СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ В ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ ОРГАНАХ ЖИВОТНОГО Российский патент 2003 года по МПК G01N33/50 C12Q1/42 

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности иммунологии сельскохозяйственных животных и птиц.

Известен способ определения щелочной фосфатазы (см. 3. Лойда "Гистохимия ферментов". М. : Мир, 1982. Одновременное азосочетание по Burstone 1962, с. 64), включающий подготовку тканей, фиксацию, инкубирование ее с последующим окрашиванием и учет результатов.

Наиболее близким является способ определения активности щелочной фосфатазы (см. 3. Лойда "Гистохимия ферментов". М.: Мир, 1982. Одновременное азосочетание по Pearse 1953, с. 63), который предусматривает исследование гистосрезов, путем подготовки тканей, взятие, обработку, фиксацию, промывку и заливку пробы, ее инкубирование в среде, состоящей из буферного раствора, дистиллированной воды, нафтилфосфата и синего прочного В, промывания и дополнительного окрашивания.

Недостатком известного способа является сложность приготовления веронал-ацетатного буфера или трис-НCl, использование дорогостоящих компонентов.

Техническим решением задачи является упрощение процесса исследования и снижения экономических затрат.

Поставленная задача достигается тем, что способ выявления щелочной фосфатазы в иммунокомпетентных органах животных, предусматривает исследование гистосрезов путем подготовки тканей, взятия, обработки, фиксации, промывки пробы, ее инкубирования в среде, состоящей из буферного раствора, дистиллированной воды, нафтилфосфата и красителя нейтрального прочного синего В, промывания дополнительного окрашивания. Осуществляют оценку качественной реакции на щелочную фосфатазу по окраске, для приготовления буферного раствора используют тетраборат натрия Na₂B₄O₇•10H₂O, который берут в соотношении с нафтилфосфатом 1:1.

Новизна заявленного предложения обусловлена тем, что использование тетрабората натрия совместно с нафтилфосфатом обеспечивает эффективную инкубацию гистосрезов за счет создания определенного рН ведущего к активации щелочной фосфатазы.

Пример конкретного осуществления способа определения активности щелочной фосфатазы в иммунокомпетентных органах животного.

Щелочная фосфатаза код фермента (3.1.3.1.) относится ко II группе фермента. Фермент впервые был обнаружен в тех клеточных мембранах, где имеются процессы активного транспорта: в щеточной каемке энтероцитов и клетках проксимальных канальцев почек, в ресничках клеток семявыносящего протока, в эндотелии артериол. Щелочная фосфатаза также обнаружена в эндоплазматическом ретикулуме, аппарате Гольджи, пиноцитозных пузырьках и лизосомах энтероцитов, гранулах нейтрофильных лейкоцитов, в клеточной мембране и пиноцитозных пузырьках гладкомышечных клетках. Способ определения активности щелочной фосфатазы состоит из следующих этапов.

Взятие пробы
После взятия пробы (биопсия, материал от экспериментальных животных) ткань обрабатывают с максимальной быстротой, т.к. активность ферментов может изменяться под воздействием аутолитических процессов. Объем или количество материала определяется задачами исследования, характером подготовки ткани и видом органа при изучении внутриклеточной локализации ферментов. Толщина тканевых кусочков должна быть минимальной; не более 1 см.

Фиксация
Фиксация применяется при исследовании внутриклеточной локализации ферментов (Lojda, 1965). Для фиксации обычно используются альдегиды или их смеси. Применявшаяся прежде фиксация в ацетоне с последующей заливкой в парафин или целлоидин в настоящее время не рекомендуется.

При фиксации в формальдегиде результаты (ферментативная активность, сохранность морфологической структуры) зависят от концентрации, рН, времени фиксации и температуры.

Обычно концентрация формальдегида составляет 4%. Эта концентрация наилучшим образом удовлетворяет требованиям сохранности структуры и ферментативной активности. В более высоких концентрациях фиксатор слишком сильно подавляет активность ферментов, и вызывают артефакты сморщивание, тогда как в более низких он не полностью иммобилизирует фермент и не обеспечивает должной сохранности ткани.

Лучше всего готовить раствор формальдегида 4% на боратном буфере с рН 9-9,2. Интенсивно встряхивают его и фильтруют.

Фиксацию проводят при температуре + 4^oС (в холодильнике); при более высокой температуре фермент инактивируется значительно быстрее.

Время фиксации зависит от вида исследуемого фермента и органа, а также от размера тканевого блока. Для блоков, толщина которых не превышает 5 мм, время фиксации в формальдегиде составляет 12 ч. Более длительная фиксация вызывает сморщивание ткани и существенную инактивацию фермента. В течение первых 10-30 мин ферментативная активность снижается пропорционально увеличению времени фиксации, а затем остается относительно стабильной. Поэтому время фиксации можно увеличить, т.к. инактивация гидролаз не происходит.

Затем извлекают кусочки из фиксатора, "высушивают" их фильтровальной бумагой и переносят в охлажденный боратный буфер (рН=9-9,2).

Промывка и заливка
Для повышения остаточной активности фермента тканевой блок после фиксации следует тщательно промыть. Промывка повышает остаточную активность в два и даже в три раза, что позволяет обнаруживать клетки с низкой ферментативной активностью. Промывку проводят в проточной воде или при +4^oС в дистиллированной воде, боратном буфере (рН=9-9,2).

Время промывки зависит от времени фиксации, так при фиксации 12 ч необходимо промывать такое же время.

Перед заливкой тканевые препараты обезвоживают при +4^oС в течение 30-45 мин в 50%-ном ацетоне, а затем в трех сменах 100%-ного ацетона 3-24 ч. В последней смене ацетона материал оставляют на 1-2 ч при комнатной температуре. Тканевые блоки просветляют в трех сменах (по 10 мин каждая) бензола, толуола или ксилола, промокают фильтровальной бумагой, помещают в парафин на 30-45 мин при 56^oС и переносят в сосуды для заливки с новой сменой парафина.

Приготовление парафиновых срезов
Парафиновый блок (на колодке) укрепляют в объектодержателе микротома, длинник блока располагают параллельно или перпендикулярно к санкам микротома.

Затем укрепляют нож перпендикулярно к длиннику микротома либо косо. Косое положение показано для резки плотных тканей. Блок и нож сближают для соприкосновения, выравнивают поверхность путем срезания толстых срезов, после обнаружения кусочков тканей или органа переходят к срезу необходимой толщины (от 3-5 до 15 мкм).

Полученные срезы при помощи кисточки или препаровальной иглы снимают с бритвы микротома и в чашку с теплой дистиллированной водой. Для наклеивания срез вылавливают из воды на заранее подготовленное предметное стекло. Срезы на стекле оставляют для фиксации на 6-24 ч при комнатной температуре.

Приготовление буферных растворов
В начале проводили калибровку иономера рН - 150. В состав буферной смеси входили: тетраборат натрия Nа₂В₄O₇•10 Н₂О 0,025 М (с молекулярной массой 382), из которого готовили раствор - А, для этого брали 0,953 г и растворяли в дистиллированной воде в объеме на 100 мл; затем готовили раствор - Б, состоящий из 0,1 М НСl (молекулярной массой 36,465).

Затем 50 мл раствора А - тетрабората натрия и раствором Б 0,1М НСl 4,6-5 мл доводили до 100 мл дистиллированной водой рН 9-9,2. Очень важно получить рН в этих пределах, для активации фермента - щелочной фосфатазы.

Приготовление инкубационной смеси.

Раствор А. К 25 мг нафтилфосфата добавляют 25 мл буфер - тетраборат натрия с рН 9,0-9,2. Раствор Б - 50 мг синего прочного В растворяют в 25 мл тетраборатного буфера с рН 9,0-9,2. Фильтруют в темном месте. Растворы А и Б перемешивают. Инкубируем гастосрезы от 30 до 45 мин при температуре 20^oС после окончания инкубации.

Инкубация срезов
Инкубационную среду сливают и срезы ополаскивают в 3-х сменах дистиллированной воды. Затем помещают в 4%-ном формальдегиде для удаления пузырьков газа в срезах. Споласкивают в дистиллированной воде. Затем дополнительно окрашивают ядра прочным красным или нейтральным красным 1% и осуществляют оценку качественной реакции на щелочную фосфатазу по окраске.

Результаты: в зависимости от соли диазония и в некоторой степени от влияния субстрата структура ткани обладают ферментативной активностью, окрашивают в сине-фиолетовый цвет прочным синим В.

Изобретение относится к ветеринарной медицине, касается иммунологии сельскохозяйственных животных и птиц. Способ предусматривает при исследовании гистосрезов для приготовления инкубационной среды использовать тетраборат натрия, который берут при соотношении с нафтилфосфатом 1:1. Изобретение обеспечивает упрощение процесса исследования и снижение экономических затрат.

Способ выявления щелочной фосфатазы в иммунокомпетентных органах животных, предусматривающий исследование гистосрезов путем подготовки ткани, взятия, обработки, фиксации, промывки и заливки пробы, ее инкубирования в среде, состоящей из буферного раствора, дистиллированной воды, нафтилфосфата и нейтрального прочного синего В, промывания, дополнительного окрашивания и осуществления оценки качественной реакции на щелочную фосфатазу по окраске, отличающийся тем, что для приготовления буферного раствора используют тетраборат натрия Na₂B₄O₇•10 H₂O, который берут в соотношении с нафтилфосфатом 1:1.