СПОСОБ ОЦЕНКИ ТЕЧЕНИЯ И ИСХОДА ГНОЙНО-СЕПТИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У ДЕТЕЙ Российский патент 1997 года по МПК G01N33/48 G01N1/28 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для объективной оценки здоровья человека.

Исследованиями последних лет показано, что нарушение функционирования иммунной системы приводит к снижению устойчивости организма, к инфекциям, развиваются осложнения при многих видах патологии.

Нейтрофильные гранулоциты (ИГ) являются первой "аварийной" линией иммунитета, от состояния которой зависит реализация следующего более специализированного уровня защиты приобретенного иммунитета и иммуноспособность организма в целом.

Нейтрофильные гранулоциты обладают микробицидными системами, принимающими участие в обезвреживании бактериальных антигенов (АГ), различных аллергенов и иммунных комплексов. Активность микробицидной системы обеспечивается содержанием азурофильных и специализированных гранул нейтрофилов, и, в частности щелочной фосфатазой, хлорацетат-AS-D-эстеразой, свободными катионными белками, миелопероксидазой, оксидазными системами, генерирующими сверхокисные радикалы.

Хлорацетат-AS-D-эстераза концентрируется в лизосомальных первичных гранулах в палочках АУЭРА. Показано, что в гранулоцитах хлорацетат-AS-D-эстераза имеет свойства, аналогичные таковым химотрипсина; сделано предположение, что эти ферменты возможно идентичны, так что эстераза, демонстрируемая по действию на хлорацетат как субстрат, на самом деле обеспечивает протеолитическую и переваривающую функцию нейтрофилов.

Полагают, что изменение эстеразной активности может отражать физиологическую или иммунологическую стимуляцию моноцитов, нейтрофилов, поскольку эти клетки явно способны воспринимать "активацию" окружающими факторами, включая инфекционные, паразитарные, и возможно, антигенные стимулы, ведущие к их созреванию.

Цитохимическое определение эстераз, в частности хлорацетат-AS-D-эстеразы в лейкоцитах, получило практическое использование в последние годы выделения гранулоцитов, их предшественников от моноцитов и монобластов. Реакции имеют значение для дифференциации форм миелоидного лейкоза и моноцитарных предшественников среди других малодифференцированных популяций лейкозных клеток (Рыбакова И. А. Активность некоторых эстераз в клетках гемопоэза у детей в норме и патологии: Автореф. М. 1973). Состояние микробицидной системы нейтрофилов при инфекционных процессах, в том числе при гнойно-септических заболеваниях, может оказывать значительное воздействие на характер течения и исход болезни. Активность хлорацетат-AS-D-эстеразы достоверно снижается в остром периоде септикомиелической формы сепсиса и тяжелой стафилококковой пневмонии во всех возрастных группах. По выздоровлении наступает нормализация активности. Острый и хронический гематогенный остеомиелит, гнойные поражения кожи и мягких тканей не сопровождаются достоверными изменениями активности хлорацетат-AS-D-эстеразы. Определение активности хлорацетат-AS-D-эстеразы нейтрофилов может использоваться в качестве прогностического признака с целью прогнозирования характера и течения заболевания (Нестерова И.В. Интралейкоцитарная микробицидная система нейтрофильных гранулоцитов у здоровых детей и при гнойно-септических заболеваниях: Автореф. М. 1980).

В норме основная часть нейтрофилов находится в cостоянии покоя. Функциональные возможности открываются лишь на фоне стимулирующих воздействий. На фоне стимуляции происходит запуск одного из важнейших механизмов жизнедеятельности нейтрофилов дегрануляции, связанный с мобилизацией гранулярного аппарата клетки и расходованием компонентов гранул не только интрафагосомально, но и экстрацеллюлярно. Установлено, что при "естественной" активации нейтрофилов, например, при гнойно-септических заболеваниях, уровень содержания хлорацетат-AS-D-эстеразы в них снижается и зависит от степени тяжести и вида процесса (Нестерова И.В. Тараканов В.А. Состояние интралейкоцитарной микробицидной системы нейтрофильных гранулоцитов у детей со стафилококковой деструкцией легких. М. 1980, вып. 26, с. 52 58).

Сделано предположение, что расходование хлорацетат-AS-D-эстеразы, полученное при искусственной стимуляции нейтрофилов in vitro, может при сравнении с исходным уровнем хлорацетат-AS-D-эстеразы дать представление о характере мобилизации гранулярного аппарата клеток.

Имеется несколько способов выявления уровня хлорацетат-AS-D-эстеразы, используемых для диагностики: азосочетание с нафтолом AS-D, нафтолом AS-αC или ацетатом нафтола AS-MX, одновременное азосочетание с α-нафтилацетатом и стабилизированными солями диазония в модификации, одновременное азосочетание с производными нафтола и стабильными солями диазония в модификации (Лойда З. Госсрау Р. Шиблер Т. М. Лабораторные методы. М. 1982), определение a-нафтил-AS-D-хлорацетат эстеразы (Хейхоу Д. Кваглино И. Гематологическая цитохимия. М. Медицина, 1983, с. 173).

За прототип принят метод определения активности хлорацетат-AS-D-эстеразы в нейтрофильных гранулоцитах по Нестеровой И.В. (Нестерова И.В. Диагностика изменений в микробицидной системе нейтрофильных гранулоцитов при аллергических заболеваниях. Методические рекомендации. М. 1989).

Метод основан на том, что из капиллярной крови готовят мазок, фиксируют в парах 10%-го формалина в течение 1 мин, подсушивают на воздухе в течение 15 мин, затем инкубируют в течение 30 мин при 20^oC в инкубационной смеси следующего состава: 10 мг нафтол-As-D-хлорацетата растворяют в 4 мл ацетона, добавляют 50 мл ацетат-вероналового буфере Михаэлиса рН 7,0. Добавляют в смесь 100 мг синего прочного ВВ. Профильтровывают в темноте.

Далее мазок промывают в двух сменах дистиллированной воды. Высушивают. Докрашивают ядра 0,5% -ным раствором нейтрального красного на забуференном физрастворе рН 7,0 в течение 1 мин. Мазок промывают дистиллированной водой. Высушивают.

Активность хлорацетат-AS-D-эстеразы определяют по количеству гранул интенсивного синего цвета в цитоплазме нейтрофилов. Ядра окрашены в красный цвет.

Подсчитывают количество нейтрофилов с учетом степени интенсивности окраски гранул по принципу Kaplow (1955):
0-я степень окрашено только ядро, цитоплазма не окрашена, не видно контуров гранул;
1-я степень вся цитоплазма диффузно окрашена или окрашено не более 1/4 цитоплазмы;
2-я степень в цитоплазме хорошо видны окрашенные гранулы, окрашено более 1/4 цитоплазмы;
3-я степень всю цитоплазму занимают гранулы, но ядро свободно, окрашено 3/4 цитоплазмы и более;
4-я степень гранулы занимают всю цитоплазму и наслаиваются на ядро.

После подсчета 100 нейтрофильных гранулоцитов выводят средний цитохимический индекс (СЦИ):
,
где а, в, с, д, е количество клеток соответственно 0, 1, 2, 3, 4-й степени.

Недостатком прототипа является то, что данный метод позволяет выявить содержание хлорацетат-AS-D-эстеразы лишь на момент взятия крови и не дает возможности объективно судить о том, как клетка будет реагировать на тот или иной раздражитель, стимулятор или активатор, не дает возможности прогнозировать поведение нейтрофилов в экстремальных для организма условиях, не позволяет определить адаптационные возможности иммунной системы человека.

Цель исследования диагностика характера течения и исхода гнойно-септических заболеваний.

Задачи:
определение уровня хлорацетат-AS-D-эстеразы в неактивированных нейтрофильных гранулоцитах периферической крови;
определение уровня хлорацет-AS-D-эстеразы в нейтрофилах, подверженных активирующему воздействию комбинированного стимулятора, включающего аллерген гемолитического стафилококка и гепарин-тетразолиевый комплекс;
разработка параметров расходования хлорацетат-AS-D-эстеразы при сопоставлении уровней содержания хлорацетат-AS-D-эстеразы в неактивированных и активированных нейтрофилах;
использование разработанных параметров для прогнозирования течения и исхода гнойно-септических заболеваний.

Способ осуществляется следующим образом.

У больного берут капиллярную кровь в пробирку с антикоагулянтом и готовят первый мазок (уровень хлорацетат-AS-D-эстеразы в неактивированных нейтрофилах). Затем в лунку планшета помещают 50 мкл крови, добавляют 50 мкл гепарина, потом 50 мкл аллергена гемолитического стафилококка в концентрации 10^-5 10^-3, далее вводят 50 мкл 0,2%-ного раствора тетранитросинего тетразолия. Планшет встряхивают в течение 1 мин для смешения компонентов реакции, затем инкубируют в термостате при температуре 37^o в течение 1 ч 45 мин. Далее готовят препарат каплю на стекле и высушивают на воздухе (уровень хлорацетат-AS-D-эстеразы в активированных нейтрофилах). Оба препарата после фиксации в парах 10%-го формалина в течение 1 мин окрашивают в течение 30 мин при 22^oC инкубационной смесью следующего состава (Аналог в модификации Нестеровой И.В. 1983): 10 мл нафтол-AS-D-хлорацетата, растворенного в 4 мл ацетона, 50 мл ацетат-вероналового буфера Михаэлиса рН 7,0, 0,100 мл синего прочного ВВ. Аналогичные прототипу в течение 1 мин ядра докрашивают 0,5-1,0% -ным раствором нейтрального красного на забуференном физрастворе. Мазки микроскопируют, подсчитывают нейтрофилы с учетом степени интенсивности окраски гранул. После этого выводят СЦИ и рассчитывают коэффициент расходования хлорацетат-AS-D-эстеразы:

С использованием разработанного метода исследована кровь 42 детей, 11 из которых страдали различными формами гнойно-септических заболеваний: сепсис, перитонит, острый гематогенный остеомелит, флегмоны, 31 соматически здоровые дети различного возраста (крипторхизм, паховые грыжи, варикоцеле).

Установлено, что под влиянием стимуляции комплексным поливалентным антигеном количество хлорацетат-AS-D-эстеразы значительно снижается. Так, в неактивированных ВГ оно составило 2,25 ± 0,10, а после стимуляции 0,48 ± 0,09 (табл. 1). По-видимому, это обусловлено расходованием хлорацет-AS-D-эстеразы посредством дегрануляции на экстрацеллюлярный выброс при воздействии на мембрану комбинированного стимулятора.

Таким образом, получены дополнительные данные, позволяющие прогнозировать поведение нейтрофильных гранулоцитов в экстремальных условиях.

Дальнейшие исследования показали, что при гнойно-септических заболеваниях уровень расхождения хлорацетат-AS-D-эстеразы (наибольший) наблюдается при нормализации состояния больного и выздоровлении (группа 1). Высокий уровень показателей имеет место при острой фазе локальных форм гнойной инфекции и остается повышенным в фазе улучшения и реконвалесценции (группа 2) (табл. 2). Высокие уровни показателей соответствуют неблагоприятному течению с развитием различных гнойных осложнений и получены при развитии генерализованных форм гнойной хирургической инфекции.

Установлена четкая зависимость между тяжестью гнойно-септического процесса и величиной коэффициента расходования хлорацетат-AS-D-эстеразы (табл. 3).

Таким образом, уровень хлорацетат-AS-D-эстеразы, коэффициент расходования эстеразы отражают характер течения заболевания, позволяя оценить состояние организма, степень развития гнойной хирургической инфекции.

Примеры. Больной З. 7 лет. Поступил в детское хирургическое отделение N 1 Краевой детской больницы по поводу аденофлегмоны подмышечной области справа. Болен в течение 4 дней. При поступлении состояние средней тяжести, температура 38,2^o. В день поступления произведена операция вскрыты аденофлегмоны, осуществлены санация гнойника, дренирование. У больного взята кровь для определения уровня хлорацетат-AS-D-эстеразы. Для этого определяли уровень хлорацетат-AS-D-эстеразы в неактивированных нейтрофилах, в нейтрофилах, подверженных активирующему воздействию комбинированного стимулятора, включающего в себя аллерген гемолитического стафилококка и гепарин-тетразолиевый комплекс, затем рассчитывали коэффициент расходования эстеразы:

Активность хлорацетат-AS-D-эстеразы по СЦИ: ХА_неакт 1,40; ХА_{активир} 0,54; КрЭ 2,6. Течение заболевания в послеоперационном периоде без осложнений, на фоне проводимого комплексного общего и местного лечения состояние ребенка быстро нормализовалось, гнойный очаг санирован. Дренажи удалены на третьи сутки. В удовлетворительном состоянии он выписан на восьмые сутки. Активность хлорацетат-AS-D-эстеразы по СЦИ: ХА_неакт - 1,35; ХА_акт 0,11; КрЭ 13,5.

Больной Ш. 11 лет. Находился в детском хирургическом отделении N 1 Краевой детской больницы с диагнозом острый гематогенный остеомиелит правой бедренной кости, септикопиемическая форма; флегмона спины. Поступил в остром периоде заболевания на шестой день от его начала в тяжелом состоянии. После предоперационной подготовки произведено оперативное вмешательство - периостеотомия, микроостеоперфорации, вскрытие флегмоны спины, дренирование. Получал комплексное лечение антибактериальную, дезинтексикационную, посиндромную терапию, активное местное лечение, физиотерапию, иммобилизацию конечности. Течение заболевания относительно гладкое, благоприятное, без осложнений. На четвертые сутки пребывания в стационаре наступила стабилизация состояния ребенка, на девятые сутки отмечено постепенное улучшение состояния. Кровь на определение коэффициента расходования хлорацетат-AS-D-эстеразы взята на шестые сутки лечения, уровень этого показателя по СЦИ составил: ХА_неакт 2,39; ХА_акт 1,19; КрЭ 2,0. Мальчик выписан на 22-е сутки в удовлетворительном состоянии. КрЭ 12,4.

Больной Б. 1 месяц. Поступил в отделение интенсивной терапии Краевой детской больницы в крайне тяжелом состоянии c явлениями бактериально-токсического шока. Диагноз при поступлении: неонатальный сепсис, септикопиемия, острый гематогенный остеомиелит правой бедренной кости, остеомиелическая флегмона, септическая пневмония, септический энтероколит. ДВС синдром. Проведена интенсивная противошоковая подготовка к операции: вскрытие остеомиелической флегмоны, санация, дренирование. Состояние оставалось крайне тяжелым за счет сохраняющейся интоксикации, явлений дыхательной недостаточности. На третьи сутки диагностировано септическое осложнение заболевания гнойный медиастенит. Произведены вскрытие гнойного очага, дренирование средостения. В послеоперационном периоде состояние больного длительно оставалось тяжелым. Показатель хлорацетат-AS-D-эстеразы на вторые сутки от поступления составил по СЦИ: ХА_неакт 1,24; ХА_акт 1,09; КрЭ 1,0. На третьи сутки после операции показатель хлорацетат-AS-D-эстеразы составил по СЦИ: ХА_неакт 1,18; ХА_акт 1,0; КрЭ 1,18.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для объективной оценки здоровья человека. Сущность предлагаемого способа: определение уровней хлорацетат-AS-D-эстеразы нейтрофильных гранулоцитов периферической крови в неактивированных нейтрофилах и нейтрофилах, подверженных активирующему воздействию комбинированного стимулятора, включающего в себя аллерген гемолитического стафилококка и гепарин тетразолиевый комплекс. По отношению уровней хлорацетат-AS-D-эстеразы в неактивированных нейтрофилах к количеству хлорацетат-AS-D-эстеразы в активированных нейтрофилах определяют коэффициент расходования эстеразы. При условии его уменьшения прогнозируют неблагоприятное течение гнойно-септического заболевания, а при условии увеличения коэффициента расходования эстеразы - благоприятное течение болезни. Внедрение нового метода диагностики позволит проводить более корректную иммуноактивную терапию, повысить эффективность лечения, сократить время пребывания больных детей в стационаре. 3 табл.

Способ оценки течения и исхода гнойно-септических заболеваний у детей, включающий цитохимическое исследование крови, отличающийся тем, что определяют уровень хлорацетат-АS-D-эстеразы в неактивированных и активированных нейтрофилах, рассчитывают коэффициент расходования эстеразы, равный отношению первого показателя к второму, и при его уменьшении относительно нормы прогнозируют неблагоприятное течение, а при увеличении благоприятное течение гнойно-септического заболевания.