Способ получения антибиотика актиноплацина Советский патент 1993 года по МПК C12N1/00 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к.получению антибиотиков лротивобактёриального действия медицинского назначения. Распространение рези- стентных к известным антибиотикам штаммов грамположительных и грамотри- цательных бактерий и повышение их роли в этиологии инфекционных заболеваний определяет необходимость поиска новых эффективных антибиотиков широкого спектра действия. Практическое здравоохранение испытывает острую нехватку высокоэффективных и малотоксичных антибактериальных, препаратов.

Широко известны по литературным источникам и на практике способы получения антибиотиков путем культивирования микроорганизмов, на питательной среде, выделения целе,во.го продукта экстракцией с последующей хроматографичёской очисткой. Однако, в литературе не известны получаемые по этим способам природные антибиотики, которые обладали бы одновременна высокой активностью в отношении .всех групп грамположительных и гра,мот;рицатёльных.бактерий,Брльшинство прирдднь антибиотиков малоактивны или совершенно не активны в отношёнгйи таких устойчив,ь)х форм бактерий, как Proteus и PseudoiTionas.

В способе получения антибиотика по .изобретению культивируют продуцент Kitasatoa species штамм ВНИИА N: 2079 в глубинных аэробных условиях при 27 ±1°С в жидкой питательной среде с рН до стерилизации 7,2-7,3 следующего состава, г/л.

глюкоза20-22

сухой дрожжевой

экстракт3,5-4,5

солодовые ростки1.5-2,5

углекислый кальций 3,0-4,0

родаостальное, экстрагируют влажный мицелий этилацета- том в соотношении 1:3, извлекают антибиотик из полученного экстракта хлористым метиленом, целевой продукт очищают хро- матографически на колонке с полиамидом и элюируют его последовательно хлороформом и смесью хлороформа с метанолом в соотношении 80:20.

Штамм Kitasatoa species 2079 выделен . из почвенного образца N 11542 Аральского района Казахской ССР.

По своим морфолого-культуральным, физиологическим и антагонистическим свойствам штамм отличается от всех известных в литературе видов рода Kitasatoa.

Антибиотик актиноплацин по своим физико-химическим свойствам также отличается от всех известных в научно-технической и патентной документации антибиотиков.

Заявляемый штамм депонирован коллекцией культур микроорганизмов ВНИИ

антибиотиков.

По совокупности свойств штамма и антибиотика аналогов в мировой литературе на найдено.

Морфолого-культуральные,

физиологические, биохимические и антагонистические признаки штамма Kitasatoa species2079 Морфологические признаки. Штамм

5 2079 формирует хорошо развитый воздушный и субстратный мицелий. На поверхности колоний образуются шаровидной формы спорангии разного размера от мелких до крупных (50-60 мкм в диаметре),

0 внутри которых по 2-4 подвижных споры. Подвижность спор наблюдается в первые 40 мин, 1 час после выхода их из спорангия в дистиллированную воду. Кроме спорангиев культура образует и обычные спороносцы,

5 типичные для Streptomyces, Спороносцы спиральные (1-3 завитка), в спирали 12-20 спор. Споры прямоугольные, гладкие, 2x1 мкм.

Культуральные признаки.

0Среда Чапека с крахмалом. Колонии круглые с фестончатым краем, d 10-15 мм, выпуклые. Края колонии ровные. Воздушный мицелий обильный, бархатистый от бледно-сероватого (а-6) до мышино-серого

5 (а-4), Колонии кожистые, радиально исчерченные, центр растрескивается. По краю колонии беловато-сероватый ободок. Есть капли эксудата. Субстратный мицелий от песочного (л-7) до буроватого (6-4). Раствори0 мого пигмента нет.

Среда минеральная Гаузе № 1, Колонии круглые, плоские, края ровные, d 14-17 мм. Воздушный мицелий обильный, бархатистый, мышино-серый (в-4), серый (в-4), по

5 краю белый ободок. Субстратный мицелий темно-бурый (в-6). Растворимый пигмент отсутствует. Глицерин-аспарагиновый агар. Колонии круглые с валиком по краю. Валик плоский, центр колонии сильно приподнят

0 над агаром. Колонии кожистые, складчатые, растрескивающиеся, радиально-исчерчеи- ные, d 10-14 мм.. Воздушный мицелий хорошо развит, серый (в-4). мышино-серый (а-4). Субстратный мицелий темно-бурый (в-6). Вы5 деляет в среду темно-бурый пигмент. Встречаются более мелкие колонии d 5-6 мм с бледновато-сероватым воздушным мицелием (а-б) ближе к белому. Субстратный мицелий темно-бурый. Крахмало-аммиачный агар. Колонии плоские, слегка выпуклые,

cl 15-18 мм. Края колонии равные, опущенные беловато-сероватым воздушным мицелием. Сама колония сильно опущенная, воздушный мицелий обильный, бархатистый, серый (в-4), мышино-серый (а-4). Субстратный мицелий темно-бурый (в-6). Выделяет в среду темно-бурый пигмент.

Среда синтетическая Ваксмана. Колонии круглые, выпуклые с фестончатыми краями d 8-11 мм, кожистые, радиально исчерченные. Середина колонии сильно приподнята над агаром, в центре углубление, центр растрескивается. Воздушный мицелий слабо развит, сероватый, темнее (а-6). Субстратный мицелий желтовато-песочный, желтовато-бурый (д-4). Выделяет в среду слабый буроватый, буро-желтоватый пигмент.

Среда синтетическая СР-1 по Красиль- никову. Колонии круглые с валиком по краю, складчатые, радиэльно исчерченные, кожистые, колонии приподняты над агаром, середина кратерообразная растрескивается, d 10-14 мм. Выделяют в среду слабый буроватый пигмент. Воздушный мицелий от бледно-сероватого (а-6) до серого (в-4),

Кукурузная среда с крахмалом. Колонии круглые с фестончатыми краями, плоские, d 10-15 мм. Колонии радиально исчерченные, складчатые, растрескиваются, в центре точечное углубление. Субстратный мицелий бурый, темно-бурый (в-6). Выделяет в среду бурый пигмент. Воздушный мицелий обильный, серый (в-4), пепельно-серый. Мясопеп- тонный агар. Колонии круглы.е, с фестончатыми краями, выпуклые, d 5-6 мм, радиально исчерченные, центр в виде небольшого плато приподнят над агаром. Колонии голые, восковидные, восково-жел- тые ( оо 331 Выделяют в среду желтовато-буроватый пигмент (светлее д-4).

Картофельный агар. Колонии круглые со слегка волнистыми краями, плоские, центр слегка приподнят над агаром, d 10-17 мм, Воздушный мицелий обильный, темно-серый, (а-2) с крупными каплями эксудата. Субстратный мицелий темно-бурый (в-6). Растворимый пигмент бурый.

Среда органическая с переваром Хот- тин-repa. Колонии круглые с фестончатыми краями, выпуклые, кожистые, радиально исчерченные, кратерообразные, d 8-12 мм. Воздушный мицелий обильный, бархатистый, бледно-сероватый (а-6). Субстратный мицелий темно-бурый (в-6). Растворимый пигмент бурый.

Овсяный агар. Колонии круглые, плоские, d 10-14 мм, с обильным бархатистым воздушным мицелием мышино-серого цвета (а-4). Субстратный мицелий оливково-се- рый (н-1). Пигмента растворимого нет.

Физиологические признаки. Штамм разжижает желатину, но очень медленно (на 21 сутки), молоко не пептонизирует и не коагулирует, на клетчатке не растет, крахмал гид5 ролизует, нитраты не восстанавливает, образует сероводород. Хорошо растет на картофеле, субстратный мицелий бурый, пигмент растворимый бурый, воздушный мицелий обильный серый.

0На среде Придхема-Готтлиба штамм очень хорошо растет, если в качестве единственного источника углерода используют Д-мальтозу, L-арабинозу, i-ионизит, раффинозу, фруктозу, Д-ксилозу, хорошо растет в

5 присутствии глюкозы, сахарозы, Д-маннита, лактозы, рамнозы, галактозы и очень слабо - в присутствии сорбита и крахмала. Биохимические признаки, В составе клеточной стенки штамма содержатся LL-изомер диа0 минопимелиновой кислоты и следующие сахара: глюкоза, рибоза, манноза, рамноза, галактоза. I тип клеточной стенки по классификации Lechevalier. Антагонистические признаки. При определении антагонистиче5 ского спектра установлено, что штамм Kltasatoa species 2079 подавляют рост грам- положительных и грамотрицатель-ных бактерий, актиномицетов, грибов и дрожжей. При глубинной ферментации культура

0 Kitasatoa species 2079 накапливает в клетках протмвобактериальный антибиотик широкого спектра действия.

Способ осуществляют следующим обрэ5 зом.

Биосинтез антибиотика проводили в колбах Эрленмейера на качалке (200-220 об/мин) при 27 ±1°С в течение 96 ч на среде следующего состава, г/л: глюкоза 20-22; су0 хо дрожжевой экстракт 3,5-4,5; солодовые ростки 1,5-2,5; углекислый кальций 3,0-4,0, рН среды до стерилизации 7.2-7.3.

Через 96 ч ферментации антибиотическая активность штамма составляет 200.000

5 ЕД разв./мл в отношении Staphylococcus aureus 5a, 3200 ЕД разв./мл - в отношений Escherichla coli 60 и Klebslella pneumonlal 122 и 6400 ЕД разв./мл в отношении Pseudomonas seruginosa 805 и Proteus

0 vulgaris 7470.

Антибиотик выделяла из влажного мицелия экстракцией этилацетатом. Этилацетат- ный экстракт упаривали до маслообразного остатка, из которого антибиотик зкстрагиро5 вали в хлористый метилен. Метипенхлорид- ные экстракты объединяли, высушивали над прокаленным сернокислым натрием и упаривали до сухого остатка. Остаток промывали эфиром, высушивали на воздухе и получали сырец антибиотика.

Затем сырец хроматографировали на колонке, заполненной полиамидом, используя в качестве элюентов последовательно хлороформ, до получения бесцветных элюа- тов, затем метанол и смесь хлороформ-метанол (80:20). Установлено, что активное вещество мало растворимо в чистом метаноле и чистом хлороформе, однако его растворимость существенно повышается в смеси этих растворителей. Из вариантов смесей хлороформ-метанол 50:50, 10:90, 80:20 последняя оказалась наиболее приемлемой, поэтому она выбрана в качестве элю- ента активного вещества,

Элюат, содержащий антибиотик, упаривали под вакуумом досуха, остаток дважды промывали хлороформом, сушили в вакууме, получали препарат в виде порошка желтого цвета.

Актиноплацин не растворим в воде, очень мало растворим в низших спиртах, хорошо растворим в смесях низших спиртов с хлорированными углеводородами, диме- тилформамиде, диметилсульфоксиде, этила- цетате. Rf 0,45 ±0,05 в системе хлороформ - метанол (80:20). По данным элюентного анализа содержит С - 58,5%; Н - 4,6%; N - 8,43 %. Галогены и сера отсутствуют. По дан- ным С - ЯМР-спектра молекула содержит 42 атома углерода, т.е. с учетом элементного анализа молекулярная масса антибиотика 862, а эмпирическая формула C42H4oOi6N4. Четкой температуры плавления актиноплацин не имеет.

Спектральные данные актиноплацина представлены в табл, 1.

Вещество дает положительные реакции с хлорным железом, реактивом Эрлиха, отрицательные - с нингидрином Молиша.

По совокупности полученных свойств актиноплацин принадлежит к ароматическим антибиотикам, имеющим в своей структуре фенольные ядра, сопряженные с ароматическими или гетероциклическими кольцами.

Природных антибиотиков, содержащих в своей структуре у -хинолоновый цикл в доступной литературе не найдено.

Из природных антибиотиков, содержащих в структуре хромоновый цикл, наиболее близки по совокупности физико-химических и биологических свойств такие антибиоти- , ки, как коумермицин и новобиоцин. Культуры рода Kltasatoa по данным литературы продуцируют антибиотик хлорамфеникол (Matsurnae A., Hata В. - J.Antibiot. A - 1968,

v.21,p.616).

От этих антибиотиков актиноплацин отличается по физико-химическим и антибиотическим свойствам, данные которых приведены в табл.2 и 3.

Выделенный антибиотик высокоэффективен в отношении большинства полирези- стентных микроорганизмов - возбудителей заболеваний человека и животных,

Спектр антибактериального действия актиноплацина включает различные виды грамположительных и грамотрицательных 0 бактерий: стафилококки, цепочковые кокки, эшерихии, протеи, псевдомонады, ряд возбудителей острозаразных инфекций, в том числе устойчивые к другим антибактериальным препаратам (табл.4).

5 Антибиотик не токсичен. LDso составляет более 1000 мг/кг при пероральном введении мышам,

Совокупность выделенных свойств актиноплацина определяет возможность его 0 применения при гнойной патологии человека и животных различной природы и локализации, инфекционных болезнях кишечника, септических процессах и др.

Пример. Для получения антибиотика 5 штамм 2079 культивировали при 27°С на качалке (п 220 об/мин) в колбах Эрлен- мейера емкостью 750 мл, содержащих 100 мл питательной среды следующего состава, г/л: 0 глюкоза20

дрожжевой экстракт

сухой4

солодовые ростки2

углекислый кальций 4 5рН до стерилизации 7,2-7,3

Продолжительность

ферментации96 ч.

Антибиотическую активность штамма определяли методом двукратных серийных 0 разведении в МП Б (Государственная Фармакопея СССР, Хизд. - М; Медицина, 1968).

По окончании ферментации антибиотическая активность ацетонового экстракта из ми- составляла в отношении 5 StaphylococcusaureusSa 200.000 едразв./мл, Escherichiacoll 60 и Ktebstellapneumoniae 122 -3200 Едразв,/мл, Pseudomonas aeruginosa 805-6400 ЕДразв./мл.

По окончании ферментации культураль- 0 ную жидкость (V . 30 л) фильтровали на фильтр-прессе. Получили 1,5 кг влажного мицелия (влажность 80%). Мицелий дважды экстрагировали 4,5-3,0 л этилацетата (соотношение 3:1 и 2:1), Экстракты объединяли, 5 упаривали в вакууме до полной отгонки растворителя. Из 50 мл маслообразного остатка антибиотик дважды экстрагировали 0.1-0,05 л хлористого метилена {соотношение 2:1 и 1:1). Объединенные экстракты вы-. сушивали над прокаленным сернокислым

натрием, упаривали досуха и промывали эфиром порциями 2 раза по 30 мл. Осадок высушивали на воздухе и получали сырец антибиотика в виде порошка темного зеленовато-желтого цвета, Из 1,5 кг влажного мицелия получали 1 г сырца антибиотика.

Сырец затем хроматографировали на колонке (2,5x50 см), заполненной полиамидом, используя последовательно промывку хлороформом (100-500 мл) до получения бесцветных элюатов, затем метанолом (100 мл) и элюирование смесью хлороформ - метанол (80:20).

Выход антибиотика из колонки контролировали с помощью ТСХ на силуфоле в системе хлороформ - метанол (80:20), антибиотика 0,45 ±0,05. Элюат, содержащий антибиотик, упаривали под вакуумом до полного удаления растворителей, остаток дважды промывали хлороформом (2x25 мл),

отфильтровывали и сушили в вакууме. Получали 0,3 г антибиотика в виде порошка желтого цвета.

Активность антибиотика (МПК) 0,0005 мкг/мл в отношении Staphylococcus aureus 5а; 0,15 мкг/мл в отношении Е.соИ 60, Klebslella pneumonlae 122, Pseudomonas aeruginosa 805, Proteus vuigaris 7470.

Варианты осуществления заявляемого способа приведены в табл.5 и 6.

Как видно из табл,5, при использовании II, 111, IV вариантов сред достигается максимальный уровень образования антибиотика. При уменьшении или увеличении концентраций компонентов среды уровень образования антибиотика снижается. (56) Matsumae et al A new genus of the Acdnomycetales Kltauatoa gen.nov - The Journal of antibiotics. 1968, V.XXI/ № 10, p.617-622.

Использование: в биотехнологии при получении антибиотика широкого спектра противобактериального действия Сущность изобретения: продуцент актииоппацина Kftasatoa species штамм 2079 выра- щивзкп а глубинных азообньвс условиях при 27 Т°С в жидкой питательной-среде следующего состава, г/гс глюкоза 20-22; сухой дрожжевой экстракт 35 - 45; солодовые ростки 13 - 25; угле- киспый кальций 3JQ - 4ft вода остальное Затем влажный мицелий экстрагируют этияацетатом в соотношении 1 : 3. Из полученного экстракта антибиотик извлекают хлористым метиленом и очищают хроматографией на колонке с полиамидем, руемой хлороформом и смесью хлороформа с ме- танопом в соотношении 80-20. Антибиотик акти- ноплацин обладает высокой активностью в отношении фамположитеяьных и грамотрицатепьных бактерий, в табл.

Таблица 1

Таблица 2 Сравнение физико-химических характеристик актйноплацина с другими антибиотиками

Сравнение антибактериальной активности актиноплацина, новобиоцина, коумермицина, хлорамфеникола

Таблица 3

Антибактериальная активность актиноплацина

Таблица 4

Таблица 5

Таблица 6

Формула изобретения СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА АКТИНОПЛАЦИНА, заключающийся в том, что культивируют продуцент Kitasatoa species штамм ВНИИ А N 2079 в глубинных аэробных условиях при температуре 27 ± 1 С в жидкой питательной среде с рН до стерилизации 7,2 - 7,3 следующего состава, г/л:

Глюкоза20-22 Сухой дрожжевой экстракт 3,5 - 4,5

Продолжение табл. 6

Солодовые ростки1,5 - 2,5 Углекислый кальций 3,0-4,0 Вода Остально.е экстрагируют влажный мицелий этилзцета- том в соотношении 1 : 3, извлекают антибиотик из полученного экстракта хлористым метиленом, целевой продукт очищают хроматографически на колонке г прлиамидом и элюируют его последовательно хлороформом и смесью хлороформа с метанолом в соотношении 80 : 20.