СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ T-, B-, NK-ЛИМФОЦИТОВ В МАЗКАХ КРОВИ ЖИВОТНЫХ И ПТИЦ Российский патент 2002 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области ветеринарной медицины, в частности иммунологии с/х животных и птиц.

Известно решение, где определение популяций лимфоцитов в крови крупного рогатого скота и овец осуществляется путем иммунохимического анализа их поверхности в реакциях розеткообразования с помощью эритроцитарных маркеров (см. "Иммунологические методы исследования в животноводстве", Методические рекомендации, г. Львов 1987 г., с. 36.).

Также известны иммунологические исследования (см. З. Лойда, Р. Госсрай, Т. Шблер Гистохимия ферментов. Лабораторные методы. Пер. с англ. к.б.н. И.Б. Бухвалова, к.м.н. О.В.Копьева, под ред. проф. Н.Т.Райхлина издательство Мир Москва 1982. Стр. 103), включающие подготовку биологического субстрата, обработку его буферно-инкубационной смесью, содержащей фосфатный буфер, α-нафтилацетат с ацетоном и краситель нейтральный прочный синий, инкубацию биологического субстрата с последующим высушиванием и микроскопированием.

Недостатком известных технических решений является трудность в получении буферной смеси определенным рН, отсутствие возможности окраски ядер лимфоцитов, т.к. В-клетки определяют по окраске ядра.

Техническим решением задачи является повышение эффективности иммунологических исследований за счет исключений потерь лейкоцитов в процессе получения и обработки материала, обеспечения возможности одновременного определения особо важных клеток, участвующих в формировании неспецифической резистентности организма, определение экономической эффективности.

Задача достигается тем, что в способе определения дифференцировки Т-, В-, NK-лимфоцитов в мазках крови животных и птиц, включающем в себя подготовку биологического субстрата, обработку его буферной инкубационной смесью, содержащей фосфатный буфер, α-нафтилацетат с ацетоном и краситель нейтральный прочный синий, инкубацию биологического субстрата, окраску с последующим высушиванием и микроскопированием, в качестве биологического субстрата используют мазки крови животных и птицы, для приготовления буферной смеси используют однозамещенный фосфорно-кислый калий (КН₂РO₄) и двузамещенный фосфорно-кислый натрий (Na₂HРО₄). Затем в инкубационную смесь добавляют 1,2 - 1,3 мл буферной смеси для обеспечения рН 8,0 - 8,2 среды. При этом инкубацию мазков осуществляют в темноте в течение 2 часов и после высушивания дополнительно окрашивают мазки краской Азур - II в водном 0,25% растворе в течение 0,5 - 1 мин, промывают и высушивают их. Фиксацию мазков осуществляют в парах 40% формалина.

Новизна заявленного предложения обусловлена тем, что для приготовления буферной смеси используются соли, обладающие буферными свойствами, с получением определенной рН среды, кроме того, за счет дополнительной окраски ядер клеток в мазках крови можно определить В-лимфоциты, кроме того, заявленное предложение является экспресс-методом для определения неспецифической эстеразы в клетках крови: Т, NK-лимфоцитов. Одновременно в одном препарате можно определить В-клетки по окраске ядра. Применение методики основано на взаимодействии неспецифической эстеразы с α-нафтилацетатом. Эстераза способствует гидролизу α-нафтилацетата с образованием 1-нафтола и уксусной кислоты, которая создает слабокислую среду. Для поддержания рН в пределах 8,0-8,2 в систему вводили буферную смесь, предложенную нами, состоящую из KH₂PO₄ и Na₂HРО₄, что оказывало влияние на активность фермента эстеразы. Затем 1-нафтол взаимодействует с красителем - нейтральным прочным синим В с образованием комплексного соединения азокрасителя. Образовавшийся комплекс (азокраситель) окрашивает эстеразу, содержащуюся внутри Т- и NK-лимфопитов.

Неспецифическая эстераза
Первичная реакция (реакция ферментативного расщепления) гидролиза нафтилацетата с участием фермента эстеразы (см. схему 1 в конце описания).

2) Вторичная реакция (реакция сочетания), т.е. взаимодействия 1-нафтола с нейтральным прочным синим В (см. схему 2).

Пример конкретного осуществления способа определения дифференцировки Т-, В-, NK-лимфоцитов в мазках крови животных и птицы
Взятие крови и приготовление мазка
Кровь для исследования брали у сельскохозяйственных животных, например у коров, из яремной вены, у птицы из крыловой вены. Из крови готовили мазок. Для этого каплю крови наносили на край сухого обезжиренного стекла, которое удерживали между большим и средним пальцами левой руки. Впереди капли под углом 45^o подводили шлифованный край покровного стекла так, чтобы образовавшийся угол между стеклами был равномерно заполнен кровью. Движением правой руки от себя каплю распределяли тонким слоем по поверхности предметного стекла без просветов в виде равномерной полоски, не выходящей за ее края. Мазки сушат на воздухе и фиксируют в парах 40% раствора формалина в течение 5 минут. Для этого на дно эксикатора наливали около 150 мл формалина, оставляли под закрытой крышкой на 30 минут для возгонки паров формалина. Затем осторожно снимали крышку и на решетку эксикатора помещали мазки и закрывали крышкой. Таким образом, мазки фиксируются.

Приготовление буферных растворов
В начале проводили калибровку иономера рН - 150. В состав буферной смеси входили: однозамещенный фосфорно-кислый калий (KH₂РO₄ с молекулярной массой 136,1 г/моль), из которого готовили раствор - А; двузамещенный фосфорно-кислый нaтpий (Nа₂НPО₄ с молекулярной массой 177,9 г/моль), из которого готовили раствор - Б;
Приготовление раствора А
Для приготовления 25 мл раствора А брали 0,34 г или (340 мг) KH₂PO₄ и растворяли в небольшом количестве дистиллированной воды затем в мерной колбе объемом 25 мл доводили до метки.

Приготовление раствора Б
Брали 8,9 г Na₂HРО₄ и растворяли в небольшом количестве дистиллированной воды, затем в мерной колбе объемом 500 мл доводили до метки.

Затем колбы с растворами А и Б оставляли на сутки в темном месте для лучшей диффузии. На следующий день после дополнительного перемешивания смешивали 25 мл раствора А и 475 мл раствора Б, тщательно перемешивали (желательно оставить на сутки) и затем измеряли рН буферного раствора. Очень важно получить рН в пределах от 8,0 до 8,2.

Приготовление инкубационной смеси
Правильное приготовление инкубационной смеси имеет немаловажное значение для дальнейшей окраски мазков. Готовить инкубационную смесь желательно в затемненной комнате. Для ее приготовления готовят раствор 1 и 2.

Приготовление раствора 1
α-Нафтилацетат берут 2,5 мг. Для растворения брали 1,25 мл ацетона, разбавленного таким же количеством дистиллированной воды. Нафтилацетат растворяли, постепенно добавляя ацетон небольшими порциями, помешивая. Затем также постепенно добавляли 6,25 мл дистиллированной воды.

Приготовление раствора 2
Берут 6,25 мг красителя нейтрального прочного синего и растворяют его в 6,25 мл дистиллированной воды, смешивая их постепенно. Для поддержания рН добавляют 1,25 мл буферного раствора с рН 8,0-8,2.

Полученные растворы смешивают, фильтруют в темноте желательно через стеклянный фильтр.

Инкубация мазков.

Инкубация мазков проводится исключительно в темноте в течение 2 часов. На фиксированные формалином мазки наносится равномерным слоем инкубационная смесь. Периодически необходимо добавлять смесь, т.к. происходит испарение жидкости, которая включает в себя легко улетучивающиеся вещества (ацетон, нафтилацетат). После инкубации мазки промывают дистиллированной водой и высушивают на воздухе.

Для дифференцировки лимфоцитов от других клеток крови в дальнейшем окрашиваем ядра клеток краской Азур - II водным 0,25% раствором в течение от 30 секунд до 1 минуты. После окраски краску сливают, промывают дистиллированной водой мазки высушивают на воздухе.

Микроскопия мазков
Микроскопия проводят с использованием эмерсионной системы при увеличении (90 х 15).

Результаты полученных данных при мискроскопии мазков:
Т-лимфоциты содержат одну иди несколько гранул темного цвета, расположенных до периферии клетки.

NK-клетки окрашены диффузно в серый цвет.

В-лимфоциты имеют окрашенные ядра, клетки не содержат гранул (фиг. 1, 2).

Изобретение относится к ветеринарной медицине, обеспечивает повышение эффективности иммунологических исследований за счет исключения потерь лейкоцитов в процессе получения и обработки материала. Изобретение обеспечивает возможность одновременного определения особо важных клеток, участвующих в формировании неспецифической резистентности организма, определение активности неспецифической эстеразы и повышение экономической эффективности. Для приготовления буферной смеси используют однозамещенный фосфорно-кислый калий (КН₂PO₄) и двузамещенный фосфорно-кислый натрий (Na₂HPO₄), затем в инкубационную смесь добавляют буферную смесь, а инкубацию мазков проводят в темноте в течение 2 ч и после высушивания дополнительно окрашивают мазки краской Азур-II. 1 з.п.ф-лы, 2 ил.

1. Способ определения дифференцировки Т-, В-, NK-лимфоцитов в мазках крови животных и птиц, включающий подготовку биологического субстрата, обработку его буферно-инкубационной смесью, содержащей фосфатный буфер, α-нафтилацетат с ацетоном и краситель нейтральный прочный синий, инкубацию биологического субстрата с последующим высушиванием и микрокопированием, отличающийся тем, что в качестве биологического субстрата применяют мазки крови животных и птиц, а для приготовления буферной смеси используют однозамещенный фосфорно-кислый калий (КН₂РO₄) и двузамещенный фосфорно-кислый натрий (Na₂HP0₄), затем в инкубационную смесь добавляют 1,2-1,3 мл буферной смеси для обеспечения рН 8,0-8,2, при этом инкубацию мазков осуществляют в темноте в течение 2 ч, и после высушивания дополнительно окрашивают мазки краской АЗУР-II водным 0,25% раствором в течение 0,5-1 мин, промывают и высушивают их. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что фиксацию мазков осуществляют в парах 40% формалина и при приготовлении инкубационной смеси α-нафтилацетат берут в количестве 2,4-2,6 мг, разбавляют водно-ацетоновой смесью, приготовленной в соотношении 1: 1 и постепенно добавляют в α-нафтилацетат, потом вводят 6,2-6,3 мг красителя нейтрального прочного синего.