ВЫСОКОМЕЧЕННЫЙ ТРИТИЕМ ТАФЦИН И СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТАФЦИНА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦАХ Российский патент 2003 года по МПК C07B59/00 C07K5/10 A61K51/08 

Изобретение относится к области органической химии и может найти применение в аналитической химии, биоорганической химии, биохимии и прикладной медицине.

При изучении физиологически активных соединений необходимы их меченые аналоги.

Известен тафцин - тетрапептид Thr-Lys-Pro-Аrg формулы:

Данное соединение является природным нейротропным пептидом и иммуномодулятором. Он стимулирует пиноцитоз. В присутствии этого пептида стимулируется также миграция РМN-лейкоцитов. Было обнаружено также, что тафцин стимулирует фагоцитоз (I. Z. Siemion, A. Kluczyk //Pepfetes. 1999. Vol. 20. Р. 645).

Однако меченный тритием аналог тафцина не описан.

Известен способ определения тафцина в биологических образцах, включающий их экстракцию, и анализ полученных экстрактов (Naim J.O., Desiderio D.M., Trimble J., Hinshaw J.R. Analytical Biochemistry. 1987,164, 221-226). Экстракты, полученные данным известным способом, хроматографируют с последующим масс-спектрометрическим анализом требуемой фракции - прототип. Однако данный известный способ требует наличия сложного оборудования, является трудоемким и дорогим. Кроме того, низкая чувствительность способа требует больших объемов исследуемых биологических образцов (10-20 мл).

Техническим результатом, достигаемым настоящим изобретением, является расширение ассортимента меченых аналогов физиологически активных соединений, разработка условий определения микроколичеств тафцина в малых объемах биологических образцов.

Указанный технический результат достигается получением высокомеченного тритием тафцина.

Достигается данный технический результат также тем, что в способе определения тафцина в биологических образцах, включающем их экстракцию и анализ полученных экстрактов, отличительной особенностью является то, что предварительно в образец вносят высокомеченный тритием тафцин, в приготовленном экстракте тафцин и его меченый аналог превращают в их бензоиновые или ортофталевые производные, которые затем анализируют методом ВЭЖХ с флуоресцентным детектированием.

Собственные исследования показали возможность определения методом ВЭЖХ значительно меньших количеств тафцина, если определять не природный тафцин, а его ортофталевое или бензоиновое производные. Природный тафцин можно детектировать только по оптическому поглощению, а его ортофталевое и бензоиновое производное - флуоресцентным детектированием, что повышает пороговую чувствительность определения в 10-1000 раз.

Найденный предел обнаружения тафцина в виде его ортофталевого производного для образцов плазмы крови и ликвора составляет 50-60 нг/мл. Предел обнаружения тафцина в виде производного с бензоином для образцов плазмы крови и ликвора - 3-4 нг на пробу.

Способ реализовали следующим образом.

Фракцию тафцина (содержащую биогенный тафцин и добавленный меченный тритием тафцин) собирали и определяли ее молярную радиоактивность MR (отношение радиоактивности фракции к количеству содержащегося в ней тафцина). Затем рассчитывали исходную концентрацию тафцина в биологической пробе методом изотопного разбавления.

Расчет концентраций тафцина методом изотопного разбавления.

Расчет концентраций тафцина по методу изотопного разбавления проводится по следующему уравнению:
C=M/V,
где С - концентрация тафцина [нг/мл],
V=1 мл - объем взятой пробы,
М=А/MR₀•MW•(MR₀/MR-1),
или в данном случае
C=5,762•(84/MR-1),
где А=1 мкКи - активность тафцина, добавленного в пробу,
MW=484 - молекулярный вес тафцина;
MR - конечная молярная радиоактивность меченого аналога тафцина после добавления в пробу [Ки/ммоль].

MR₀= 84 Ки/ммоль - исходная молярная радиоактивность меченого аналога тафцина до добавления в пробу.

Сущность метода изотопного разбавления заключается в уменьшении молярной радиоактивности тафцина за счет его разбавления немеченым эндогенным тафцином из биологической пробы. И чем больше нативного тафцина будет в пробе, тем больше будет отношение MR₀/MR. Метод изотопного разбавления позволяет учесть потери тафцина при подготовке пробы и при проведении реакции получения производных тафцина, которые определяют методом ВЭЖХ с флуоресцентным детектированием.

Ниже приведены примеры, иллюстрирующие изобретение.

Пример 1. Синтез меченного тритием тафцина
В 15 мл колбу помещают и интенсивно перемешивают 50 мг 5% Pd/СаСО₃ и раствор 10 мг тафцина и 10 мг RhCl₃ в 2,0 мл воды. Приготовленную смесь замораживают жидким азотом и лиофилизируют. Сухой остаток переносят в реакционную ампулу, вакуумируют до давления 0,1 Па, напускают газообразный тритий до давления 400 гПа и ведут реакцию при 170^oС 30 мин. Затем избыточный тритий удаляют вакуумированием. Содержимое ампулы растворяют в воде (3•5 мл), фильтруют, катализатор промывают водой (3•1 мл), фильтраты объединяют. Лабильный тритий удаляют трехкратным упариванием реакционной смеси с водой (3•3 мл). Остаток очищают методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), см. табл. 1. Выход меченого тафцина составляет 5-10%, молярная радиоактивность - 80-90 Ки/ммоль.

Пример 2. Приготовление ортофталевых производных тафцина
Приготовление реактива.

24 мг ортофталевого альдегида растворяют в 1 мл метанола, добавляют 20 мкл меркаптоэтанола и 9 мл 0,4 М боратного буфера (рН 10,4). Раствор сохраняется в холодильнике под аргоном в течение недели.

Приготовление производного.

К анализируемой биологической пробе добавляют 25 мкл рабочего раствора приготовленного реактива, смесь встряхивают 20-30 с, добавляют 25 мкл метанола, еще встряхивают 20-30 с, 25 мкл реакционной смеси заводят в хроматограф.

Пример 3. Приготовление бензоиновых производных тафцина.

К высушенной биологической пробе добавляли реагенты в следующем порядке:
50 мкл (4 мМ бензоин в метилцеллозольве, 2 мг/мл),
50 мкл (0,2 М сульфит натрия, 25 мг/мл),
50 мкл (0,1 М меркаптоэтанол, 10 мкл/мл),
50 мкл (0,5 М NaOH).

После тщательного перемешивания раствор выдерживали 30 мин при 45^oС. Реакция прекращается добавлением 50 мкл (0,25 М трис-НСl+0,5 М HCl). 50 мкл раствора заводят на колонку для анализа.

Анализ биологических проб проводят методом ВЭЖХ (см. таблицу 1). Для расчета концентрации тафцина используется метод изотопного разбавления. Детектирование элюента по флуоресценции проводили с помощью флуориметра FP820 фирмы Jasco, позволяющего независимо настраивать длины волн возбуждения и флуоресценции.

Пример 4. Твердофазная экстракция тафцина из ликвора.

В полипропиленовый наконечник объемом 1 мл помещают около 50 мкл сорбента LiChrosorb C₁₈, 30-40 мкм. Полученный патрон последовательно промывают 300 мкл метанола, 3 раза по 300 мкл 0,25% раствора трифторуксусной кислоты (ТФК). В микропробирке смешивается 50 мкл ликвора, 50 мкл 0,25% р-ра ТФК, 1 мкКи [³Н]тафцина. Полученная смесь наносится на подготовленный микропатрон с сорбентом и продавливается аргоном. Патрон промывается 2 раза по 50 мкл 0,25% ТФК, затем содержащая тафцин фракция смывается 2 раза по 50 мкл 0,25% ТФК в метаноле и упаривается в вакуум-эксикаторе до объема около 30 мкл. Выход тафцина (по метке) 30-50%.

Пример 5. Твердофазная экстракция тафцина из ликвора
В этом варианте используется ион-парный реагент (пентансульфонат натрия) для увеличения константы сорбции тафцина на фазе C₁₈. Показано, что присутствие пентансульфоната натрия не мешает реакции образования производных тафцина. В полипропиленовый наконечник объемом 1 мл помещают примерно 50 мкл сорбента LiChrosorb C₁₈, 30-40 мкм. Полученный патрон последовательно промывают 300 мкл метанола, 3 раза по 300 мкл раствором 10 мМ раствора пентансульфоната натрия в 50 мМ растворе КН₂РО₄ (рН 5) (раствор А). В микропробирке смешивается 50 мкл ликвора, 100 мкл раствора (А) ТФК, 1 мкКи [³Н]тафцина. Полученная смесь наносится на подготовленный микропатрон с сорбентом и продавливается аргоном. Патрон промывается 2 раза по 100 мкл раствором (А), 2 раза по 100 мкл смесью 10% метанола в растворе (А), затем содержащая тафцин фракция смывается двумя порциями по 50 мкл смесью 30% метанола в (А) и лиофильно высушивается. Выход тафцина (по метке) 85-90%.

Пример 6. Твердофазная экстракция тафцина из плазмы крови
200 мкл LiChrosorb C₁₈, 30-40 мкм помещают в 1 мл патрончик. Патрончик последовательно промывают 500 мкл метанола и 2•500 мкл (А). К 500 мкл плазмы крови добавляют 1 мкКи [³Н]тафцина, 500 мкл раствора (А) и наносят на патрончик. Промывают патрончик 2•500 мкл (А), затем 500 мкл смеси (метанол -(А), 10: 90), затем 250 мкл смеси метанол-вода-ТФУ (10:90:0,1). Тафцин смывают 500 мкл смеси метанол-вода-ТФУ (30:70:0,1). Раствор высушивают на лиофильной сушке для последующего получения производных. Эта методика позволяет выделять из биологической жидкости 85-90% содержащегося тафцина.

Пример 7. Анализ тафцина в биологических образцах.

Разработанная методика (примеры 2-6) использовалась для определения тафцина в биологических образцах ликвора и плазмы крови методом ВЭЖХ с использованием ортофтафталевых и бензоиновых производных (табл.2).

При этом было показано, что с использованием метода, предусматривающего анализ ортофталевых производных, возможно определение концентрации тафцина в спиномозговой жидкости и плазме крови только свыше 50 нг/мл (предел обнаружения метода), а с использованием метода анализа бензоиновых производных - от 3-4 нг/мл
Таким образом, получен высокомеченный тритием тафцин. Разработан новый способ анализа, позволяющий определять тафцин в биологических образцах в нанограммовых количествах.

Изобретение относится к новому соединению - меченному тритием тафцину и способу определения тафцина в биологических образцах, включающий введение предварительно в образец высокомеченного тритием тафцина, экстракцию, превращение в приготовленном экстракте тафцина и его меченого аналога в их бензоиновые или ортофталевые производные, которые затем анализируют методом ВЭЖХ с флуоресцентным детектором. Предлагаемый тафцин является высокомеченым соединением, а способ позволяет определять микроколичества тафцина. 2 с.п.ф-лы, 2 табл.

1. Высокомеченный тритием тафцин формулы:

2. Способ определения тафцина в биологических образцах, включающий их экстракцию и анализ полученных экстрактов, отличающийся тем, что предварительно в образец вносят высокомеченный тритием тафцин, в приготовленном экстракте тафцин и его меченый аналог превращают в их бензоиновые или ортофталевые производные, которые затем анализируют методом ВЭЖХ с флуоресцентным детектированием.