СПОСОБ СИНТЕЗА ЦЕФАЗОЛИНА Российский патент 2003 года по МПК C12P35/00 C12P35/04 C07D501/06 C12P35/04 C12R1/19 

Изобретение относится к области производства лекарственных препаратов, а именно к производству цефазолина - представителя группы эффективных полусинтетических цефалоспориновых антибиотиков.

Известны способы получения цефазолина анилированием 3-метилмеркапто-(5-метил-1,3,4-тиадиазолил-2-ил)-7-аминоцефалоспорановой кислоты (ММТД-7-АЦК) эфирами тетразол-1-уксусной кислоты (ЭТЗУК) с использованием в качестве биокатализаторов (БК) (ферментов из E.coli (см. авторское свидетельство СССР 1835827, 1990 [1] и авторское свидетельство СССР 1817473, 1990 [2]) и грибной культуры Arthrobacter viscosous sp. nov. (см. патент Японии 54-59397, 1979) [3].

Анализ известного способа [3] свидетельствует о том, что используемый в этом способе фермент не связан ковалентной связью с носителем, что приводит к вымыванию фермента в реакционную массу, а, следовательно, к потерям активности БК и загрязнению конечного продукта примесями белковой природы. Действительно, способ [3] предусматривает достаточно сложную схему очистки цефазолина: фильтрат после отделения БК пропускают через колонку с неионогенным сорбентом, затем элюат подвергают пленочной хроматографии на силикагеле, обрабатывают активированным углем и очищенный таким образом раствор упаривают для осаждения цефазолина. Недостатком этого способа является также проведение процесса при неоптимальных для синтеза цефазолина значениях pH 7,3-7,8.

Согласно способу [2] для извлечения цефазолина из реакционной массы также используют неионогенный сорбент в сочетании с анионитом. Реакцию синтеза цефазолина осуществляют в непрерывном режиме с отводом раствора из биореактора и рециркулированием его через систему последовательно соединенных колонок, заполненных сорбентами, насыщенными исходной ключевой аминокислотой (КА). Недостатком этого способа, помимо сложной схемы проведения процесса, является низкая производительность процесса, обусловленная нерациональным выбором исходных концентраций реагентов.

В качестве прототипа выбран способ [1], как наиболее технологичный и превышающий по эффективности другие известные способы. Учитывался также тот факт, что в нем используется фермент из того же семейства микроорганизмов, что и в заявляемом изобретении. Согласно способу-прототипу для ацилирования используют иммобилизованную пенициллинамидазу из E.coli (К.Ф.3.5.1.11) с соотношением активности по синтезу и гидролизу цефазолина 8:1. Степень биотрансформации ММТД-7-АЦК в цефазолин составляет 80-82%. После синтеза компоненты реакционной смеси разделяют фракционным осаждением, и ММТД-7-АЦК используют для повторного ацилирования. Степень использования КА 88%, что соответствует расходному коэффициенту 0,86 кг/кг цефазолина. Содержание основного вещества в продукте не менее 95%.

Этому способу присущи следующие недостатки:
- Низкая производительность процесса, обусловленная низкой исходной концентрацией ММТД-7-АЦК (6 г/л согласно примерам). Синтез начинают вести при неполном растворении КА при значении pH 6,2.

- Использование БК с активностью по синтезу цефазолина 200±50 мкмоль/г•мин приводит к необходимости проведения реакции при температуре 40^oС, что ведет к ухудшению качества продукта за счет гидролиза ММТД-7-АЦК и цефазолина по С3 связи.

Технической задачей, которую решает заявляемое изобретение, является увеличение производительности и общей эффективности процесса получения цефазолина, а также повышение качества конечного продукта.

Эта задача решается следующим образом. Ацилирование ММТД-7-АЦК осуществляют ЭТЗУК в водной среде в присутствии БК на основе либо иммобилизованных в полиакриламидный гель (ПААГ) клеток E.coli, штамм FU-99-S, либо полиферментного комплекса пептидогидролаз с преобладающим содержанием цефазолинсинтетазы, выделенного из этих клеток, модифицированного бифункциональным реагентом - глутаровым альдегидом, и иммобилизованного в ПААГ. Получают биокатализатор с активностью по синтезу цефазолина 360±60 мкмоль/г•мин (условия определения: 30^oС, pH 7,5, [ММТД-7-АЦК]=0,075 М, [МЭТЗУК]=0,145 М). Густота суспензии БК в реакторе варьируется от 1 до 3,5% в зависимости от активности БК и температуры реакционной массы во время синтеза, выбираемой в диапазоне от 10 до 30^oС. Начальная концентрация ММТД-7-АЦК 20-40 г/л, молярное соотношение ЭТЗУК и ММТД-7-АЦК (X) - (1,5÷4):1. Синтез цефазолина ведут в градиенте pH значений, начиная с pH, при котором обеспечивается растворение ММТД-7-АЦК (7,3-7,8 в зависимости от исходной концентрации КА и температуры процесса), и заканчивая при pH 6,0-6,3 (оптимальном для синтеза цефазолину). Уменьшение значения pH во время синтеза происходит благодаря выделению свободной кислоты - ТЗУК, образующейся при гидролизе ЭТЗУК. Однако при чрезмерном снижении pH реакционной массы возможно выпадение осадка ММТД-7-АЦК в процессе синтеза, что нежелательно. Следовательно, pH реакционной массы необходимо поддерживать на таком уровне, чтобы текущая концентрация ММТД-7-АЦК (N_τ) не превышала ее растворимости (s), то есть, чтобы соблюдалось соотношение N_τ/s≤1:

где К₂ константа ионизации аминогруппы ММТД-7-АЦК; s^± - растворимость ее цвиттерионной формы.

Расчет текущей концентрации ММТД-7-АЦК в каждый момент времени (τ) проводят с использованием уравнений (2-7) математической модели, разработанной на основе кинетической схемы синтеза цефазолина продукта (Р), согласно которой ЭТЗУК является субстратом (S), ацилирующим фермент, а ММТД-7-АЦК нуклеофилом (N), конкурирующим с водой на стадии деацилирования анцилфермента.

где V₂ и V₃ скорость ферментативного гидролиза и ферментативного синтеза цефазолина, соответственно.

a₁=1+N/k₁₂+P₂/k₁₁ (5)
a₂=1+N/k₁₂ (6)
a₃=N/K_N (7)
Здесь P₂ - побочный продукт процесса, ТЗУК.

Значения констант, входящих в уравнения (2-7) и используемых для расчета зависимости pH время, приведены в таблице 1. Эти значения были определены итерационным методом при сравнении экспериментальных кривых синтеза цефазолина с расчетными кривыми, полученными с использованием уравнений математической модели и кинетических и равновесных констант, найденных в модельных экспериментах. На рисунках 1-3 представлены для примера результаты расчета градиента рН, степени превращения ММТД-7-АЦК и параметра N_τ/s для нескольких вариантов начальных концентраций реагентов при синтезе цефазолина. Как видно из рисунков 2 и 3, при использовании высокого избытка ацилирующего агента степень превращения ММТД-7-АЦК достигает 95-97%. Расходные коэффициенты сырья в кг на кг цефазолина составляют в этом случае 0,90-0,95 для ММТД-7-АЦК и 1,3-1,5 для ЭТЗУК (в расчете на ТЗУК). Регенерация ТЗУК, заключающаяся в переводе соли ТЗУК в органический растворитель - бутанол - путем азеотропной отгонки воды после удаления неорганических солей и частичного упаривания водного раствора, позволяет снизить расходный коэффициент ЭТЗУК до 0,50-0,55 кг/кг, однако процесс регенерации является достаточно трудоемким. Между тем, при использовании примерно 2-кратного избытка ацилирующего агента, регенерация ТЗУК не требуется: расходный коэффициент ЭТЗУК составляет около 0,9-1,0 кг ТЗУК на кг цефазолина. Что касается ММТД-7-АЦК, то, поскольку степень превращения ее в цефазолин при 2-кратном избытке ацилирующего агента составляет лишь 70-75%, для создания эффективной технологии необходима регенерация непрореагировавшей ММТД-7-АЦК, которую осуществляют простым осаждением ее в изоэлектрической точке. Расходный коэффициент ММТД-7-АЦК составляет при этом около 0,8. Проведенные расчеты показывают, что вариант процесса с 2-кратным избытком ацилирующего агента является наиболее предпочтительным.

Помимо этого, для выбранного избытка ЭТЗУК существует также предпочтительный интервал концентраций ММТД-7-АЦК (25-30 г/л), при котором расчетный градиент pH от 7,3 до 6,2 достигается самопроизвольно. В других случаях рН реакционной массы поддерживают путем добавления раствора аммиака в автоматическом режиме с использованием компьютерного контроля. Управляющим параметром при этом является pH реакционной смеси, расчет которого проводят по уравнению 1. По окончании биотрансформации БК отделяют фильтрованием и используют повторно и следующем цикле синтеза цефазолина. Реакционную смесь подкисляют до рН 4,2-4,3, отделяют ММТД-7-АЦК фильтрацией, пасту промывают и используют для повторного ацилирования.

Фильтрат после отделения ММТД-7-АЦК или сразу после отделения БК (при варианте технологии с большим избытком ЭТЗУК без регенерации КА) обрабатывают окисью алюминия для удаления окрашенных примесей и осаждают цефазолин подкислением раствора до pH 1,4-1,5. При необходимости из маточного раствора после отделения цефазолина регенерируют ТЗУК, как описано ниже.

Общая степень утилизации ММТД-7-АЦК составляет 90-95%, что соответствует расходному коэффициенту 0,85-0,80 кг/кг цефазолина. Расходный коэффициент ЭТЗУК варьирует от 0,5 до 1,4. Содержание основного вещества в целевом продукте более 97%. Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Готовят раствор ММТД-7-АЦК с концентрацией 20-40 г/л в 0,3 М фосфатно-аммиачном буфере (ФАБ), рН 7,5-8,0, при температуре 10-30^oС. После этого к раствору ММТД-7-АЦК добавляют навеску ЭТЗУК из расчета молярного соотношения субстрата и КА (1,5÷4):1. Объем раствора доводят до расчетного добавлением 0,3 М фосфатно-аммиачного буфера, рН 7,5-8,0 и устанавливают начальное значение рН раствора в диапазоне 7,3-7,8.

Синтез цефазолина проводят в термостатируемом реакторе с фильтрующим днищем, снабженным лопастной мешалкой с переменной частотой вращения и системой автоматического поддержания градиента рН значений по заданной программе. В реактор загружают навеску влажного БК с активностью по синтезу цефазолина ≥ 300 мкмоль/г•мин из расчета от 10 до 35 г/л (в зависимости от выбранной температуры процесса) и раствор исходных реагентов. Реакционную массу инкубируют при перемешивании и автоматическом поддержании градиента рН в интервале (7,3-7,8)-(6,2-6,4) с помощью 2М раствора аммиака в течение 45-60 мин. Реакционную массу отделяют от БК фильтрованием, охлаждают до 5^oС, подкисляют серной кислотой до pH 4,2 и осаждают непрореагировавшую ММТД-7-АЦК в течение часа. Осадок отделяют фильтрованием, промывают небольшим объемом воды, тщательно отжимают и используют в следующем цикле синтеза цефазолина. При варианте с регенерацией ТЗУК стадию регенерации КА опускают. В маточный раствор после отделения ММТД-7-АЦК (или сразу после отделения БК) добавляют 1-2% в/о окиси алюминия, суспензию перемешивают в течение 30-40 минут и отработанный сорбент отделяют фильтрованием. Фильтрат подкисляют до рН 1,4-1,5 и осаждают цефазолин. После часовой выдержки суспензии при перемешивании и охлаждении кристаллический осадок цефазолина отделяют фильтрованием, промывают холодной водой и сушат в вакууме при 30^oС в течение 12 часов. Содержание основного вещества в целевом продукте более 97%. Для регенерации ТЗУК маточный раствор после отделения цефазолина нейтрализуют путем добавления порошка CaO или Ca(ОН)₂ и образовавшийся осадок сульфатов кальция удаляют фильтрованием. Далее раствор концентрируют в 5-7 раз упариванием в вакууме, концентрат обрабатывают активированным углем (2% в/о) для осветления, добавляют к нему бутанол из расчета 4 объема на 1 объем водного концентрата и отгоняют азеотропную смесь на роторном испарителе при остаточном давлении не менее 10 мм рт.ст. и температуре бани 40-45^oС. Упарку ведут до полной отгонки воды: для этого необходимо отогнать не менее 4/5 объема водно-бутанольной смеси. По окончании отгонки суспензию солей ТЗУК в бутаноле охлаждают до 5^oС и фильтруют под вакуумом. Пасту промывают, сушат и полученный после этерификации ЭТЗУК используют вновь для синтеза цефазолина. Расходный коэффициент ТЗУК с учетом регенерации составляет 0,5-0,55 кг/кг цефазолина.

Преимущества (отличительные признаки) предлагаемого способа:
1. Значительно повышенная по сравнению с известными способами [1], [2], [3] производительность и общая эффективность процесса получения цефазолина, достигаемая за счет высокой исходной концентрации ММТД-7-АЦК, что стало возможным благодаря организации процесса синтеза с градиентом pH значений.

2. Возможность создания высоко эффективных БК не только на основе фермента, но и на основе клеток за счет использования высокоактивного штамма - продуцента специфичного фермента. В свою очередь это позволяет снизить температуру процесса вплоть до 10^oС, не увеличивая время реакции и густоту суспензии БК. Проведение процесса в более мягких условиях приводит к улучшению качества продукта.

3. Возможность удаления окрашенных примесей за счет введения дополнительной стадии очистки раствора цефазолина окисью алюминия приводит к улучшению качества продукта.

Способ иллюстрируется следующими практическими примерами.

Пример 1. (25 г/л КА, Х=2)
Готовят раствор субстратов. 10,29 г (29,90 ммоля) ММТД-7-АЦК растворяют в 350 мл 0,3М ФАБ, рН 7,5 при температуре 30^oС, поддерживая рН раствора на уровне не менее 7,3 путем добавления 2 М раствора аммиака. После этого к раствору ММТД-7-АЦК добавляют 8,70 г (61,26 ммоля) метилового ЭТЗУК (МЭТЗУК) и объем раствора доводят 0,3 М ФАБ, рН 7,5 до 400 мл.

В реактор загружают 4,0 г влажного БК с активностью по синтезу цефазолина 360 мкмоль/г•мин и раствор исходных реагентов. Реакционную массу инкубируют при температуре 30^oС при перемешивании в течение 50 мин. pH реакционной массы самопроизвольно снижается и достигает в конце процесса значения 6,3. Реакционную массу отделяют от БК фильтрованием, охлаждают до 5^oС, подкисляют соляной кислотой до рН 4,2 и осаждают непрореагировавшую ММТД-7-АЦК в течение часа. Осадок отделяют фильтрованием, промывают 20 мл воды, тщательно отжимают и используют в следующем цикле синтеза цефазолина. Получают 13,50 г влажной пасты с содержанием ММТД-7-АЦК 21,3% и цефазолина 1,2%. В маточный раствор после отделения ММТД-7-АЦК добавляют 8 г (2% в/о) окиси алюминия, суспензию перемешивают в течение 30-40 минут и отработанный сорбент отделяют фильтрованием. Фильтрат подкисляют до рН 1,4-1,5 раствором серной кислоты (1: 1) и осаждают цефазолин. После часовой выдержки суспензии при перемешивании и охлаждении кристаллический осадок цефазолина отделяют фильтрованием, промывают 30 мл холодной водой и сушат в вакууме при 30^oС в течение 12 часов. Получают 8,98 г (19,78 ммолей) цефазолина. Содержание основного вещества в целевом продукте 98,1%. Расходные коэффициенты ММТД-7-АЦК и ТЗУК составляют соответственно 0,828 и 0,874 кг/кг цефазолина.

Примеры 2 и 3.

Получение цефазолина осуществляют аналогично примеру 1, за исключением того, что используют этиловый и пропиловый эфиры ТЗУК (ЭЭТЗУК и ПЭТЗУК, соответственно). Температура 30^oС, навеска БК - 4,0 г. Результаты представлены в таблице 2.

Примеры 4-7.

Растворы субстратов объемом 400 мл готовят аналогично описанию в примере 1, за исключением того, что используют 0,3 М ФАБ, pH 7,5-8,0 и pH исходного раствора устанавливают в диапазоне от 7,3 до 7,8.

В реактор загружают соответствующую навеску влажного БК и раствор исходных реагентов. Реакционную массу инкубируют при заданной температуре и перемешивании в течение 50-60 мин, поддерживая значение рН реакционной массы в соответствии с рассчитанным градиентом путем добавления раствора аммиака в автоматическом режиме. По окончании синтеза проводят фракционное осаждение компонентов, как это описано в примере 1. В примере 6 стадию осаждения ММТД-7-АЦК опускают. В примерах 5-7 проводят регенерацию ТЗУК из маточного раствора после отделения кристаллического осадка цефазолина. К маточному раствору объемом 420 мл добавляют при перемешивании 13,9 г CaO (содержание основного вещества 94%) до достижения pH суспензии около 7,5. Образовавшийся осадок CaSO₄ отделяют фильтрованием в вакууме и тщательно промывают, суспендируя его в 50 мл воды. Промывку присоединяет к фильтрату. Объединенный фильтрат объемом 430 мл упаривают на роторном испарителе при остаточном давлении 10 мм рт.ст. и температуре бани 45^oС до 70 мл. Водную суспензию неорганических солей отфильтровывают, промывают водой, 3 раза по 5 мл, промывку присоединяют к концентрату ТЗУК. К объединенному концентрату объемом 80 мл добавляют 1,6 г активированного угля и суспензию перемешивают в течение 20 минут. Уголь отфильтровывают, промывают 10 мл воды, тщательно отжимают. К осветленному водному концентрату ТЗУК объемом 85 мл добавляют 340 мл бутанола и азеотропную смесь отгоняют на роторном испарителе при остаточном давлении 10 мм рт.ст. и температуре бани 45^oС. Упарку ведут до полной отгонки воды. Отгон водно-бутанольной смеси объемом 350 мл делят в делительной воронке: воду выбрасывают, а бутанол-отгон используют повторно. Кубовый остаток бутанольную суспензию солей ТЗУК объемом 70 мл охлаждают до 5^oС и фильтруют под вакуумом. Осадок солей промывают свежим бутанолом, 2 раза по 5 мл, отжимают и сушат в вакуум-сушильном шкафу. Получают порошок, содержащий около 60% ТЗУК и 40% неорганических солей. Выход ТЗУК при регенерации около 95% от содержания ее в маточном растворе после отделения цефазолина. Продукт используют для синтеза МЭТЗУК с выходом 88-90%. Результаты экспериментов представлены в таблице 3.

Изобретение относится к производству цефазолина - полусинтетического антибиотика цефалоспоринового ряда. Способ заключается в ацилировании 3-метилмеркапто-(5-метил-1,3,4-тиадиазолил-2-ил)-7-аминоцефалоспорановой кислоты (ММТД-7-АЦК) эфирами тетразол-1-уксусной кислоты (ЭТЗУК) в водной среде в присутствии иммобилизованного фермента из E.coli с последующим фракционным осаждением ММТД-7-АЦК и цефазолина и рециклированием ММТД-7-АЦК. Ацилирование проводят при температуре 10-30^oС в градиенте pH 7,8-6,2 с использованием исходной концентрации ММТД-7-АЦК 20-40 г/л и избытка ЭТЗУК (1,5-4): 1. В качестве биокатализатора используют иммобилизованный в полиакриламидный гель полиферментный комплекс пептидогидролаз E.coli штамма FU-99-S с преобладающим содержанием цефазолинсинтетазы, с активностью по синтезу цефазолина ≥ 300 мкмоль/•мин и соотношением активности по синтезу и гидролизу цефазолина более 8:1, в виде биомассы клеток продуцента цефазолинсинтетазы или фермента, выделенного из биомассы клеток. Использование способа позволяет повысить производительность и эффективность способа и качество целевого продукта. 4 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Способ получения цефазолина ацилированием 3-метилмеркапто-(5-метил-1,3,4-тиадиазолил-2-ил)-7-аминоцефалоспорановой кислоты (ММТД-7-АЦК) эфирами тетразол-1-уксусной кислоты (ЭТЗУК) в водной среде в присутствии иммобилизованного фермента из E. coli с последующим фракционным осаждением ММТД-7-АЦК и цефазолина и рециклированием ММТД-7-АЦК, отличающийся тем, что ацилирование проводят при температуре 10-30^oС в градиенте рН 7,8-6,2, с использованием исходной концентрации ММТД-7-АЦК 20-40 г/л, молярного избытка ЭТЗУК (1,5-4): 1 и иммобилизованного в полиакриламидный гель (ПААГ) полиферментного комплекса пептидогидролаз E. coli штамма FU-99-S с преобладающим содержанием цефазолинсинтетазы, с активностью по синтезу цефазолина ≥ 300 мкмоль/г•мин и соотношением активности по синтезу и гидролизу цефазолина более 8: 1. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ацилирование проводят предпочтительно в градиенте рН 7,3-6,2, устанавливающемся самопроизвольно, с использованием исходной концентрации ММТД-7-АЦК 25-30 г/л и избытка ЭТЗУК (1,9-2,4): 1. 3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что в качестве ацилирующего агента предпочтительно используют метиловый ЭТЗУК. 4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что в качестве биокатализатора используют иммобилизованную в ПААГ биомассу клеток продуцента цефазолинсинтетазы. 5. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что в качестве биокатализатора используют иммобилизованную в ПААГ цефазолинсинтегазу, выделенную из биомассы клеток.