Способ получения ацилазы 1 Советский патент 1977 года по МПК C12D13/10 

азотистые органические вещества до 009 и HjO. Углеродное питание штамма характеризуется сбраживанием моно-, ди-, полисахаридов, спиртов и органических кислот. Из последних слабо используют бензойную, гипнуровую кислоту, а также некоторые аминокислоты- глицин, триптофан, лейцин, валин, тирозин.

Зона роста культуры лежит в пределах рН 6,0-9,5, оптимум роста при рН 7-8, температуре 26-28°С. Культура имеет дезаминирующие способности; для лабораторных животных не патогенна.

РТзобретение обеспечнвает повышение выхода биомассы (25% выше известного) за счет более высокой продуктивиости штамма, обеспечивающего направленный биосинтез ацилазы. Упрощение процесса достигается тем, что сокраидается длительность процесса-штамм 636 развивается на простой питательной среде, обеспечиваю1цей ускорение обмена веществ в клетке и сокращение цикла развития клетки. Конец логарифмической фазы развития клетки как период оптимального накопления фермента ацилазы I приходится на 30-й час культивирования. В силу изменения азотиого питания клетки получаемый фермент обладает широким спектром специфичности по отношению к ациламинокислотам: М-ацетил-й /-метионину, N-ацетилс /-аланину, Ы-ацетил-1 /-серину, Ы-ацетил-й фенилглицину, М-хлорацетил- /-фенилглицину.

Биосиитез фермента ацилазы I штаммом 636 совершается путем биологической фиксации азота атмосферы, т. е. метаболизм штамма 636 отличается от известного, развитие которого происходит на аминном и неорганическом азоте. Фосфорное питание обеспечивается фосфатами. Фосфаты совместно с ионами Са2+ буфирируют среду, поддерживая желаемый рН. В условиях интенсивной аэрации углевод (глюкоза или сахароза) обеспечивает углеродное иитаиие клетки и является источником энергии.

Предлагаемый способ заключается в следующем.

Для получения фермента ацилазы I выращивают Azotobacter chroococcum 636 на минеральной среде с 1,5-2% углевода. Среда обеспечивает потребность микроорганизма в фосфоре, углероде, микроэлементах и энергии. Особенности штамма и интенсивная аэрация определяют азотное питание при помощи биологической фикции азота. Ферментация культуры производится при 27°С в аэробных условиях (2 л воздуха на 1 среды) в течение 30 час.

Выход биомассы 25,0 г/л.

Активность ацилазы, ед. на 1 мл культуральной жидкости, к субстратам:

Ы-ацетил-й /-метионин26,7

Н-ацетил- /-аланин30,1

N-aцeтил-й(cep.ин25,8

М-ацетил-(/-фецилглициц13,5

Ы-хлорацетил-й /-фенилглицин 16,1 После ферментации биомассу отделяют центрифугированием, промывают физиологическим раствором и подвергают замораживанию, лиофилизации или обработке ацетоном. Активность такой ацилазы сохраняется до 6 месяцев без иотерь и ее можно применять для ферментативного гидролиза ациламинокислот.

Пример 1. В качестве продуцента ацилазы I используют культуру Azotobacter chroococcum 636. Биосинтез фермента штаммом производится на следующей питательной среде (г/л):

Калий фосфорнокислый однозамещенный1,5

Калий фосфорнокислый

двузамещен ный0,5

Магний сернокислый0,1

Патрий хлористый1,8

Кальций хлористый2,0

Железо хлористое0,01

Марганец хлористый0,01

Патрий молибденовокислый0,01

Борная кислота0,002

Углевод (глюкоза, сахароза)15,0

Глюкозу (1,8%-360 г/л) готовят отдельно, стерилизуют при 0,5 атм 30 мин и стерильно добавляют к ферментационному раствору. Культуру Azotobacter chroococcum 636 поддерживают на 2%-ной агаризованной синтетической среде. Используют культуру после 48 час выращивания на косом агаре, потом пересеивают в колбу с 100 мл жидкой питательной среды, ставят на качалку при 27°С на 24 час (логарифмическая фаза развития клетки). Приготовленный посевной материал используют для инокуляции ферментации - с расчетом 10 мл клеточной суспензии на 1 л цитательиой среды. Ферментацию культуры производят при 27°С с аэрацией (2 л воздуха на 1 л питательной среды) в течение 30 час.

Во время ферментации контролируют прирост биомассы, рП, температуру среды, степень аэрации и активность ацилазы в культур альной жидкости.

Активность ацилазы, ед. на 1 мл культуральной жидкости, к ациламинокислотам: М-ацетил-й/-метионин24,6

Ы-ацетил-й /-аланин31,2

Ы-ацетил-с /-серин33,0

Ы-ацетил-с//-фенилглицин11,2

Н-хлорацетил- /-фенилглицин13,4

Выход биомассы 26,5 г/л.

Формула изобретеиия

Способ получения ацилазы I путем культивирования микроорганизмов рода Azotobacter chroococcum на питательной среде, содержащей источник углерода и сернокислый магиий, при рН 7,2-7,5, отделения биомассы и выделения ацилазы I, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода делево5е го фермента и ускорения процесса, из мик-стый, натрий молибденовокислый и борную

роорганизмов рода Azotobacter chroococcumкислоту.

используют штамм 636, при этом в питатель-Источники информации,

иую среду вводят калий фосфорнокислый од-принятые во внимание при экспертизе

нозамещенный, калий фосфорнокислый дну-5

замещенный, натрий хлористый, кальций хло-1. Патент Японии № 8635, кл. 36/2 35 серистый, железо хлористое, марганец хлори-рия 1. Сборник 426, 1970.

572495