5 @ -Фосфонаты 3 @ -азидо-2 @ ,3 @ -дидезоксинуклеозидов, являющиеся специфическими ингибиторами вируса СПИД в культуре лимфоцитов человека Н9/ШВ Советский патент 1990 года по МПК C07H19/73 A61K31/7064 A61P31/18 

Изобретение относится к молекулярной биологии, вирусологии и медицине и касается группы новых соединений 5 -фосфонатов 3 -азидо-2 ,3 -диде- зоксинуклеозидов: 5 -метиленфосфонат 3 -азидо-2 ,3 -дидезоксинуклеоэидов (I), 5 -гидрофосфонат 37-аэидо-2 ,З - дидезоксинуклеозидов (II), 5 -метилфосфонат 3 -азидо-2 ,З -дидезоксинуклеозидов (ill) формулы

RO-/° B

О

No

О II

где la R- -СИ2-Р-ОН

ОН

О

Ц- -Р-ОН

н

о

II Р-ОН

д-СН:

В - а) тимин-1-ил; б) цитозин-1-ил; в) аденин-9-ил; г) гуанин-9-ил, которые избирательно подавляют репро- дукцию вируса СПИД в культуре лимфоцитов человека Н9/ШВ.

Целью изобретения является снижение токсичности избирательных ингибиторов репродукции вируса СПИД в культуре клеток лимфоцитов человека, которая достигается применением в качестве веществ, блокирующих разм ножение вируса СПИД, соединений формулы (I-III).

Пример 1. Синтез 5 -метилен- фосфоната 3 -азидо-27,3 -дидезокси- тимидина (la).

К суспензии гидрида натрия (54 мг 2,25 моль) в 3 мл диметилформамида в течение 15-20 мин в атмосфере инерт ного газа добавляют раствор З -ази- до-21 ,3 -дидезокситимидина (Azl) (200 мг, 0,75 моль) в 5 мл диметилформамида, перемешивают 30 мин при 20°С. Затем добавляют раствор толу- олсульфоната диэтилоксиметиленфосфо- ната (240 мг, 0,75 моль) в 3 мл диметилформамида и интенсивно перемешивают 3 сут при 20°С. Ход реакции контролируют по ТСХ в системе В. По окончании реакции добавляют 0,13 мл уксусной кислоты, реакционную массу упаривают, переупаривают с 5 мл диметилформамида. Остаток экстрагируют хлороформом (5«5 мл). Экстракты упаривают, остаток очищают на колонке с силикагелем 40/100 (12-2,5 см). Элюцию проводят 300 мл хлороформа, затем 400 мл смеси хлороформ-этанол (9:0, собирая фракции по 2 мл. Соответствующие фракции собирают и упари вают. Получают в виде масла 130 мг вещества с РЈ 0,63 (в), которое раст

5

5

0

Q

,

0

5

0

5

воряют в 3 мл диметилЛормамида, добавляют триметилсилилбромид (0,3 мл), при 4°С, перемешивают 30 мин и выдерживают еще 24 ч при 20°С. Реакционную массу упаривают, добавляют 5 мл воды и триэтиламин до рН 9, выдерживают 1 ч и экстрагируют хлороформом ( мл). Водный слой упаривают, остаток очищают на колонке с целлюлозой ДЕ-32 в НСО -форме объемом 300 мл в линейном градиенте бикарбоната аммония от 0 до 0,ЗМ, об- щий объем элюента 3 л. Фракции, содержащие соединение (Га), упаривают, переупаривают с водой (510 мл) и этанолом (3-20 мл).

Остаток экстрагируют 10 мл метанола, упаривают до 2 мл, добавляют 30 мг NaCIO,}. и 5 мл ацетона. Осадок отделяют, промывают ацетоном, сушат. Получают белое аморфное вещество, выход 82 мг, 40%, R 0,2 (А).

УФ-спектр:Амакс265 нм (Ј 9600, рН 1).

1Н-ЯМР-спектр (ДгО,Ј), м.д.: 1,95 д (ЗН, СН,, J СН,Н6 - 0,5 Гц); 2,60 м (2Н, Н2); 3,69 д (2Н, , J CHfcP 8,6 Гц); 3,70-4,80 м (ЗН, Н4 + 2Н5 ); 6,18 м (1Н, HP, J Hi , Н2 6 Гц); 7,54 д (1Н, Н6, J 0,5 Гц).

П р и м е р 2. Синтез гидрофосйю- ната 3 -азидо-2 ,3 -дидезокситимиди- на (IT a).

Растворяют имидазол (0,50 г, 7,36 моль) в 15 мл. абс. ацетонитри- ла и охлаждают до 0°С. При перемешивании добавляют треххлористьй фосфор (О,19 мл, 2,17 моль) и затем триэтиламин (1,05 мл, 7,54 моль). Реакционную смесь перемешивают 15 мин при 0°С, затем в течение 30 мин добавляют по каплям раствор 3 -азидо-2 ,3 -диде- зокситимидина 135 мг (0,5 моль) в 10 мл ацетонитрила так, чтобы температура реакционной массы не поднима- лась выше +5 С.

Реакционную масу перемешивают 2 ч при 20°С, добавляют 3,5 мл и через 30 мин упаривают. Удаление ацильных защит с аминогрупп гетероциклов проводят насыщенным раствором аммиака в метаноле при 20°С в течение 24 ч. Затем вещество наносят на колонку с тоеперлом (525 см) и элюируют бикарбонатом аммония в линейном градиенте концентраций от 0 до 0,3 М, общий объем 1 л. Соответствующие фракции

собирают и упаривают. Избыток соли удаляют многократным переупариванием с водой. Остаток лиофилизуют из воды Выход На 140 мг, 80% в расчете на аммонийную соль. R, (А): 0,25 (На).

УФ-спектр (вода) Амакс269 нм.

Время удерживания на колонке Пис- leosil 120-7 NHU в линейном градиен- те КНгР04 от 0,05 до 1 М 7,2 мин, скорость потока 1 мл/мин.

мР-ЯМР-спектр (Д20,Ј), м.д.: 6,5 д (Ш, Н/, JHip 629 Гц, j s 6,3 Гц, J((|, 1,6 Гц). И

Н-ЯМР-спектр (Дг0,Ј ), м.д.: 7,66 д (1Н, Н6, JH6Cn, 1 Гц); 6,16 т (1Н, HP, Jn ,m. М Гц); 4,60-3,95 м (4Н, Н3 + Н4 + 2Н5 ); 2,55 (2Н, Н2); 1,92 д (ЗН, СН3,

JH6,CH3 Гц

П р и м е р 3. Синтез 5-гидрофосфо ната 3 -азидо-2 ,З -дидезоксицитиди- на (Нб), метод А.

Синтез (Нб) проводят, исходя из 150 мг, 0,5 моль 3 -азидо-2 , дидезокси-N -ацетилцитидина аналогично примеру 2.

Выход 116 94 мг, 62%, R 0,20, УФ-спектр (вода). А макс 273 нм. ВЭЖХ время удерживания 5,1 мин, условия как в примере 2.

э Р-ЯМР-спектр (ДаО,Ј), м.д.: 6,4 д (1Н, Hf, Jn, - 631 Гц, J , 6,3 Гц, JJiH4t 1,5 Гц).

Н-ЯМР-спектр/(ДО, i ), м.д.: 7,66 д (1Н, Н5, JH5 ((6 8,0 Гц);

5.79д (1Н, Нб, JH5( H6 8,0 Гц);.

5,95 т (1Н, HI , JM,,HZ Гц); 4,21-3,89 м (2Н, Н3 + Н4 ); 3,843.80м (2Н, Н5 ); 2,91-2,14 м (2Н,

Н21).

П р и м е р 4. Синтез-5 -гидрофос фоиата 3 -азидо-2 ,3 -дидезоксицити- дина {Нб), метод Б.

К раствору 252 мг (моль) З -азидо2 ,3 -дидезоксицитидина (AzC) в 10 мл абс. пиридина добавляют

1,4 моль трибутиламмониевой соли фосфористой кислоты в 5 мл пиридина и далее 290 мг (1,4 моль) Ы,К -ди- циклогексилкарбодиимида (ДЦК). Через

3сут к реакционной смеси добавляют 20 мл воды, перемешивают 1 ч, упари- вают досуха, остаток растворяют в 200 мл воды, наносят на колонку с

20 мл Даукса (НСОр, промывают в градиенте концентрации

0-0,5 М, затем 0,5 М , спирте элюируют Нб, упаривают досуха, остаток очищают еще раз на колонке (,0 см) с ДЕАЕ-целлюлозой (HCO-j), элюируя градиентом концентрации ИНфНСО (0- 0,3 М).

Фракции.с веществом упаривают, пе- реупарнвают с водой и высушивают отгонкой абс. спирта. Выход 97 мг, 32%, константы как в примере 3.

П р и м е р 5. Синтез 5 -гидрофос- фоната 3 -азидо-2 ,3 -дидезоксиаде- ноэина (Ив), метод А.

Синтез Ив проводят, исходя из 190 мг (0,5 моль) 3 -азидо-2 ,3;-диде- зокси-Нб-бенэоиладенозина по методу, как в примере 2.

Выход Ив 116 мг, 66%, EJ. 0,18, УФ (вода) .МОКС260 нм, ВЭЖХ, время удерживания в условиях примера 2-8, 9 мин.

Р-ЯМР-спектр (Д„0),§ , м.д.: 6,5 д (Ш, НР, Ju.p 630 Гц, 63 Гц, , 1,6 Гц).

1 Н-ЯМР-спектр RtO, о , м.д.: 8,42 с, (1Н, Н8); 8,18 с (lH, H2); 6,39 т (1Н, HI, JH,;JU 6,5 Гц); 5,05-4.22 м (2Н, НЗ + Н41); 4,16- 4,01 м (1Н, НЗ ); 3,06-2,52 м (2Н, Н2).

Пример 6. Синтез 5 -гидро- фосфоната З1 -азидо-2 ,3 -дидезокси- аденозина (Ив), метод Б.

Синтез Ив проводят, исходя из 275 мг О моль) 3 -азидо-2 ,3 -ди- дезокспаденозина (AzA), как в примере 4. Выход 70 мг, 20%, константы как в примере 5.

Пример 7. Синтез 5 -гндрофосг фоната 31-азидо-2 ,з -дидезоксигуано- зина (Иг), метод А.

Синтез Иг проводят, исходя из 225 мг (0,5 моль) 3 -азидо-2 ,3 -ди- дезокси-К2-пальмитоилгуанозина по методу, как в примере 2.

Выход (Иг) 97 мг,- 52%, R 0,14, УФ (вода),макс 250, 270 нм, ВЭЖХ, время удерживания 8,4 мин, условия примера 2.,

ЯР-ЯМР-спектр (Дг0,5 , м. 6,45 д (1Н, Нр, JH, 630 Гц, J i 6,3 Гц, jJilH 1,5 Гц).

Н-ЯМР-спектр (), м.д.: 7,91 с (1Н, Н8 7 6,85 т (Ш, НГ ), JR4 . Н2 7,0 Гц); 4,85-4,00 м (4Н, H 4-k4- -2H5l)42,02-2,61 м (2Н, Н2).

В качестве источника вируса СПИД использовали перевиваемую лимфоблас- тоиднуто линию клеток человека - про5 дуцентов вируса СПИД - Н9/ШВ. Культура клеток была получена от д-ра Б. Галло, Национальный институт рака, США. Продукция вируса клетками контролировалась в реакции непрямой

Ю иммунофлюоресценции, электронно-мик- роскопически и в реакции иммуно- блот. Клетки культивировали в среде

рования культуры неинфицированных кле ток Н9 из расчета мл суперпатанта культивируемой жидкости, содержащего

ч D

Примерб. Синтез 5 -гидро- фосфоната 3 -аэидо-2 ,3 -дидечокси- гуанозина (Иг), метод Б.

Синтез (Иг) проводят, исходя из 292 мг (1 моль) 3 -азидо-2 ,3 -диде- зоксигуанозина (AzG), как в примере 4. Выход 98 мг, 26%, константы как в примере 7.

П р и м е р 9. Синтез 5 -метил- фосфоната 31-азидо-2),3 -дидезоксити- мидина (ilia).

К раствору 3 -азидо-2 ,3 -дидезок- RPM1 1640 с 15%-ной инактивированной ситимидина (130 мг, 0,5 моль) в 2 мл сывороткой эмбриона коров, с триметилфосфата при 0-4 С прибавляют )5 300 мкг/мл глутамина, 100 мкг/мл ген- в течение 3 ч дихлорметанфосфонат тамицина, 10 мМ НЕРЕ-буфера и выра- (200 мг, 1, 5 моль), перемешивают щивали в виде суспензии. Культураль- ночь при 4°С и 5 ч при Ј0°С. Реакцией- ную жидкость, содержащую вирус, цент- ную массу упаривают, к остатку добав- рифугировали при 5000 об/мин в тече- ляют при охлаждении до ОаС 5 мл во- 20 ние О №Ш и использовали для инфици- ды и 1 мл триэтиламина, выдерживают 1 ч и вновь.упаривают. Остаток очища ют хроматографией на колонке(20%4 см)

с целлюлозой ДЕ-32 в форме. Элю- приблизительно 10Ь вирусных частиц в цию проводят 3 л линейного градиента 25 1 мл на 1 мл клеточной суспензии, бикарбоната аммония от 0 до 0,1 М. содержащей 10 клеток. Инфицирование Соответствующие фракции упаривают. клетки Н9 культивировали в греде КРМ.1 Избыток соли удаляют многократным 1640 с 15% инактивированной сыворот- переупариванием с водой. Остаток экст- кой эмбриона коров, 300 мкг/мл глута- рагируют Ю мл метанола, концентриру- 30 мина, 100 мкг/мл гентамицина, 100 мМ ют до 2 мл, добавляют 30 мг NaC104 HEPE S-буфера и инкубировали при 37 С и 5 мл ацетона. Осадок отделяют, про- Е увлажненной атмосфере 5% СО. Все мывают ацетоном, сушат. Выход 120 мг, изучаемые соединения добавлялись в 33%, считая на натриевую соль. Белое , среду непосредственно после инфицирозе вания клеток вирусом. Учет результатов проводят через пять-шесть суток после инфицирования клеток. Реакцию непрямой иммунофлуоресценции проводили в фиксированных препаратах анти- 40 ген-содержащих клеток - продуцентов вируса СПИД. Подсчеты жизнеспособных клеток осуществляли с использованием красителя трипанового синего в гемо- цитометрической камере Горяева. 45 Ряд опытов, в частности с AzT проводили в аналогичных условиях с использованием культуры лимфоцитов периферической крови здоровых

265 нм

аморфное вещество.

ГЦ 0,6 (А), УФ-спектр. акс (Ј9600).

(Н-ЯМР-спектр & , м.д.: 1,3 д (ЗН, CHf, Jc 17 Гц); 1,88 д (ЗН, СРг, JH6cH- Гц(; 2,43-249 м (2Н, Н2 , а.б); 3,80 - 4,90 м (ЗН, Н4 +2Н5 а,б); 6,16 т (1Н, НГ , 6,0 Гц); 7,60 д (III,

Н6, J 0,5 Гц).

Спектры ЯМР новых соединений регистрируют в RgO на спектрометре Varian XL - 100-15. В качестве внутреннего стандарта используют триме- тилфосфат в случае Р-ЯМР-спектров и тетраметилсилан в случае Н-ЯМР- спектров. Спектры УФ регистрируют на спектрофотометре Specord UV-vis М-40 (ГДР). ТСХ проводят на силуфоле в системах изопропанол-25%-ный водный аммиак-вода 7:1:2 (А) и хлороформ-этанол 9:1 (в).

Пример 10. Изучение свойств соединений I-III ингибировать репродукцию вируса СПИД.

50

55

доноров, выделяемых в градиенте фи- колла-изонака. За А8 ч до инфицирования клеток в среду добавляли фито- гемаггютинин концентрации Ю мкг/мл, а после инфицирования вносили в среду 10%-ный раствор природного интер- лейкина-2.

,i

На фиг.1 и 2 и в ri6n.1, 2 приведены данные по изучению подавления вируса СПИД в клетках с помощью AzT,

В качестве источника вируса СПИД использовали перевиваемую лимфоблас- тоиднуто линию клеток человека - продуцентов вируса СПИД - Н9/ШВ. Культура клеток была получена от д-ра Б. Галло, Национальный институт рака, США. Продукция вируса клетками контролировалась в реакции непрямой

иммунофлюоресценции, электронно-мик- роскопически и в реакции иммуно- блот. Клетки культивировали в среде

RPM1 1640 с 15%-ной инактивированной сывороткой эмбриона коров, с 300 мкг/мл глутамина, 100 мкг/мл ген- тамицина, 10 мМ НЕРЕ-буфера и выра- щивали в виде суспензии. Культураль- ную жидкость, содержащую вирус, цент- рифугировали при 5000 об/мин в тече- ние О №Ш и использовали для инфици-

рования культуры неинфицированных клеток Н9 из расчета мл суперпатанта культивируемой жидкости, содержащего

ч D

RPM1 1640 с 15%-ной инактивированной сывороткой эмбриона коров, с 300 мкг/мл глутамина, 100 мкг/мл ген- тамицина, 10 мМ НЕРЕ-буфера и выра- щивали в виде суспензии. Культураль- ную жидкость, содержащую вирус, цент- рифугировали при 5000 об/мин в тече- ние О №Ш и использовали для инфици-

приблизительно 10Ь вирусных частиц в 1 мл на 1 мл клеточной суспензии, содержащей 10 клеток. Инфицирование клетки Н9 культивировали в греде КРМ.1 1640 с 15% инактивированной сыворот- кой эмбриона коров, 300 мкг/мл глута- мина, 100 мкг/мл гентамицина, 100 мМ HEPE S-буфера и инкубировали при 37 С Е увлажненной атмосфере 5% СО. Все изучаемые соединения добавлялись в среду непосредственно после инфициро

доноров, выделяемых в градиенте фи- колла-изонака. За А8 ч до инфицирования клеток в среду добавляли фито- гемаггютинин концентрации Ю мкг/мл, а после инфицирования вносили в среду 10%-ный раствор природного интер- лейкина-2.

,i

На фиг.1 и 2 и в ri6n.1, 2 приведены данные по изучению подавления вируса СПИД в клетках с помощью AzT,

91

AzC, AzA и AzG (как контроля) и fcoc- фонатов I-TIT. Как видно из этих данных, например АгТингнбирует репродукцию вируса СПИД, начиная с концентрации 1 мкК, хотя при этой концентраци общее количество выросших составляет лишь 50% от контроля. Подавление роста клеток вызвано главным образом цнтотоксическим эффектом вируса (ана логично, как в контроле клеток с вирусом . Далее при более высоких концентрациях AzT начинает оказывать токсическое действие, так как количество клеток уменьшается по мере по вышения концентрации AzT (0,58-Ю6 клеток/мл при 5 мкМ и 0, клеток/мл при 10 мкМ). В то же время в случае новых соединений, например 1а и На, количество выросших клеток резко увеличивается по сравнению с условиями при низших концентрациях 1а и На (с 0,75 Ч 0е до 1-Ю кл/мл для 1а и с 0,65«10 до 1,0-10 кл/мл для На).

При этом содержание инфицированных вирусом клеток для Та и На сохраняется на уровне фонов (10%).

Данные экспериментов показывают, что все 5-фосйонаты 3 -азидо-2 ,3- дидезоксинуклеозидов эффективно подавляют репродукцию вируса СПИД в культуре лимфоцитов человека.

Пример 11. Определение токсичности веществ на клетках Н9/ШВ и МТ4 (табл.3).

К пробам суспензий по 1 мл клеток около 1 млн , растущих на среде, как в примере 0, после окончания одной генерации размножения (около 18 ч) прибавляют 1-2 мкКюри L HJ тимидина, уд. активность 22-26 Кюри/ ммоль и затем ингибитор до концентраций 1, 10, 30, 100, 300 мкМ и 1 мМ. Растворы инкубируют половину периода генерации (около 9 ч) и клетки

2

10

о/мъшают иентриАугиропаниег-f (1,5 тыс оборотов в 1 мин, 10 мин), промывают средой еше 2-3 раза с подобным центрифугированием, обрабатывают тритоном XI00 (прибавляя его до концентрации 5%), наносят на фильтры GF/C, фильтры промывают 5%-нон трихлор- уксусной кислотой. Включение радиоактивного материала в контроле около 60 тыс. имп/мин, фоновое включение 500-600 имп./мин.

Таким образом, соединения формулы IIII ингибируют размножение вируса СПИД в культуре лимфоцитов человека и проявляют меньшую токсичность по сравнению с известными структурными аналогами (Фиг.1 и 2 и табл.1-3).

Формула изобретения

5- Фосфонаты 3 -азидо-2 ,3 -дидезоксинуклеозидов общей Формулы

котфв

N:

О

и

где la) R--CH2-P-OH

ОН

О

N - Ч

На-г) t}- -P-OH I

н о

та) : д -р-он

снг

В - а) тимин-1-ил; б) цитозин-1-ил; в) аденин-9-ил; г) гуанин-9-нл, являющиеся специфическими ингибиторами вируса СПИД в культуре лимфоцитов человека Н9/ШВ.

Таблиц

Изобретение касается сахаров, в частности 5Ъ-фосфонатов 3Ъ-азидо-2Ъ,3Ъ-дидезоксинуклеозидов общей ф-лы RO @ , где R - Ia)-CH₂-P(O)(OH)₂

IIa-IIг)-PH(O)OH

IIIa) -P(O)(CH₃)OH

B-а) тимин-1-ил

б) цитозин-1-ил

в) аденин-9-ил

г) гуанил-9-ил, являющихся специфическими ингибиторами вируса СПИД в культуре лимфоцитов человека Н9/ШВ, что может быть использовано в вирусологии и медицине. Цель - создание новых активных и малотоксичных веществ указанного класса. Синтез ведут восстановлением, например, 3Ъ-азидо-2Ъ,3Ъ-дидезокситиамидина с помощью диметилформамидной суспензии гидрида натрия с последующим добавлением диэтилоксиметиленфосоната. Выход целевых веществ 40-80%. Новые вещества менее токсичны, чем известные аналоги. 2 ил., 3 табл.

4 дня инкубации

Примечание. Данные выражены в процентах к исходному состоянию 1,2-10 клеток в I мл.

Таблица2

ТаблицаЗ

13

К - контрольный эксперимент в-Вирус

-клетки, инфицированные вирусом слн&

-клетки, не содержащие вируса

Фиг.1

154818214

Продолжение табл.3

1t2 W s U

а

fff AzC в дней

30

10

//Л

15

Uri

ъ

/ Л

У/7/ / //

У/ Ш

Е6 АъС

Составитель Г. Коннова Редактор Н. Гунько Техред А.Кравчук

Заказ 112

Тираж 316

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

S6 АгА

Ег Az6

30

,М

ЗОмкМ

SB AZA

Фиг.г

Ег Агб

Корректор В. Кабаций

Подписное