении данного возбудителя.