ШТАММ АКТИНОМИЦЕТА STREPTOMYCES AVERMITILIS ССМ 4697 - ПРОДУЦЕНТ АВЕРМЕКТИНОВ Российский патент 2000 года по МПК C12P17/18 C12P17/08 C12P1/06 A01N63/00 A61K35/66 C12P17/18 C12R1/465 

Область техники
Изобретение относится к области микробиологии, в частности к микроорганизмам, продуцирующим авермектины, используемые для производства антипаразитарных препаратов.

Предшествующий уровень техники
Известно, что актиномицет Streptomyces avermitilis при культивировании в присутствии источников углерода, азота и фосфора при постоянной аэрации продуцирует восемь близких по строению веществ, названных авермектинами, которые обладают резко выраженным антипаразитарным действием (патент GB 1573955, 1980 г.). Все авермектины по химическому строению являются 16-членными макролидами и отличаются между собой заместителями у 5 и 26 атомов углеродного кольца. Индивидуальные авермектины, получившие обозначения A_1a, A_1b, A_2a, A_2b, B_1a, B_1b, B_2a и B_2b, имеют различную биологическую активность. Наиболее активными являются авермектины B₁, особенно B_1a.

Развитие технологии получения авермектинов происходит по нескольким направлениям, к числу которых относятся получение штаммов, продуцирующих повышенные количества всего комплекса авермектинов или продуцирующих авермектины с преобладающим содержанием группы B₁.

Известен штамм Streptomyces avermitilis АТСС 31272, продуцирующий в среднем 500 мкг/мл авермектинов (патент US 4310519, 1982 г.). Продуктивность штамма Streptomyces avermitilis ВНИИСХМ-51 (патент RU 2048250, 1995 г.) составляет 700 мкг/мл. Штамм Streptomyces avermitilis ВНИИСХМ-54 продуцирует уже 1500 мкг/мл авермектинов (патент RU 2054483, 1996 г.), причем содержание авермектина B_1a достигает 35% и более. Во всех приведенных случаях авермектины выделяют из мицелия экстракцией индивидуальным органическим растворителем, смешивающимся с водой, с последующим разделением, например хроматографическим.

Сущность изобретения
Авторами получен штамм, продуцирующий еще более высокие уровни авермектинов с повышенным содержанием в комплексе авермектинов группы B₁ (B_1a, B_1b) - наиболее активных в биологическом отношении.

Штамм Streptomyces avermitilis CCM 4697, продуцирует в среднем 2300 мкг/мл авермектинов при размахе изменчивости 2000-3000 мкг/мл. Штамм депонирован в Чешской коллекции микроорганизмов в Брно.

Предлагаемый штамм был получен путем направленной селекции из исходного штамма Streptomyces avermitilis ВНИИСХМ-54 через ряд промежуточных вариантов. Отбор активных вариантов проводили по способности к биосинтезу авермектинового комплекса с содержанием B₁ не менее 36%. Промежуточные варианты характеризовались высокой изменчивостью по авермектинообразованию, что позволяло использовать каждый из них в последующих этапах селекции, но не давало возможности применять в качестве промышленных штаммов. У промежуточных вариантов изменчивость последовательно составляла 50-140%, 49-130% и 78-143%, что соответствовало продуцированию 900-2500 мкг/мл; 950-2500 мкг/мл и 1650-3000 мкг/мл авермектинов.

Полученный штамм характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиологическими признаками.

Культура имеет спороносцы в виде правильных спиралей.

На 2%-ном глюкозокартофельном агаре на 14-21 день роста при 28^oC, pH 6,8-7,2 образуются колонии 7-10 мм с серым воздушным мицелием и темно-каштановой обратной стороной колоний. В популяции, как правило, имеется около 5% серо-белых колоний с бежевой обратной стороной. Край колоний неровный с белым ободком. Поверхность колонии складчатая. К десятому дню роста на поверхности колонии могут образовываться белые бархатистые включения.

В табл. 1 представлены данные о цвете воздушного и субстратного мицелия, интенсивности спороношения, а также о наличии или отсутствии растворимых пигментов на различных органических и синтетических агаризованных средах.

Максимальное накопление авермектинов происходит на 7-8 сутки при скорости растворения кислорода 1,0-1,3 мМоль O₂/л•мин и температуре 28^oC.

Сведения о физиолого-биохимических признаках штамма Streptomyces avermitilis CCM 4697 суммированы в табл.2.

Противопаразитарные свойства
Мицелиальные экстракты вызывают гибель нематод, относящихся к родам: Haemonchus, Trichostrongylus, Ostrertagia, Nematodirus, Cooperia, Ascaris, Bunostomum, Oesophagostomum, Chabertia, Trichuris, Strongylus, Thichonema, Dictyocaulus, Capillaria, Heterakis, Toxocara, Oxyuris, Ancylostoma, Uncinaria, Toxascaris, Ascaridia.

Также их действие губительно для клещей, афидов, вшей, мух, блох, тараканов, двукрылых и прямокрылых вредителей, платяной моли, ковровых и обойных жучков.

Среднее содержание авермектинов в мицелии S. avermitilis ССМ 4697 составляет 2300 мкг/мл при размахе изменчивости 2000-3000 мкг/мл. Компонентный состав авермектинов следующий, %:
группа A₁(A_1a+A_1b) 5,0 - 7,2;
группа A₂(A_2a+A_2b) 21,6 - 24,5;
группа B₁(B_1a+B_1b) 48,5 - 50,0;
группа B₂(B_2a+B_2b) 18,4 - 23,0
Таким образом новый штамм-продуцент S. avermitilis ССМ 4697 позволяет получать на 50% больше авермектинов, чем известный штамм S. avermitilis ВНИИСХМ-54.

Для выделения авермектинов используют сухую биомассу, полученную при выращивании продуцента в глубинных условиях на известных питательных средах.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Пример 1
Споры штамма S. avermitilis ССМ 4697 выращивали на овсяном агаре в течение 10 суток при 27-29 ^oC. Кусочки агаровой среды со спорами внесли в качалочные колбы емкостью 750 мл, содержащие 75 мл среды следующего состава, %: глюкоза - 4,0; соевая мука - 0,6; белково-витаминный концентрат - 0,8; кукурузный экстракт - 0,4; CaCO₃ - 0,1; K₂HPO₄ - 0,05; вода водопроводная. Глюкозу стерилизовали отдельно при 0,6 ати 30 минут и вносили в колбы непосредственно перед засевом. Остальные компоненты стерилизовали при 1,0 ати 40 минут. Значение pH до стерилизации 6,2-6,4.

Колбы установили на качалку с числом оборотов 220 в минуту и выращивали инокулят при 27-29^oC в течение 36 часов. Затем инокулят в количестве 5% перенесли в колбы с ферментационной средой следующего состава, %: глюкоза - 7,0; соевая мука - 0,6; белково-витаминный концентрат - 0,8; кукурузный экстракт - 0,4; CaCO₃ - 0,1; K₂HPO₄ - 0,05; вода водопроводная. Значение pH до стерилизации 6,2 - 6,4. Глюкозу стерилизовали отдельно при 0,6 ати 30 мин, а остальные компоненты при 1,0 ати 40 мин. Глюкозу внесли в колбы непосредственно перед засевом среды инокулятом.

Ферментацию проводили в течение 192 часов при 28^oC на качалках с числом оборотов 220 в минуту.

Определение уровня авермектинообразования проводили следующим образом. По 1 мл образца культуральной жидкости перенесли в пробирки, содержащие по 9 мл этилового спирта, тщательно перемешали и оставили на 30 мин для экстракции авермектинового комплекса, после чего содержимое пробирки профильтровали через бумажный фильтр. Содержание в фильтратах всех компонентов авермектинового комплекса определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, основанным на хроматографическом разделении авермектиновых компонентов на аналитической колонке с обращенной фазой Диасорб С-16 4х250 мм с размером частиц 6 мкм в изократическом режиме. Элюирующей системой служила смесь этилового спирта и ацетонитрила с водой в соотношении 6,5:2,0:1,5.

Детектирование компонентов вели при длине волны 243 нм. Хроматографирование исследуемых образцов проводили в сравнении со стандартным образцом авермектина.

Содержание авермектинов в мицелии S. avermitilis ССМ 4697 составило 2300 мкг/мл. Компонентный состав авермектинов, %:
группа A₁(A_1a + A_1b) 7,4;
группа A₂(A_2a + A_2b) 22,4;
группа B₁(B_1a + B_1b) 49,6;
группа В₂(В_2a + B_2b) 20,6.

Изобретение относится к микробиологии и касается нового штамма актиномицета для производства антипаразитарных препаратов на основе авермектинов. Штамм Streptomyces avermitilis ССМ 4697 получен путем направленной селекции штамма Streptomyces avermitilis ВНИИСХМ-54 через ряд промежуточных вариантов. Отбор активных вариантов проводили по способности биосинтеза авермектинового комплекса с содержанием авермектина группы В1 не менее 36%. Содержание авермектинов в мицелии штамма ССМ 4697 составляет 2300 мкг/мл. Состав авермектинов, %: группа А₁(А_1a + А_1в) - 7,4; группа А₂(А_2а + A_2в) -22,4; группа В₁(В_1a + В_1в) - 49,6, группа B₂(В_2a + В_2в) - 20,6. Мицелиальные экстракты из штамма вызывают гибель нематод, клещей, вшей, мух, блох, тараканов, двукрылых и прямокрылых вредителей, платяной моли, ковровых и обойных жучков. 2 табл.

Штамм актиномицета Streptomyces avermitilis ССМ 4697 - продуцент авермектинов.