СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ В МАЗКАХ КРОВИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И ПТИЦ Российский патент 2003 года по МПК A61B5/145 G01N33/49 

Изобретение относится к области ветеринарной медицины, в частности иммунологии с/х животных и птиц.

В ветеринарии определение иммунного статуса животных и птиц является проблемой, для решения которой необходимо определение микробицидных свойств системы крови, в частности определения щелочной фосфатазы в нейтрофильных гранулоцитах. Фосфатазы относятся к гидролазам (3), щелочная фосфатаза (3.1.3.1. ), которая способна разрывать связи Р - - -О. Щелочная фосфатаза катализирует реакцию гидролиза моноэфира ортофосфата, расщепляя на спирт и фосфорную кислоту:
Моноэфир ортофосфат + Н₂О = Спирт + Н₃РO₄.

Известно определение щелочной фосфатазы в тканях [Gomori (1952 г.) З. Лойда, Р. Госсрай, Т. Шиблер. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы. Пер. с англ. к.б.н. И.Б. Бухвалова, к. м. н. О.В. Копьева, под ред. проф. Н. Т. Райхлина. М.: Мир, 1982, стр. 12, 17, 142-143], где осуществляют подготовку мазков крови, фиксацию и обработку их буфферно-инкубационной смесью, инкубацию мазков крови с последующим высушиванием и микроскопированием.

Также известно определение щелочной фосфатазы в мазках крови и костного мозга человека [см. Kaplow (1955; 1963) Ф.Г. Дж. Хейхоу, Д. Кваглино. Гематологическая цитохимия. Лабораторные методы. Пер. с англ. Е.В. Самочатовой, под ред. проф. Н. С. Кисляк. М., Медицина, 1983, стр.143-144], где осуществляют подготовку мазков крови, фиксацию и обработку их буферно-инкубационной смесью, инкубацию мазков крови, с последующим высушиванием и микроскопированием.

Недостатками данного метода является длительный процесс, не достаточно точное определение содержания щелочной фосфатазы, затруднительное получение буферной смеси с определенным рН, которое имеет важное значение, а также окраска ядер клеток гематоксилином, что затрудняет дифференцировку ядер нейтрофила.

Активность щелочной фосфатазы присуща зрелым клеткам. Резкое снижение содержания фермента в клетках наблюдается при хроническом миелолейкозе, а повышение при воспалительном лейкоцитозе. Определение активности щелочной фосфатазы в мазках крови относится к тестам II уровня диагностики иммунного статуса организма животных и птиц. Снижение иммунитета влечет за собой нарушение гомеостаза организма и вытекающих из него последствий: снижение сохранности молодняка, репродуктивной способности и т. д.

Техническим решением задачи является повышение точности диагностирования, уменьшение затрат времени и материальных затрат.

Поставленная задача достигается тем, что в способе определения активности щелочной фосфатазы в мазках крови крупного рогатого скота и птиц, включающем подготовку мазков крови, фиксацию и обработку их буферно-инкубационной смесью, инкубацию мазков крови с последующим высушиванием и микроскопированием, применяют мазки крови крупного рогатого скота и птиц, для приготовления буферной смеси используют тетраборат натрия Na₂B₄O₇ 10 Н₂O 0,025 М, в который добавляют 0,1М раствор соляной кислоты (НСl) 4,6-5 мл, для обеспечения рН 9,18-9,19. Инкубацию проводят в темноте в течение 30 мин при температуре 18-20^oС, промывают проточной водой 10 мин, ополаскивают дистиллированной водой, высушивают и ядра клеток нейтрофильных гранулоцитов докрашивают в красный цвет краской - 0,5%-ным водным раствором сафронина или нейтральным красным в течение 0,5-1 мин, затем промывают дистиллированной водой, сушат и по количеству окрашенных гранул в коричневый цвет в цитоплазме нейтрофилов, определяют активность фермента щелочной фосфатазы по среднему цитохимическому индексу.

Фиксацию мазков осуществляют в парах 40%-ного формалина 1-3 мин и для приготовления инкубационной смеси используют α-нафтилфосфатом натрия в количестве 2,4-2,5 мг, который постепенно растворяют в 2,4-2,5 мл буфере тетрабората натрия, затем берут 4-5 мг красителя нейтрального прочного синего В и растворяют его в 2,5 мл буфера тетрабората натрия (рН 9,18-9,19) и полученные растворы А и В смешивают, фильтруют в темноте через стеклянный фильтр.

Новизна заявляемого способа обусловлена тем, что является наиболее быстрым и точным, по сравнению с известным методом определения щелочной фосфатазы в сыворотке крови как с научной, так и с экономической стороны. Фермент поступает из тканей в форменные элементы крови и локализуется в их цитоплазме в виде гранул (лизосом), где они выполняют определенные внутриклеточные функции.

Предложенный метод позволяет определить активность изучаемого фермента в нейтрофильных гранулоцитах и возможность оценки цитохимической реакции, что невозможно определить в сыворотке крови; определить состояние микробицидных систем крови принимающих участие в формировании неспецифической резистентности организма; - определить активность щелочной фосфазы в клетках крови по четырем степеням. Кроме того, заявляемое предложение является более экономичной, т.к. не требует применения особо дорогостоящих химических реактивов, так же нет необходимости получения сыворотки крови.

Щелочная фосфатаза:
1) первичная реакция (реакция ферментативного расщепления) - гидролиза с участием фермента щелочной фосфатазы (3.1.3.1) из класса 3 - гидролаз:

2) вторичная реакция (реакция сочетания), т.е. взаимодействия α - нафтола с нейтральным прочным синим В

Пример конкретного осуществления способа определения щелочной фосфатазы крупного рогатого скота и птиц
Подготовка мазков крови и фиксация
Кровь для исследования брали у коров из яремной вены. У птицы кровь брали из крыловой вены. Из крови делали мазок. Для этого каплю крови наносили на край сухого обезжиренного стекла, которое удерживали между большим и средним пальцами левой руки. Впереди капли под углом 45^o подводили шлифованный край покровного стекла так, чтобы образовавшейся угол между стеклами был равномерно заполнен кровью. Движением правой руки от себя каплю распределяли тонким слоем по предметному стеклу. Хорошим мазком будет такой, в котором кровь располагается на поверхности стекла без просветов, в виде равномерной полоски, не выходящей за ее края. Мазки сушат на воздухе и фиксируют в парах 40%-ного формалина в течение 1-3 мин. Для этого на дно эксикатора наливают около 150 мл формалина, оставляют под закрытой крышкой на 30 мин для возгонки паров формалина. Затем осторожно снимают крышку и на решетку эксикатора помещают мазки и закрывают крышкой. Таким образом, мазки фиксируются.

Приготовление буферных растворов
В начале проводили калибровку иономера рН - 150. Для приготовления буферной смеси берут: 0,025 М раствор тетрабората натрия (Na₂B₄O₇ 10 Н₂О, с относительной молекулярной массой 382).

К 50 мл раствора тетрабората натрия добавляют 4,6-5 мл 0,1М раствор соляной кислоты (НСl с относительной молекулярной массой 36,465), с помощью которого раствор доводят рН до 9,18. Очень важно получить рН в пределах от 9,18, до 9,19 для активации фермента - щелочной фосфатазы.

Приготовление буферно-инкубационной смеси
Правильное приготовление инкубационной смеси имеет немаловажное значение для дальнейшей окраски мазков. Готовить инкубационную смесь желательно в затемненной комнате. Для этого готовят раствор 1 и 2.

Приготовление раствора 1
Берут 2,5 мг α-нафтилфосфата натрия, который постепенно растворяют в 2,5 мл буфере тетрабората натрия.

Приготовление раствора 2
Берут 5 мг красителя нейтрального прочного синего В и растворяют его в 2,5 мл буфере тетрабората натрия, смешивая их постепенно (рН 9,18).

Полученные растворы смешивают, фильтруют в темноте желательно через стеклянный фильтр.

Обработка мазков крови буферно-инкубационной смесью
На фиксированные формалином мазки наносится равномерным слоем инкубационная смесь. Во время инкубации периодически необходимо добавлять смесь, т. к. происходит испарение жидкости, которая включает в себя легко улетучивающееся вещество (α- нафтол). Необходимо строго соблюдать температурный режим (18-20^oС), т. к. фермент активен при заданной температуре. Инкубацию проводят в темноте в течение 30 мин при температуре 18-20^oС, промывают проточной водой 10 мин, ополаскивают дистиллированной водой, высушивают и ядра клеток нейтрофильных гранулоцитов докрашивают в красный цвет краской - 0,5%-ным водным раствором сафронина или нейтральным красным в течение 0,5-1 мин, затем промывают дистиллированной водой, сушат и по количеству окрашенных гранул в коричневый цвет в цитоплазме нейтрофилов, определяют активность фермента щелочной фосфатазы по среднему цитохимическому индексу.

Микроскопия мазков
Микроскопию проводят с использованием иммерсионной системы при увеличении (90 х 15). Активность щелочной фосфатазы определяют по количеству гранул коричневого цвета в цитоплазме нейтрофилов, ядра клеток которых докрашены в красный цвет сафронином или нейтральным красным.

Визуально проводят оценку цитохимической реакции:
0-й степень - окрашено только ядро, цитоплазма не окрашена, не видно контуров гранул;
1-я степень - вся цитоплазма диффузно окрашена или окрашено не более 1/4 цитоплазмы;
2-я степень - в цитоплазме видны хорошо окрашенные гранулы, окрашено более 1/4 цитоплазмы;
3-я - всю цитоплазму занимают гранулы, но ядро свободно 1/4 и более цитоплазмы;
4-я степень - гранулы занимают всю цитоплазму и наслаиваются на ядро.

Средний цитохимический индекс выводят по следующей формуле, предварительно подсчитывая 100 нейтрофилов:
,
где а, б, в, г, д - количество клеток соответственно 0,1,2,3,4 -й степени.

Данная методика позволяет экспресс-методом определить микробицидные свойства системы крови, в частности определения щелочной фосфатазы в нейтрофильных гранулоцитах. Определение активности щелочной фосфатазы в мазках крови является одним из важных тестов диагностики иммунного статуса организма животных и птиц. Высокие показатели среднего цитохимического индекса щелочной фосфатазы в нейторфилах указывает на состояние иммунного статуса и общее клиническое состояние организма.

Изобретение относится к ветеринарной медицине. Способ включает подготовку мазков крови, фиксацию и обработку их буферно-инкубационной смесью, инкубацию мазков крови с последующим высушиванием и микроскопированием. При этом для приготовления буферной смеси используют 0,025 М тетраборат натрия, в который добавляют 4,6-5 мл 0,1 М соляной кислоты для обеспечения рН 9,18-9,19. Инкубацию мазков крови проводят в темноте в течение 30 мин при температуре 18-20^oС. Затем промывают мазки проточной водой 10 мин. Ополаскивают дистиллированной водой и высушивают. Ядра клеток нейтрофильных гранулоцитов докрашивают в красный цвет краской - 0,5%-ным водным раствором сафронина или нейтральным красным в течение 0,5-1 мин. По количеству окрашенных гранул в коричневый цвет в цитоплазме нейтрофилов определяют активность фермента щелочной фосфатазы по среднему цитохимическому индексу. Способ прост в исполнении, точен, позволяет повысить уровень иммунологических исследований у крупного рогатого скота и птиц. 1 з.п.ф-лы.

1. Способ определения активности щелочной фосфатазы в мазках крови крупного рогатого скота и птиц, включающий подготовку мазков крови, фиксацию и обработку их буферно-инкубационной смесью, инкубацию мазков крови с последующим высушиванием и микроскопированием, отличающийся тем, что для приготовления буферной смеси используют 0,025 М тетраборат натрия (Na₂B₄O₇•10H₂O), в который добавляют 4,6-5 мл 0,1 М соляной кислоты (НСl) для обеспечения рН 9,18-9,19, при этом инкубацию проводят в темноте в течение 30 мин при температуре 18-20^oС, промывают проточной водой 10 мин, ополаскивают дистиллированной водой, высушивают и ядра клеток нейтрофильных гранулоцитов докрашивают в красный цвет краской 0,5%-ным водным раствором сафронина или нейтральным красным в течение 0,5-1 мин, затем промывают дистиллированной водой, сушат и по количеству окрашенных гранул в коричневый цвет в цитоплазме нейтрофилов определяют активность фермента щелочной фосфатазы по среднему цитохимическому индексу. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что фиксацию мазков осуществляют в парах 40% формалина 1-3 мин и для приготовления инкубационной смеси используют α--нафтилфосфатом натрия в количестве 2,4-2,5 мг, который постепенно растворяют в 2,4-2,5 мл буфере тетрабората натрия, затем берут 4-5 мг красителя нейтрального прочного синего В и растворяют его в 2,5 мл буфера тетрабората натрия (рН 9,18-9,19), полученные растворы смешивают и фильтруют в темноте через стеклянный фильтр.