СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИ-β-ОКСИБУТИРАТА ЗАДАННОЙ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ Российский патент 2003 года по МПК C12P7/04 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/65 

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой способ получения поли-β-оксибутирата (ПОБ) заданной молекулярной массы, который может найти применение в медицине, сельском хозяйстве и промышленности. ПОБ является термопластичным, биодеградабельным и биосовместимым полимером.

Многие микроорганизмы способны синтезировать полигидроксиалканоаты в качестве запасного источника углерода. Молекулярный вес - важный параметр, влияющий на свойства полимера (температура стеклования, проницаемость, растворимость, вязкость). Молекулярный вес синтезируемого полимера зависит от многих факторов, в первую очередь от организма-продуцента. Различные виды бактерий продуцируют полимер разной молекулярной массы. Бактерии рода Azotobacter способны синтезировать полимер от 8•10⁵ до 2•10⁶ Дa (1), водородокисляющие бактерии Alcaligenes eutrophus - от 2•10⁵ до 6•10⁵ Дa (2), а аэробные метилотрофы - от 3•10⁵ до 1,5•10⁶ Дa (3). Все известные способы получения ПОБ позволяют получить полимер определенной молекулярной массы.

Между тем, условия культивирования (состав среды, температура, аэрация и др. ) штамма-продуцента также влияют на молекулярную массу синтезируемого ПОБ. Что касается Azotobacter, то показано значительное изменение молекулярной массы полимера при изменении условий аэрации и соотношения C/N в среде (4), однако изменение этих факторов влияет не только на молекулярную массу ПОБ, но и на его содержание в клетке.

При использовании полимера в разных областях народного хозяйства требуются материалы с различными технологическими свойствами и с разными сроками биоразложения:
в медицине в качестве рассасываемого шовного материала, изделий для остеопротезов, матриц пролонгированного действия лекарств;
в сельском хозяйстве при использовании полимера как обволакивателя семян, фруктов, минеральных удобрений;
в промышленности при изготовлении экологически чистых биоразлагаемых упаковок и различной тары для замены изделий из неразрушаемых жестких пластиков типа полиэтилена.

Технологические свойства и сроки биоразложения в первую очередь определяются длиной молекулярной цепи, то есть молекулярной массой полимера.

Задачей изобретения является создание способа, позволяющего получать полимер с заданной молекулярной массой при культивировании одного и того же продуцента.

Данная задача решается предлагаемым способом получения ПОБ, который предусматривает культивирование бактерий Azotobacter chroococcum 7Б при аэрации на питательной среде, содержащей избыток сахарозы в качестве основного источника углерода, минеральные соли, а также ацетат натрия в качестве дополнительного источника углерода, при этом используют соотношение концентраций основного и дополнительного источников углерода от 40:2 до 40:7, причем концентрацию ацетата натрия определяют по формуле

где С - концентрация ацетата Na (г/л);
М - молекулярная масса (кДа).

Способ осуществляется следующим образом. Штамм Azotobacter chroococcum 7Б выращивают в условиях аэрации на питательной среде, содержащей в качестве основного источника углерода сахарозу или сахаросодержащие отходы, минеральные соли, а в качестве дополнительного источника углерода - ацетат натрия, причем количество ацетата натрия зависит от молекулярной массы полимера, которую требуется получить в данном конкретном случае. Способ применим для получения ПОБ с молекулярной массой от 230 до 1500 кДа. Молекулярная масса получаемого полимера связана с концентрацией в среде ацетата натрия зависимостью

где С - концентрация ацетата Na (г/л);
М - молекулярная масса (кДа),
при этом должно соблюдаться соотношение между основным и дополнительным источником углерода 40:2-40:7.

Штамм Azotobacter chroococcum 7Б является новым, выделен из ризосферы пшеницы дерново-подзолистой почвы Московской области.

Штамм хранится в коллекции Института им. А.Н. Баха РАН.

Штамм имеет следующую характеристику.

Культурально-морфологические признаки.

Крупные клетки овальной формы, грамотрицательные, размером 2,0-2,5х3,5-5,0 мкм с мелкозернистой цитоплазмой и компактным нуклеоидом. Молодые клетки имеют перитрихиальные жгутики, а также фимбрии, способны к движению. С возрастом культура становится полиморфной, клетки соединяются в цепочки, образуют нитчатые формы и сарциноподобные пакеты. В цитоплазме клеток появляется зернистость, связанная с накоплением гранул резервного соединения поли-β-оксибутирата. В этой стадии клетки агрегируются и в жидкой среде легко осаждаются, образуя плотный осадок. Стадия покоя характеризуется образованием цист и слизистых капсул. Колонии на агаризованной среде Эшби - полупрозрачные, беловатые, слизистые, со временем приобретают черный или темно-бурый цвет.

Физиолого-биохимические признаки.

Отношение к источникам углерода - использует глюкозу, сахарозу, фруктозу, галактозу, мальтозу, маннит, крахмал, метанол, этанол, уксусную, лимонную и пропионовую кислоты.

Облигатный аэроб.

Отношение к источникам азота - фиксирует атмосферный азот, использует нитратный азот.

Желатину не разжижает, нитраты не восстанавливает.

Растет при температуре от +10^oС до +40^oС, оптимум роста в диапазоне 28-32^oС.

Диапазон рН, при котором возможен рост - от 5,0 до 8,6 с оптимумом 7,2-7,6.

Штамм продуцирует до 95% ПОБ.

Оптимум биосинтеза ПОБ при 30^oС и рН 7,2.

Для получения ПОБ штамм Azotobacter chroococcum 7Б выращивают в аэробных условиях на питательной среде, содержащей углеводы в качестве источника углерода и минеральные соли. Через двое суток выход биомассы составляет 6-12 г/л (сух.в.), а содержание ПОБ - 70-95%.

Сущность способа поясняется следующими примерами.

Пример 1 (без дополнительного источника С). Штамм Azotobacter chroococcum выращивают в колбах на качалке (180 об/мин) при температуре 28-30^oС в течение 48 ч. Состав питательной среды (г/л): MgSO₄•7H₂O - 0,4; FeSO₄•7H₂O - 0,01; Na₂MoO₄•2H₂O - 0,006; цитрат Na - 0,5; CaCl₂ - 0,1; K₂НРO₄•3Н₂O - 1,05; KH₂PO₄ - 0,2; сахароза - 40. В конце культивирования концентрация биомассы составляет 9,1 г/л, а содержание ПОБ, определенного методом (5), составляет 86%. Молекулярная масса ПОБ 1500±60 кДа.

Пример 2. Способ осуществляют согласно примеру 1, но для получения ПОБ с молекулярной массой 1000 кДа используют дополнительный источник С - ацетат натрия, концентрацию которого определяют по формуле

где С - концентрация ацетата Na (г/л);
М - молекулярная масса (кДа).

При этом выход биомассы - 9,4 г/л, содержание в ней полимера -82%, а молекулярная масса полимера составляет 1000±60 кДа.

Пример 3. Способ осуществляют согласно примеру 1, но для получения ПОБ с молекулярной массой 600 кДа используют дополнительный источник С - ацетат натрия, концентрацию которого определяют по формуле

где: С - концентрация ацетата Na (г/л);
М - молекулярная масса (кДа).

При этом выход биомассы - 9,6 г/л, содержание в ней полимера - 81%, а молекулярная масса полимера составляет 600±60 кДа.

Пример 4. Способ осуществляют согласно примеру 1, но для получения ПОБ с молекулярной массой 333 кДа используют дополнительный источник С - ацетат натрия, концентрацию которого определяют по формуле

где С - концентрация ацетата Na (г/л);
М - молекулярная масса (кДа).

При этом выход биомассы - 9,7г/л, содержание в ней полимера - 81%, а молекулярная масса полимера составляет 300 ± 60 кДа.

Источники информации
1. Патент США 5096819, 1992.

2. Yeom S. H. , Yoo Y.Je. Effect of pH on molecular weight of poly-β-hydroxybutyric acid produced by Alcaligenes sp. // Biotechnology letters, vol.17, 4, pp.389-394, 1995.

3. Yamane Т. Yield of poly-D(-)-3-hydroxybutyrate from various carbon sources: a theoretical study // Biotechnol. Bioeng. V.41, pp.165-170, 1993.

4. Quagliano J.C., Miyazaki S.S. Effect of aeration and carbon/nitrogen ratio on the molecular mass of the biodegradable polymer poly-β-hydroxybutyrate obtained from Azotobacter chroococcum 6B// Appl.Microbiol. Biotechnol., v.48, pp.662-664, 1997.

5. Law J.H., Slepecky A. Assay of poly-β-hydroxybutyric acid. J.Bacteriol. 82:33-36, 1961.

Изобретение относится к биотехнологии. Способ включает культивирование Azotobacter chroococcum 7Б на питательной среде, содержащей избыток сахарозы в качестве основного источника углерода, а также ацетат натрия в качестве дополнительного источника углерода. При этом используют соотношение концентраций основного и дополнительного источников углерода от 40:2 до 40:7. Концентрацию ацетата натрия определяют по формуле где С - концентрация ацетата натрия, г/л, М - молекулярная масса, кДа. Способ позволяет получить полимер с заданной молекулярной массой при культивировании одного продуцента.

Способ получения поли-β-оксибутирата заданной молекулярной массы, отличающийся тем, что осуществляют культивирование бактерий Azotobacter chroococcum 7Б при аэрации на питательной среде, содержащей избыток сахарозы в качестве основного источника углерода, минеральные соли, а также ацетат натрия в качестве дополнительного источника углерода, при этом используют соотношение концентраций основного и дополнительного источников углерода от 40: 2 до 40: 7, причем концентрацию ацетата натрия определяют по формуле

где С - концентрация ацетата натрия, г/л;
М - молекулярная масса, кДа.