СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-МЕТИОНИНА, ШТАММ БАКТЕРИИ ESCHERICHIA COLI ВКПМ В-8125 - ПРОДУЦЕНТ L-МЕТИОНИНА Российский патент 2003 года по МПК C12P13/12 C12N1/21 C12N1/21 C12R1/19 

Область техники
Изобретение относится к бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, - продуценту L-метионина и способу получения L-метионина методом ферментации с использованием указанной бактерии.

В настоящее время продукция DL-метионина занимает второе место после глутаминовой кислоты в общей продукции аминокислот. Большая часть DL-метионина производится химически.

Оптически активный метионин (L-метионина) необходим для фармацевтических целей, для смесей аминокислот в качестве витамина и для подобных целей.

Описание предшествующего уровня техники.

Известно, что некоторые мутанты Escherichia coli, устойчивые к аналогам метионина, могут продуцировать L-метионин.

Было установлено, что мутанты Escherichia coli, устойчивые к этионину и утратившие способность к ингибированию конечным продуктом, способны производить метионин (Abelberg E.A., J.Bacteriol., 76, 326-328 (1958)). Также была описана продукция метионина мутантами Escherichia coli, устойчивыми к норлейцину, (Rowbury R. J. , Nature, 206, 962 (1965)). Но только следовые количества L-метионина были получены.

Описан микроорганизм, полученный введением в реципиентный штамм Escherichia гибридной плазмиды, содержащей фрагмент ДНК, выделенный из донорного штамма Escherichia, устойчивого к этионину (патент Великобритании GB2075055). Также описан вариационный тип гена metJ со специфической последовательностью, кодирующей связанный с биосинтезом метионина белок-репрессор из Escherichia coli, у которого активность к репрессии понижена и который полезен в продукции L-метионина (JP157267A2). Но выходы в процессе продукции L-метионина указанньми мутантами (около 0,3-0,5 г/л) не могут удовлетворить растущие потребности в данной аминокислоте.

Краткое описание изобретения
Целью настоящего изобретения является предоставление бактерии, принадлежащей к роду Escherichia и обладающей способностью к продукции L-метионина, и способа получения L-метионина с использованием указанной бактерии.

Достаточно трудно из штамма дикого типа селекционньм путем получить продуцент, способный к экскреции значительных количеств L-метионина. Авторы настоящего изобретения решили получить мутантный штамм - продуцент L-метионина, используя штамм - продуцент L-гомосерина в качестве родительского штамма. Известно, что L-гомосерин является предшественником L-метионина. Таким образом, авторы настоящего изобретения установили, что такая бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, устойчивая к аналогу метионина, обладает повышенной способностью к продукции L-метионина. На основании этой находки было совершено настоящее изобретение.

Настоящее изобретение представляет бактерию, принадлежащую к роду Escherichia, устойчивую к аналогу L-метионина и обладающую способностью к продукции по крайней мере 0,5 г/л L-метионина при выращивании в минимальной среде. (Здесь и далее упоминаемую как "бактерия согласно настоящему изобретению").

Указанная бактерия согласно настоящему изобретению обладает устойчивостью к аналогу метионина.

Указанная бактерия согласно настоящему изобретению получена путем селекции среди бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, штамма, устойчивого к аналогу метионина.

Указанная бактерия согласно настоящему изобретению предпочтительно устойчива к норлейцину.

Также настоящее изобретение предоставляет способ получения L-метионина, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления в питательной среде L-метионина и выделения L-метионина из культуральной жидкости (здесь и далее упоминаемый как "способ согласно настоящему изобретению").

Далее настоящее изобретение будет объяснено более подробно.

Подробное описание настоящего изобретения.

Бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, обладающая способностью к продукции L-метионина и устойчивая к аналогу L-метионина, предпочтительно к норлейцину.

К бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, относится Escherichia coli.

Способность к продукции L-метионина означает способность к накоплению значительного количества L-метионина в питательной среде в процессе выращивания указанной бактерии в питательной среде. Обычно это означает способность к накоплению по крайней мере 0,5 г/л L-метионина при выращивании бактерии на минимальной среде. Минимальной средой является среда, которая не содержит ничего, кроме компонентов, необходимых для роста бактерии. Удаление любого из компонентов приводит к остановке роста бактерии. Например, если бактерия является ауксотрофной по треонину, ограниченное количество треонина должно быть добавлено в питательную среду. В другом примере лимитирующим компонентом является источник углерода, такой как глюкоза. Примеры выращивания на минимальной среде приведены в разделе Примеры (см. ниже). Количество L-метионина, произведенного бактерией, может быть в дальнейшем увеличено путем добавления в питательную среду дополнительных питательных веществ, таких как витамин B₁₂, дрожжевой экстракт или подобные им, или путем повышения концентрации соединений, использующихся в качестве источников углерода или азота. Например, выращивание бактерии согласно настоящему изобретению на минимальной среде, содержащей 4% глюкозы, приводит к накоплению 1,1 г/л L-метионина. А выращивание бактерии согласно настоящему изобретению на минимальной среде, содержащей 6% глюкозы, приводит к накоплению 1,6 г/л L-метионина (см. Примеры, приведенные ниже).

Устойчивость к аналогу L-метионина означает способность бактерии к росту на минимальной среде в присутствии аналога L-метионина, присутствующего в количестве, при котором штамм дикого типа или родительский штамм не может расти. Примерами аналогов L-метионина являются α-метилметионин, селенометионин, этионин, L-гомосерин, норлейцин, селеноэтионин и подобные им соединения. Количество аналога L-метионина в питательной среде зависит от типа аналога. В случае норлейцина оно обычно составляет 5 мг/мл в условиях, описанных в Примерах, приведенных ниже.

Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, которая является устойчивой к аналогу L-метионина, может быть получена путем выращивания бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, на минимальной среде, содержащей аналог L-метионина в концентрации, ингибирующей рост, и последующей селекции растущих штаммов. Селекция штаммов, устойчивых к аналогу L-метионина, может быть осуществлена с одним типом аналога или с большим числом аналогов. Селекция штамма может быть осуществлена один раз или большее число раз для аналога одного типа.

Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, перед селекцией может быть подвергнута обработке с целью получения мутаций. Мутагенез может быть осуществлен, например, с помощью УФ-облучения или путем обработки реагентом, обычно использующимся для искусственного мутагенеза, таким как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидином (NTG) и азотистой кислотой. Мутагенез и селекция мутантных штаммов могут быть повторены два и большее число раз.

У бактерии согласно настоящему изобретению путем мутагенеза или генно-инженерными методами может быть увеличена активность одного или нескольких ферментов биосинтеза L-метионина. В дополнение, бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем введения ДНК, кодирующей белок с пониженной способностью к репрессии биосинтеза метионина (ген metJ, JP157267A2).

К способу согласно настоящему изобретению относится способ получения L-метионина, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления в питательной среде L-метионина и выделения L-метионина из культуральной жидкости.

Выращивание бактерии согласно настоящему изобретению, выделение и очистка L-метионина из культуральной жидкости может быть осуществлено способом, подобным традиционным способам с использованием ферментации, в которых L-метионин продуцируется с использованием Е. coli. Питательная среда, используемая в настоящем изобретении, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная питательная среда содержит источник углерода, источник азота, минеральные добавки и, если необходимо, другие микроэлементы.

В качестве источника углерода могут быт использованы сахара, такие как глюкоза, лактоза, галактоза, фруктоза или гидролизат крахмала; спирты, такие как глицерин или сорбитол; или органические кислоты, такие как уксусная, фумаровая, лимонная, янтарная кислоты.

В качестве источника азота могут быть использованы неорганические соли аммония, такие как сульфат аммония, хлорид аммония или фосфат аммония; органические соединения азота, такие как гидролизат соевых бобов; газообразный аммиак или водный раствор аммиака.

Желательно, чтобы в качестве органических питательных компонентов в подходящих количествах присутствовали соединения, такие как L-треонин и соединения - источники серы. Кроме того, если это необходимо, в небольших количествах могут быть добавлены фосфат калия, сульфат магния, ионы железа, марганца и другие подобные соединения.

Выращивание проводят предпочтительно в аэробных условиях, таких как перемешивание культуры с аэрацией или подобным способом. Выращивание обычно заканчивается через 16-72 часов. Температура в процессе выращивания поддерживается в пределах от 20^oС до 40^oС, рН поддерживается в пределах 5-8. Неорганические и органические, кислотные и основные соединения, такие как газообразный аммиак или подобные ему, могут быть использованы для поддержания определенного уровня рН.

Культура состоит из клеток и культуральной жидкости, предпочтительно из культуральной жидкости.

Выделение L-метионина из культуральной жидкости обычно проводят путем комбинации методов ионообменной хроматографии и осаждения или другими известными способами.

Наилучший способ осуществления изобретения
Настоящее изобретение будет более подробно разъяснено со ссылкой на следующие примеры.

Пример 1. Индукция мутантных штаммов Е. coli, устойчивых к норлейцину.

В качестве исходного штамма был использован бесплазмидный штамм E.coli С600, дефицитный по треонину и лейцину. Сначала путем трансдукции фагом Р1, выросшим на штамме E.coli К-12, были получены Leu⁺ варианты штамма E.coli C600. Затем, после обработки полученных вариантов N-метил-N'-нитрo-N-нитрозогуанидином (NTG) (0,1 мг/мл) был выделен мутантный штамм 44, устойчивый к 8 г/л L-гомосерина. Указанный штамм 44 являлся дефицитным по L-треонину, был устойчив к высокой концентрации L-гомосерина и обладал способностью к продукции 4 г/л L-гомосерина - предшественника L-метионина. Штамм 44 был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под инвентарным номером ВКПМ В-2175.

Затем с помощью мутагенеза с использованием NTG из штамма 44 были получены мутанты, устойчивые к аналогу метионина, норлейцину.

Клетки ночной культуры штамма 44, выросшие в L-бульоне, были осаждены и ресуспендированы в физиологическом растворе (0,9% Nad), содержащем 50 мкг/мл NTG. После обработки NTG в течение 30 минут при 37^oС клетки были осаждены, отмыты 4 раза физиологическим раствором и помещены на минимальную агаризованную среду М9, содержащую 0,5 мг/мл треонина и 2,5 или 5,0 мг/мл норлейцина. Чашки инкубировались в течение 5 дней при 37^oС. Выросшие на чашках колонии были собраны и очищены путем рассева до отдельных колоний на чашках с L-агаром.

Пример 2. Продукция L-метионина новыми мутантными штаммами - продуцентами L-метионина в условиях ферментации в пробирках.

232 очищенных штамма, устойчивых к различным количествам норлейцина, были тестированы на способность к продукции L-метионина (Таблица 1).

Среди всех полученных мутантов только 4 штамма накапливали значительные количества L-метионина. Наилучшим продуцентом L-метионина среди них оказался штамм 218. Штамм 218 был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) 14 мая 2001 г под инвентарным номером ВКПМ В-8125.

Новый штамм 218 выращивался в питательной среде для ферментации. В качестве питательной среды для ферментации была использована минимальная среда, содержащая 15 г/л (NH₄)₂SO₄, 1,5 г/л КН₂РO₄, 1,0 г/л MgSO₄, 0,1 мг/л тиамина, 40 г/л глюкозы, 0,5 г/л треонина и 20 г/л мела. Глюкоза и мел были стерилизованы раздельно.

2 мл питательной среды были помещены в пробирки, инокулированы одной петлей тестируемых микроорганизмов и выращивались при 32^oС в течение 3 дней на качалочной мешалке. Накопленное в культуральной жидкости количество метионина определялось методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). Состав подвижной фазы для ТСХ следующий: изопропанол - 80 мл, этилацетат - 80 мл, NH₄OH (30%) - 15 мл, Н₂О - 45 мл. Выращивание нового штамма 218 привело к накоплению в питательной среде 1,1 г/л L-метионина (4% глюкозы).

Пример 3. Продукция L-метионина новым мутантным штаммом 218 - продуцентом L-метионина в условиях ферментации в пробирках.

Новый штамм 218 выращивался в питательной среде для ферментации, как это описано в Примере 2, за исключением того, что концентрация глюкозы была повышена до 60 г/л.

Выращивание нового штамма 218 привело к накоплению в питательной среде 1,6 г/л L-метионина (6% глюкозы).

Изобретение относится к биотехнологии, L-метионин получают путем выращивания бактерии Escherichia coli, которая обладает способностью к продукции по крайней мере 0,5 г/л L-метионина в процессе выращивания на минимальной среде и устойчива к аналогу метионина. Такими свойствами обладает штамм Escherichia coli 218 (ВКПМ В-8125). Накопленную аминокислоту выделяют из культуральной жидкости. Данное изобретение позволяет получать L-метионин с высокой степенью эффективности. 2 c. и 4 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ получения L-метионина, включающий стадии выращивания бактерии Escherichia coli - продуцента L-метионина в питательной среде и выделения L-метионина из культуральной жидкости, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют бактерию Escherichia coli, обладающую способностью к продукции по крайней мере 0,5 г/л L-метионина в процессе выращивания на минимальной среде и устойчивую к аналогу метионина. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанным аналогом метионина является норлейцин. 3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что указанную бактерию получают путем селекции штамма, устойчивого к норлейцину, среди бактерий Escherichia coli, причем указанная селекция осуществлена по крайней мере один раз для указанного аналога метионина. 4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что штамм указанной бактерии получен из бактерии Escherichia coli, устойчивой к L-гомосерину. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что штамм указанной бактерии является производным от штамма Escherichia coli С600 (Leu⁺). 6. Штамм бактерии Escherichia coli 218 (ВКПМ В-8125) - продуцент L-метионина.