СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО НООТРОПНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2006 года по МПК A61K36/41 A61K31/351 A61K125/00 A61P25/28 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, в частности к производству лекарственных средств в виде субстанций и индивидуальных биологически активных соединений (БАС), и касается способа получения розавина из корневищ родиолы розовой (Rhodiola rosea L.).

Корневища родиолы розовой содержат в качестве доминирующих биологически активных соединений фенилпропаноиды, включая розавин (1) [1, 4-8, 15, 16], и являются ценным сырьем для производства тонизирующих, адаптогенных и иммуномодулирующих лекарственных средств [2-5, 7-12, 14, 18].

Известны способы получения розавина, обладающего нейротропной активностью [4, 6, 19], однако недостатком известных способов является сложность технологического процесса и низкий выход целевого продукта.

За прототип изобретения нами взят способ получения розавина из корневищ родиолы розовой [6], однако выделение этого вещества осуществляется с использованием громоздкой технологии, заключающейся в экстракции сырья метанолом, упаривании метанольного экстракта до сиропообразного остатка, хроматографической очистке на полиамиде с использованием в качестве элюента смеси растворителей (метанол и хлороформ), последующей рехроматографии фракций, содержащих целевой продукт (розавин), на силикагеле (элюент:хлорофом-метанол в различных соотношениях), упаривании фракций, содержащих целевой продукт до сиропообразной пленки, растворении остатка в кипящем этиловом спирте, фильтрации, кристаллизации, отделении технического розавина путем фильтрации и окончательной очистки целевого продукта путем перекристаллизации из этилового спирта с выходом целевого вещества 3,2 г или 0,64% от воздушно-сухого сырья [6].

Данный способ является не только громоздким и продолжительным (143 ч), но и дает низкий выход целевого вещества - розавина (0,64%). Кроме того, на стадии экстракции сырья используется такой опасный растворитель, как метиловый спирт. Учитывая колоссальную значимость розавина как государственного стандартного образца [13], предложенного нами для целей стандартизации сырья и препаратов родиолы розовой [2, 7, 8, 11], весьма актуальными являются исследования по совершенствованию способа получения розавина.

Целью изобретения является увеличение выхода розавина из корневищ родиолы розовой.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве экстрагента используют 70...90% этиловый спирт, позволяющий исчерпывающе извлекать целевой продукт - розавин (1) из корневищ родиолы розовой с последующим хроматографическим разделением экстрактивных веществ на силикагеле и перекристаллизацией технического целевого продукта.

Проведенный заявителем поиск по научно-техническим и патентным источникам информации и выбранный из перечня аналогов прототип [6] позволили выявить отличительные признаки в заявленном техническом решении. Следовательно, заявляемый способ получения удовлетворяет критерию изобретения "новизна".

Проведенный заявителем дополнительный поиск известных технических решений [2, 4, 5, 7, 12, 14, 18, 19] с целью обнаружения в них признаков, сходных с признаками заявляемого способа получения, показал, что эти признаки отсутствуют, следовательно, заявляемое техническое решение удовлетворяет критерию "изобретательский уровень".

Заявляемый способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Измельченные воздушно-сухие корневища родиолы розовой (500,0 г) экстрагируют 80% этиловым спиртом в соотношении 1:6 при комнатной температуре в течение 24 ч и затем проводят две экстракции (2×30 мин) при температуре 80-85°С с обратным холодильником. Объединенные водно-спиртовые экстракты упаривают под вакуумом до густого остатка (500 мл), который смешивают с 100 г силикагеля L 40/100, высушивают в течение 24 ч и вносят в колонку (8×10 см), заполненную силикагелем в виде взвеси в хлороформе. Хроматографическую колонку промывают хороформом (0,5 л) и смесью хлороформ-этиловый спирт в соотношении 90:10 (2 л). Целевое вещество элюируют с хлороформ-этиловый спирт в соотношении 85:15 (2 л) и 80:20 (1 л). Контроль за разделением веществ осуществляли хроматографированием на пластинках "Силуфол УФ-254" в системе растворителей: хлороформ-метиловый спирт-вода (26:14:3).

Элюаты, содержащие розавин, упаривают под вакуумом до сиропообразной пленки, остаток растворяют в этиловом спирте при нагревании, фильтруют и оставляют на 10 ч. По истечении этого времени образовавшийся кристаллический осадок розавина отделяют, полученный технический целевой продукт растворяют при нагревании в этиловом спирте и оставляют на 10 ч. По истечении этого времени образовавшийся кристаллический осадок розавина отделяют, промывают этиловым спиртом и высушивают на воздухе. Получают 5,3 г целевого вещества выходом 1,06% от воздушно-сухого сырья (табл.1).

Спектральные и физико-химические свойства розавина (циннамил-O-(6'-O-α-L-арабинопиранозил)-β-D-глюкопиранозид) (1). Бесцветные кристаллы состава С₂₀Н₂₈О₁₀ с т. пл. 171-173°С; УФ-спектр: λ_max ^EtOH - 252 нм. Спектр ¹H-ЯМР (200 МГц, C₅D₅N) δ, м.д.: 7.4-7.2 (м, 5Аr-Н). 6.82 (д, 16 Гц, Н-7), 6.5 (дт, 6 и 16 Гц, Н-8), 4.94 (д, 7 Гц, Н-1'), 4.87 (д, 6 Гц, Н-1''), 4.90 (м, 1Н-9), 4.65 (дд, 6 и 12 Гц, 1Н-9), 4.55-3.95 (м, 10Н глюкозы), 3.7 (кв, 2 и 13 Гц, Н-5''е). Качество розавина отвечает требованиям ФС 42-0071-01 [13].

Пример 2. Измельченные воздушно-сухие корневища родиолы розовой (500,0 г) экстрагируют 90% этиловым спиртом в соотношении 1:6 при комнатной температуре в течение 24 ч и затем проводят две экстракции (2×30 мин) при температуре 80-85°С с обратным холодильником. Объединенные водно-спиртовые экстракты упаривают под вакуумом до густого остатка (500 мл), который смешивают с 100 г силикагеля L 40/100, высушивают в течение 24 ч и вносят в колонку (8×10 см), заполненную силикагелем в виде взвеси в хлороформе. Далее технологический процесс осуществляют в соответствии с примером 1.

Выход целевого продукта - индивидуального розавина составляет 4,35 г или 0,87% от массы воздушно-сухого сырья. Физико-химические и спектральные характеристики розавина соответствуют требованиям ФС 42-0071-01 [13].

Пример 3. Измельченные воздушно-сухие корневища родиолы розовой (500,0 г) экстрагируют 70% этиловым спиртом в соотношении 1:6 при комнатной температуре в течение 24 ч и затем проводят две экстракции (2×30 мин) при температуре 80-85°С с обратным холодильником. Объединенные водно-спиртовые экстракты упаривают под вакуумом до густого остатка (500 мл), который смешивают с 100 г силикагеля L 40/100, высушивают в течение 24 ч и вносят в колонку (8×10 см), заполненную силикагелем в виде взвеси в хлороформе. Далее технологический процесс осуществляют в соответствии с примером 1.

Выход целевого продукта - индивидуального розавина составляет 4,75 г или 0,95% от массы воздушно-сухого сырья. Физико-химические и спектральные характеристики розавина соответствуют требованиям ФС 42-0071-01 [13].

Изучение запредельных параметров (примеры 4-6), а именно: осуществление экстракции 60% и 96% этиловым спиртом, использование хроматографии на полиамиде и рехроматографии на силикагеле - приводит к заметному снижению выхода целевого продукта - соответственно до 0,61%, 0,50% и 0,70% (табл.1).

Следовательно, оптимальными параметрами способа получения розавина являются: экстракция 70...90% этиловым спиртом в соотношении сырье-экстрагент 1:6 с последующим хроматографическим разделением экстрактивных веществ на силикагеле и кристаллизацией целевого продукта из этилового спирта.

Таблица 1
Выход розавина в зависимости от значений параметров технологического процесса№№ п/пСущественные признакиОптимальные параметрыЗапредельные параметрыВыход розавина, в % от массы воздушно-сухого сырья1.Экстракция сырья спиртами C₁-C₂, Метанол (прототип)0,64  То же80% этиловый спирт 1,062.То же90% этиловый спирт 0,873.То же70% этиловый спирт 0,954.То же 96% этиловый спирт0,505.То же 60% этиловый спирт0,61 Хроматографическая очистка Прототип (полиамид + силикагель)0,641.
То же
6.
То жеСиликагель 1,06
0,70Полиамид + силикагель

Использование в заявляемом способе 70...90% этилового спирта позволяет исчерпывающе извлекать целевой продукт из корневищ родиолы розовой. При этом заявляемый способ позволяет в 1,77 раза увеличить выход целевого продукта из корневищ родиолы розовой по сравнению с прототипом (табл.2).

Кроме того, заявляемый способ позволяет в 1,8 раза сократить продолжительность технологического процесса, в 1,8 раза уменьшить расход дорогостоящего растворителя (хлороформ) и исключить из технологической схемы использование на стадии экстракции опасного растворителя - метилового спирта, а также дорогостоящего сорбента - полиамида.

Таблица 2
Сравнительная характеристика способов получения розавина№№ п/пПараметры способаЗаявляемый способПрототипПреимущества заявляемого способа1.ЭкстрагентЭтиловый спирт (70%...90%)Метиловый спиртИсключение из способа опасного растворителя2.Выход розавина, в %1,060,64Более высокий выход розавина (в 1,77 раза)3.Используемые сорбентыСиликагельПолиамид и силикагельИсключение из способа полиамида как дорогостоящего сорбента4.Расход хлороформа на стадии хроматографической очистки5 л 600 мл10 л 160 млУменьшение расхода хлороформа как дорогостоящего растворителя в 1,8 раза5.Продолжительность технологического процесса79 ч143 чВ 1,8 раза менее продолжителен

Ноотропную активность розавина исследовали в условиях методики "открытое поле", позволяющей оценивать ориентировочно-исследовательскую реакцию крыс [17]. В качестве препарата сравнения изучали эталонный препарат "Пирацетам" [3, 12]. Исследования выполнены на белых беспородных крысах обоего пола с исходной массой 170-210 г., содержавшихся в стандартных условиях вивария на обычном рационе. При этом использовали квадратную камеру размером 100×100×40 см. Ее пол был разделен на 25 квадратов с отверстием в центре. Регистрацию проводили в течение 5 минут. Подсчитывали перемещение с квадрата на квадрат (горизонтальная активность), причем как в 16 внешних, так и в 9 внутренних, количество вставаний на задние лапки (вертикальная активность), количество обследованных отверстий (исследовательская активность), количество умываний (груминг) и количество актов дефекации по количеству фекальных шариков (болюсов).

Исследуемые препараты вводили животным внутрижелудочно через зонд, предварительно растворив в дистиллированной воде в различных дозировках: 10 мг/кг (розавин) и 200 мг/кг (пирацетам) один раз в сутки от одного до 5 дней, последний раз за 30 минут до исследования.

Основное назначение ориентировочной реакции состоит в повышении возбудимости анализаторов для наилучшего восприятия действия на нервную систему раздражителей с целью установления их биологического значения. Любой вид анализа происходит при активном участии ориентировочного рефлекса. Реакция привыкания или негативного научения оберегает нервную систему, избавляя животное от ненужного числа раздражителей окружающей среды. В то же время она способствует вычленению биологически значимого сигнала. Привыкание является одним из адаптивных навыков у грызунов. В наших экспериментах помещение животного в новое окружение приводит к возникновению исследовательского поведения, которому одновременно препятствует страх. Две антагонистические тенденции характеризуются разным временным ходом, причем лучшим выражением уменьшения страха у животных считается исследование ими внутренних квадратов экспериментальной установки.

Результаты исследования, представленные в таблице 3, свидетельствуют о том, что наибольшей степени общая двигательная активность (сумма горизонтальной активности во внешних, внутренних квадратах и вертикальной активности) увеличивалась под воздействием розавина - на 26,0%, тогда как в случае пирацетама этот показатель составил всего 10% (табл.3). Введение розавина существенно увеличивало выход животных во внутренние квадраты: с 0,16±0,1 в контроле до 4,0±0,4* в опыте, то есть в 25 раз, тогда как в случае пирацетама этот показатель увеличился лишь в 6,7 раза (табл.3). Это свидетельствует об уменьшении эмоциональности и страха животных под влиянием данных препаратов. При введении розавина возрастала также вертикальная активность (с 15,1±4,7 подъемов на задние лапки до 25,5±3,1* в опыте), а также горизонтальная активность в наружных квадратах: с 12,5±2,0 в контроле до 15,0±3,7* пересечений квадратов в опыте (табл.3).

Таблица 3
Влияние розавина и пирацетама (препарат сравнения) на количественные показатели в "открытом поле" (число животных в каждой группе - 12)Препарат, доза в мг/кгГоризонтальная активность внешняяГоризонтальная активность внутренняяВертикальная активностьИсследовательская активностьГрумингБолюсы Общая двигательная активностьКонтроль12,5±2,00,16±0,115,1±4,75,0±0,94,5±0,61,3±0,317,6Розавин, 10 мг/кг15,0±3,7*4,0±1,4*25,5±3,1*3,1±0,51,7±0,42,8±0,522,1(126%)Контроль10,0±1,80,3±0,16,6±1,75,5±1,21,0±0,22,6±0,615,5Пирацетам, 200 мг/кг16,5±0,9*2,0±0,4*2,8±0,50,5±0,21,6±0,81,2±0,117,1(110%)* - Р<0,05 по сравнению с контролем

Таким образом, использование заявляемого способа получения розавина дает следующие преимущества:

1. Использование в заявляемом способе 70-90% этилового спирта позволяет исчерпывающе извлекать целевой продукт из корневищ родиолы розовой.

2. Заявляемый способ позволяет в 1,77 раза увеличить выход целевого продукта из корневищ родиолы розовой по сравнению с прототипом.

3. Заявляемый способ позволяет в 1,8 раза сократить продолжительность технологического процесса.

4. Заявляемый способ позволяет в 1,8 раза уменьшить расход дорогостоящего растворителя и исключить из технологической схемы на стадии экстракции использование опасного растворителя - метилового спирта, а также дорогостоящего сорбента - полиамида.

5. Заявляемый способ позволяет получить вещество, значительно превосходящее в дозе 10 мг/кг по фармакологическому действию эталонный ноотропный препарат "Пирацетам" (исследуемая доза - 200 мг/кг).

Источники информации:

1. Барнаулов О.Д., Лимаренко А.Ю., Куркин В.А. и др. Сравнительная оценка биологической активности соединений, выделенных из видов Rhodiola L. // Хим.-фармац. журнал. - 1986. - Т.20, № 9. - С.1107-1112.

2. Быков В.А., Запесочная Г.Г., Куркин В.А. Родиола розовая (Rhodiola rosea L.): Традиционные и биотехнологические аспекты получения лекарственных средств (обзор) // Хим.-фармац. журнал. - 999. - Т.33, № 1. - С.28-37.

3. Государственный реестр лекарственных средств. - Т.1. Официальное издание. - М., 2002. - 1300 с.

4. Запесочная Г.Г., Куркин В.А. Гликозиды коричного спирта из корневищ Rhodiola rosea II Химия природ. соедин. - 1982. - № 6. - С.723-727.

5. Запесочная Г.Г., Куркин В.А., Бойко В.П. и др. Фенилпропаноиды - перспективные биологически активные вещества лекарственных растений // Хим.-фармац. журнал. - 1995. - Т.29, № 4. - С.47-50.

6. Куркин В.А., Запесочная Г.Г., Щавлинский А.Н., Ивашин В.М., Соколов С.Я., Шретер А.И. Способ получения розавина // А.с. № 1168254 (СССР). - Опубл. в Б.И., 1985. - № 27.

7. Куркин В.А., Запесочная Г.Г. Химический состав и фармакологические свойства растений рода родиола (обзор) // Хим.-фармац. журнал. - 1986. - Т.20, № 10. - С.1231-1244.

8. Куркин В.А. Фенилпропаноиды - перспективные природные биологически активные соединения. - Самара: СамГМУ, 1996. - 80 с.

9. Куркин В.А., Запесочная Г.Г., Авдеева Е.В. и др. Способ получения средства, обладающего иммуномодулирующей активностью // Патент РФ №2133620. - А 61 К 35/78. - Бюл. № 21 от 27.07.99 г.

10. Куркин В.А., Дубищев А.В., Титова И.Н. и др. Нейротропная активность фитопрепаратов, содержащих фенилпропаноиды // Фармация. - 2003. - Т.51, № 6. С.30-31.

11. Куркин В.А. Фармакогнозия: учебник для студентов фармацевтических вузов. - Самара: ООО "Офорт", ГОУВПО "СамГМУ", 2004. - 1180 с.

12. Машковский М.Д. Лекарственные средства. - Т.1 и 2. - М.: Новая Волна, 2000.

13. Розавин - стандартный образец. - ФС 42-0071-01. - М., 2001. - 4 с.

14. Саратиков А.С., Краснов Е.А. Родиола розовая (золотой корень). - Томск: Изд-во Томского ун-та, 2004. - 292 с.

15. Соколов С.Я., Ивашин В.М., Запесочная Г.Г. и др. Исследование нейротропной активности новых веществ, выделенных из родиолы розовой // Хим.-фармац. журнал. - 1985. - Т.19, №11. - С.1367-1371.

16. Соколов С.Я., Бойко В.П., Куркин В.А. и др. Сравнительное исследование стимулирующих свойств некоторых фенилпропаноидов // Хим.-фармац. журнал. - 1990. - Т.24, № 10. - С.66-68.

17. Экспериментальное изучение препаратов с ноотропным типом действия. Под ред. Ворониной Т.А., Островской Р.У. // Ведомости Фармакологического комитета. 1998. № 2. С.21-38.

18.Kurkin V.A. Phenylpropanoids from Medicinal Plants: Distribution, Classification, Structural Analysis, and Biological Activity // Chemistry of Natural Compounds. - 2003. - Vol.39, No.2. - P.123-153.

19. Tolonen A., Pakonen M., Hohtola A. et al. Phenylpropanoid glycosides from Rhodiola rosea II Chem. Pharm. Bull. - 2003. - Vol.51, No.4. - P.467-470.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к способу получения розавина, обладающего ноотропной активностью. Способ получения розавина, включающий трехкратную экстракцию 70-90% этиловым спиртом измельченных корневищ родиолы розовой (Rhodiola rosea L.) при определенном соотношении сырье:экстрагент, упаривание объединенных экстрактов под вакуумом до густого остатка, хроматографическое разделение на силикагеле, упаривание элюатов и кристаллизацию, причем первую экстракцию проводят при комнатной температуре, а остальные две экстракции при определенной температуре с обратным холодильником. Вышеописанный способ позволяет увеличить выход целевого продукта из корневищ родиолы розовой, сократить продолжительность технологического процесса. 3 табл.

Способ получения розавина, включающий трехкратную экстракцию органическим растворителем измельченных корневищ родиолы розовой (Rhodiola rosea L.) при соотношении сырье: экстрагент 1:6, упаривание объединенных экстрактов под вакуумом до густого остатка, хроматографическое разделение на силикагеле, упаривание элюатов и кристаллизацию, отличающийся тем, что экстракцию осуществляют 70-90%-ным этиловым спиртом, при этом первую экстракцию проводят при комнатной температуре, а остальные две экстракции при температуре 80-85°С с обратным холодильником.