6-(3-АЦЕТИЛФЕНИЛ)АМИНОУРАЦИЛ Российский патент 2003 года по МПК C07D239/545 A61K31/513 A61P31/18 A61P31/22 A61P37/00 

Изобретение относится к медицине, точнее к фармакологии, ветеринарии, конкретно к синтетическим биологически активным производным 6-аминоурацила. Указанное производное имеет, в частности, выраженную активность как индуктор интерферона, а также активность по отношению к вирусам простого герпеса. Основное назначение соединения - использование в медицинской практике. Соединение показано для лечения вирусных заболеваний, вызванных хламидиями, а также заболеваний, сопровождающихся иммунодефицитом, в частности, злокачественных новообразований. Кроме того, предложенное соединение может применяться в ветеринарии для тех же целей.

Одна из серьезных проблем современной медицины - заболевания, вызванные микробами. Лечение инфекций, вызываемых вирусами, весьма затруднено вследствие недостаточной эффективности существующих препаратов и изменчивости вирусов. Как известно, в борьбе с вирусными и бактериальными заболеваниями важную роль играют интерфероны, вырабатывающиеся клетками организма [Ершов Ф. И. Система интерферона в норме и при патологии. Медицина, Москва, 1996, 240 стр. ]. В терапии микробных инфекций используются как экзогенные интерфероны, так и индукторы эндогенных интерферонов. Число последних крайне ограничено. Одной из актуальных проблем борьбы с микробными заболеваниями является создание новых препаратов, пригодных для индукции синтеза в организме человека собственных эндогенных интерферонов. Также известно, что стимуляция синтеза интерферонов способствует борьбе организма против злокачественных опухолей [Ершов Ф.И. Система интерферона в норме и при патологии. Медицина, Москва, 1996, 240 стр.].

Известны некоторые производные 6-аминоурацилов [авт. св. СССР 170061, МКИ 4 C 07 D 239/10, опубликован БИ 08,65; авт. св. СССР 176910, МКИ 4 C 07 D 239/10, опубликован БИ 24,65; Заявка ФРГ 206453; М.Д. Машковский. Лекарственные средства, ч. 1, Москва, Медицина, 1993, с. 550 - прототип; Goldner, Dietz, Carstens // Ann. Chem, 1966, 691, р. 142; // Ann.Chem., 1966. 698, р. 145; // Ann. Chem., 1966, 699, р. 145; Рубцов М.В., Байчиков А. Г. Синтетические химико-фармацевтические препараты, Москва, Медицина, 1971, с. 2552-7].

В частности, в работе М.В. Рубцова и др. [Рубцов М.В., Байчиков А.Г. Синтетические химико-фармацевтические препараты, Москва, Медицина, 1971, с. 255] описан аллацил (1-аллил-3-этил-6-аминоурацил) - активный диуретик, применяющийся как мочегонное средство при застойных явлениях, связанных с сердечно-сосудистой недостаточностью. Его структура приведена ниже

Для некоторых производных 6-аминоурацилов показана специфическая биологическая активность, описанная, в частности, в работе М.Д. Машковского [М. Д. Машковский. Лекарственные средства, ч.1, Москва, Медицина, 1993, с. 550 - прототип] - см., например, 6-[[3-[4-(2-Метоксифенил)-1-пиперазинил]пропил] -амино] -1,3-диметилурацил. В общем виде химическими, структурными аналогами предложенного нового вещества являются производные 6-аминоурацила общей формулы

где R - фенил, 2-метилфенил, 3-метилфенил, 4-метилфенил, 4-бромфенил, 2,4-диметилфенил, 2,5-диметилфенил, 2,6-диметилфенил, 2-хлорфенил, 3-хлорфенил, 1-нафтил, 2-нафтил, циклогексил [Goldner, Dietz, Carstens // Ann. Chem, 1966, 691, р. 142; // Ann. Chem., 1966, 698, р. 145; //Ann. Chem., 1966, 699, р. 145].

Известные источники информации не содержат сведений о какой-либо показанной ими выраженной биологической активности.

Наиболее близок к заявляемому соединению по химической структуре - 6-[[3-[4-(2-Метоксифенил)-1-пиперазинил] пропил] -амино] -1,3-диметил-урацил, структура которого приведена ниже.

Выше уже отмечено, что это соединение описано в работе [5]. Оно оказывает гипотензивное действие. Обычно указанный препарат применяют для снижения артериального давления при гипертонических кризах. Другие применения препарата по доступным источникам информации нам неизвестны. Оно выбрано нами в качестве прототипа.

Задачей изобретения является создание нового вещества, стимулирующего выработку эндогенных интерферонов, а также имеющего противовирусную активность, то есть обладающего иммуностимулирующим и противовирусным действием.

Поставленная задача решается путем синтеза нового производного 6-аминоурацила, а именно -6-(3-ацетилфенил)аминоурацила. Это химическое соединение гетероциклического ряда относится к новой группе из класса замещенных 6-аминопуринов.

Соединение имеет химическую формулу (1)

Растворитель ДМСО и результаты анализа, Т.пл. больше 300^oС. Структура соединения была доказана методом спектроскопии ПРМ (протонного магнитного резонанса).

Заявляемое соединение ново - сведений о нем нет ни в одном из доступных источников информации.

Заявляемое соединение и его биологическая активность неочевидны для специалиста, исходя их приведенных выше сведений об аналогах и прототипе, имеющем биологическую активность в совершено другой области, никак очевидным образом не связанной с задачей изобретения. Получение оригинального эффективного биологически активного вещества - полезный результат большого количества экспериментов, опыта и интуиции.

Сущность предложенного изобретения поясняют приведенные далее.

Пример синтеза заявленного вещества и результаты его идентификации.

Экспериментальные исследования биологической активности заявляемых соединений, а именно:
Эксперимент 1. Исследование антивирусной активности (действия заявляемого соединения на вирус герпеса).

Эксперимент 2. Исследование интерферониндуцирующей активности заявляемого соединения.

Эксперимент 3. Определение острой токсичности.

В таблице 1 представлено действие заявляемого соединения на вирус простого герпеса при концентрации испытуемых соединений 100 мг/л.

В таблице 2 представлена количественная оценка ИФН - индуцирующей активности заявляемого соединения: содержание ИФН в индукционной смеси после 24 ч инкубации при различных концентрациях препаратов, МЕ/3•10⁴ лимф./мл.

Синтез заявляемого соединения
Способ получения целевого продукта основан на взаимодействии 6-хлорурацила с соответствующим ароматическим амином в водном растворе при температуре кипения.

Пример синтеза заявляемого соединения
К 12,7 г гидрохлорида 3-ацетиланилина и 10 г 3-ацетиланилина добавляют 10,8 г 6-хлорурацила и тщательно перетирают смесь в ступке. При нагревании до 160^oС смесь плавится и становится легкоподвижной, но уже через 0,5 ч затвердевает, нагревание прекращают через 1,5 ч. Смесь переносят в воду, перемешивают и фильтруют, промывают водой, спиртом, эфиром, высушивают. Перекристаллизацией из смеси изопропанол-ДМФА (1:1) получают целевой продукт.

Структура полученного соединения доказана с помощью метода ЯМР спектроскопии на ядрах ¹H и ¹³С. Характерными в спектре ПМР являются сигналы протонов иминогрупп пиримидинового кольца в области 10-12 м.д. и метиновых протонов пиридинового кольца 4-6 м.д. В спектрах ЯМР ¹³С характерными являются сигналы С⁵ 70-100 м.д. - для углеродных атомов арильного кольца.

Экспериментальные исследования биологической активности заявляемого соединения
Эксперимент 1. Исследование антивирусной активности (действия заявляемого соединения на вирус герпеса)
Антивирусная активность изучалась по отношению к вирусу герпеса I типа на перевиваемой культуре клеток Vero.

Схема постановки опыта
Вирус добавляли к клеткам со средой RPMI-1640, содержащей 10% телячьей сыворотки, которые были получены в 96-луночном плато. Исходная концентрация вируса - 10-12 частиц на мл. Концентрация вещества при исследованиях была 100, 10 и 1 мг/л. После инкубации при 38^oС в СO₂-инкубаторе вирус удаляли и меняли среду. Результаты оценивались по цитопатогенному действию вируса на клетки после инкубации при 38^oС в СO₂-инкубаторе в течение 36 ч.

Результаты показывают, что заявляемое соединение обладает антигерпетической активностью, сравнимой с таковой у наиболее популярного препарата - ацикловира.

Эксперимент 2. Исследование интерферониндуцирующей активности заявляемого соединения.

Индукцию синтеза интерферонов заявляемым препаратом проводили на первичной культуре человеческих лимфоцитов. Использовалась свежая кровь здоровых доноров (не более 12 ч после забора). Выделение лимфоцитов осуществляли следующим образом. Гепаринизированная кровь центрифугировалась в градиенте плотности фиколл-верографин 1,71 г/см³ для выделения фракции иммунокомпетентных клеток. Указанная фракция после ее отбора разводилась питательной средой RPMI-1640. Указанная питательная среда содержала 5% эмбриональной телячьей сыворотки, 0,3 мг/мл L-глутамина, 100 ед./мл пенициллина, 50 мг/мл стрептомицина. Лимфоциты окрашивали метиленовым синим в камере Горяева, после чего определяли их концентрацию. Концентрации веществ, после соответствующего разведения исходных растворов заявляемых веществ питательной средой RPMI-1640, составляли ряд: 100, 10, 1 мг/л (после внесения суспензии лимфоцитов). Конечная концентрация лимфоцитов в индукционной смеси составляла 3•10⁶ клеток/мл.

Инкубация контрольных и опытных проб проводилась 24 ч при 37^oС. Затем они центрифугировались при 2000 g для осаждения клеточных элементов. Из проб отбирался ИФН-содержащий супернатант, который анализировался на количественное содержание ИФН. Осадок клеток ресуспендировали в прежнем объеме питательной среды, окрашивали витальным красителем - трипановым синим - и подсчитывали число клеток в камере Горяева (как описано выше) для определения цитотоксического действия препаратов.

Количественное определение содержания ИФН в контрольных и опытных образцах производили с использованием иммуноферментной тест-системы ProCon IF2 plus (производства ТОО "Протеиновый контур"), предназначенной для определения ИФН-а. Для определения количества интерферона в пробе использовали твердофазный иммуноферментный метод с использованием пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента. Активность связанной пероксидазы измеряли с помощью автоматического фотометра для микропланшетов с микропроцессором при длине волны 450 нм. Параллельно определяли активность ИФН у стандартных растворов ИФН, содержащих известное количество препарата. На основании полученных результатов строилась калибровочная кривая. На основании калибровочной кривой с помощью микропроцессора автоматического фотометра получены данные, выраженные в Международных Единицах (ME) активности ИФН на мл в данной индукционной системе, содержащей 3•10⁶ лимф./мл. Каждая опытная и контрольная точка исследовалась в 4-х параллелях.

В результате проведенных исследований установлено, что заявляемое соединение обладает способностью индуцировать синтез ИНФ (таблица 2).

Эксперимент 3. Определение острой токсичности
Определение острой токсичности производилось на беспородных белых мышах массой 18-20 г. Эмульсии заявляемых соединений готовилась в различных концентрациях: 1500, 700, 500, 100, 20 и 5 мг/кг. Для исследования каждой концентрации соединения использовали по 5 животных. Препарат вводили один раз в сутки через рот или внутрибрюшинно. Период наблюдения составил 14 дней. На 1, 8 и 15 день проводили взвешивание животных в каждой группе. Для контроля использовали животных, которым вводили эмульсию, приготовленную без испытуемых соединений.

Для макроскопического исследования внутренних органов проводили вскрытие всех животных, умерших в ходе опыта и выживших к концу эксперимента. Заявляемое соединение имеет низкий показатель острой токсичности (LD₅₀) - 470 мг/кг.

Полученные результаты свидетельствуют, что при приеме через рот или внутрибрюшинно в указанных концентрациях заявляемое соединение не обладает острой токсичностью для мышей.

Приведенный пример практического синтеза заявляемого соединения подтверждает возможность как его лабораторного, так и промышленного синтеза средствами, имеющимися в распоряжении современной фармацевтической индустрии. Приведенные результаты анализа показывают, что общепринятые методы контроля позволяют четко идентифицировать их. Эксперименты по определению биологической активности, приведенные в представленных отчетах, показали, что заявляемые соединения обладают биологической активностью по отношению к вирусу простого герпеса, а также интерферониндуцирующей активностью. Последнее указывает на возможность их использования в лечении других вирусных и некоторых раковых заболеваний. При этом при приеме через рот или внутрибрюшинно в указанных концентрациях заявляемое соединение не обладает острой токсичностью для мышей.

Приведенные сведения убедительно доказывают достижение задач, поставленных изобретением: создано новое биологически активное вещество, стимулирующее выработку эндогенных интерферонов, а также имеющее противовирусную активность, то есть обладающего иммуностимулирующим и противовирусным действием.

Задача решена путем синтеза нового производного 6-аминоурацила - химического соединения гетероциклического ряда. Полученное вещество 6-(3-карбоксиметилфенил)аминоурацил - относится к новой группе из класса замещенных 6-аминопуринов. Как было показано в разделе "Сущность изобретения", оно является новым и неочевидным.

Таким образом, по нашему мнению, заявляемое вещество удовлетворяют всем требованиям, предъявляемым к изобретению: оно ново, не очевидно и промышленно применимо.

Изобретение относится к новому 6-(3-ацетилфенил)аминоурацилу формулы I, которое обладает иммуностимулирующим и противовирусным действием и может быть использовано при лечении вирусных заболеваний, вызываемых хламидиями, а также заболеваний, вызываемых иммунодефицитом, в частности злокачественных новообразований, а также в ветеринарии. 2 табл.

6-(3-Ацетилфенил)аминоурацил формулы