ШТАММ БАКТЕРИЙ BIFIDOBACTERIUM INFANTIS 37B ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК, РЕГУЛИРУЮЩИХ МИКРОФЛОРУ КИШЕЧНИКА У ДЕТЕЙ РАННЕГО ВОЗРАСТА Российский патент 2003 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 A23L1/29 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к педиатрической практике, в частности может быть использовано при изготовлении биологически активных добавок, а также бактерийных препаратов для нормализации микрофлоры при нарушениях микробиоценоза кишечника у детей раннего возраста.

Известно, что для коррекции дисбиотических изменений желудочно-кишечного тракта применяют существующий в настоящее время биопрепарат "Бифидумбактерин" (Гончарова Г.И., Дьякова Е.И., Семенова Л.П. и др. Новый отечественный препарат "Сухой бифидумбактерин" и его эффективность при кишечных заболеваниях детей и взрослых. // Всероссийский съезд эпидемиологов, микробиологов и инфекционистов: Тезисы докладов. -Казань, 1972. - С.37-38), который включает в себя представителей нормальной микрофлоры кишечника. За рубежом широко используются биологически активные добавки, включающие в себя бифидобактерии, лактобактерии и их комбинации (Elmer G.W., Mс Farland L.W., Surawicz C. M. Biotherapeutic Agents and Infection Diseases. Human Press. 1999. - 316 P.; Fuller R. A review: Probiotics in man and animals. J. Appl. Bacteriol. l989.-66. Р.365-378). Но эти препараты разработаны без учета особенностей видового состава микрофлоры кишечника у детей. Каких-либо препаратов для профилактики и коррекции дисбактериозов у детей раннего возраста, включающих в себя комплекс штаммов микроорганизмов, наиболее типичных для микрофлоры детей, в нашей стране в настоящее время не существует.

Целью изобретения является получение штамма бифидобактерий, обладающего антагонистической активностью in vitro и in vivo, для использования в производстве биологически активных добавок, эффективных для профилактики и коррекции дисбиотических нарушений микрофлоры кишечника у детей раннего возраста.

Эта цель достигнута тем, что из кишечника клинически здорового ребенка первого года жизни был выделен штамм Bifidobacterium infantis 37 В, принадлежащий к виду, характерному для детей данной возрастной группы, обладающий значительной антагонистической активностью по отношению к условно-патогенным микроорганизмам, хорошей кислотообразующей функцией и естественной устойчивостью к ряду антибиотиков.

Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов "ГосНИИГенетика" и характеризуется следующими свойствами.

Культурально-морфологические свойства. При культивировании в жидкой селективной среде Блаурокка в анаэробных условиях образует рыхлый осадок и равномерное помутнение через 24 часа. При культивировании в столбике 0,75% агара Блаурокка образует колонии в виде гречишных зерен или дисков размером до 0,5-1 мм в диаметре в течение 2 суток. На плотной среде Блаурокка образует колонии S-типа, круглые, с ровными краями, гомогенные, непрозрачные, пигмента не образуют, профиль колоний выпуклый, без блеска, легко снимаются петлей с поверхности плотной питательной среды.

В мазках клетки расположены в форме "китайских иероглифов", имеют вид прямых или разветвленных палочек с У-образными раздвоениями на одном или обоих концах, иногда образуют утолщения на концах. Неподвижны, в мазке располагаются беспорядочно. Окрашиваются грамположительно, иногда внутри клеток выявляется зернистость. Спор не образуют.

Физиологические свойства. Облигатный анаэроб, растет в высоком столбике агара в пробирке, в пробирках с жидкой средой и на чашках Петри с плотной средой в анаэробных условиях. При культивировании в жидкой среде в анаэробных условиях через 18-20 часов после посева в 1 мл среды вырастает 1,0•10⁸-5,0•10⁸ живых микробных клеток. Оптимум роста при температуре 37,5^o.

Биохимические признаки. Синтезирует фермент фруктозо-6-фосфатфосфокеталазу. Каталазы не образует. Сбраживает фруктозу, галактозу, глюкозу, лактозу, рибозу, раффинозу, ксилозу, сахарозу, мальтозу, мелибиозу. Не сбраживает арабинозу, целлобиозу, мелезитозу, маннозу, трегалозу, сорбитол, маннитол, инулин, салицин. Желатин не разжижает. Индол не продуцирует, не восстанавливает нитраты.

Кислотообразование при выращивании в среде Блаурокка - 159,4^o (по Тернеру) (таблица 2).

Чувствительность к антибиотикам представлена в таблице 1.

Лабораторная проверка показала непатогенность штамма Bifidobacterium infantis 37 В для экспериментальных животных (мышей), а также для людей (в опытах на добровольцах).

Использование штамма иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Изучение антагонистической активности штамма Bifidobacterium infantis 37 В in vitro.

Определение антагонистической активности проводилось по отношению к условно-патогенным микроорганизмам: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Clostridium perfringens. В качестве питательной среды для роста бифидобактерий использовали Бактофок-агар (Гидробиоз, Москва), для индикаторных микроорганизмов - полужидкий (0,75%) Brain Heart Infusion агар (BBL, США).

При изучении антагонистической активности штамма Bifidobacterium infantis 37 В на чашки с выросшими колониями бифидобактерий наносили 3,5 мл 0,75% ВHI-агара, в который предварительно вносили 0,1 мл суточной культуры индикаторного штамма.

После 18-часовой инкубации при 37^oС в анаэробных условиях для клостридий и в аэробных условиях для остальных индикаторных микроорганизмов измерялись радиусы зон задержки роста индикаторных штаммов вокруг колоний бифидобактерий.

Результаты эксперимента показали, что Bifidobacterium infantis 37 В подавляет рост Escherichia coli (радиус зоны задержки роста равен 12,4 мм), Klebsiella pneumoniae (16,0 мм), Staphylococcus aureus (13,3 мм), Streptococcus faecalis (6,7 мм), Clostridium perfringens (10,9 мм) (см. табл.3).

Штамм Bifidobacterium infantis 37 В активно ингибирует рост условно-патогенных микроорганизмов in vitro.

Пример 2. Изучение непатогенности, апирогенности и антагонистической активности штамма Bifidobacterium infantis 37 В в кишечнике добровольцев.

Штамм Bifidobacterium infantis 37 В получал доброволец 20 лет в течение 10 дней в дозе 1,0•10⁹ клеток в сутки. Производили оценку общего состояния, температуры утром и вечером в течение всего периода приема суспензии микроорганизмов. Кроме того, провели бактериологическое исследование содержимого толстой кишки перед началом и на второй день после окончания приема взвеси бифидобактерий.

Другой доброволец 27 лет для контроля получал препарат "Бифидумбактерин". У него также было проведено бактериологическое исследование микрофлоры толстой кишки перед началом и на вторые сутки после окончания приема препарата.

В течение всего периода наблюдений штамм Bifidobacterium infantis 37 В не вызывал никаких побочных действий, жалоб обследуемый не предъявлял, температура тела оставалась нормальной, сон и аппетит не нарушались, диспептических расстройств не было.

Анализ данных бактериологического исследования выявил позитивные сдвиги в количественном составе микроорганизмов, присутствующих в кишечнике добровольца. Отмечалось повышение уровня бифидобактерий с 2,0•10⁶ колониеобразующих единиц на грамм кишечного содержимого (КОЕ/г) до 1,0•10⁸ КОЕ/г и лактобактерий с 3,0•10⁶ КОЕ/г до 1,5•10⁷ КОЕ/г, а также снижение уровня энтерококков с 2,9•10⁸ КОЕ/г до 4,9•10⁷ КОЕ/г, стафилококков с 1,0•10⁴ КОЕ/г до 2,3•10³ КОЕ/г, дрожжеподобных грибов рода Candida с 2,3•10⁴ КОЕ/г до 1,1•10³ КОЕ/г.

У добровольца, принимавшего препарат "Бифидумбактерин", отмечалось повышение уровня бифидобактерий с 7,7•10⁹ КОЕ/г до 1,1•10¹⁰ КОЕ/г. Но при этом уровень условно-патогенных микроорганизмов существенно не менялся.

Штамм Bifidobacterium infantis 37 В является непатогенным и апирогенным для человека и обладает антагонистической активностью по отношению к условно-патогенным микроорганизмам не только in vitro, но и in vivo.

Пример 3. Изучение влияния штамма Bifidobacterium infantis 37 В на микрофлору кишечника ребенка.

Штамм Bifidobacterium infantis 37 В получал ребенок 3 лет в течение 10 дней в дозе 1,0•10⁹ клеток в сутки. Проводили бактериологическое исследование содержимого толстой кишки перед началом и на второй день после окончания приема взвеси бифидобактерий.

Другой ребенок для контроля получал препарат "Бифидумбактерин". У него также было проведено бактериологическое исследование микрофлоры толстой кишки перед началом и на вторые сутки после окончания приема препарата.

Анализ данных бактериологического исследования выявил позитивные сдвиги в количественном составе микроорганизмов, присутствующих в кишечнике ребенка, принимавшего штамм Bifidobacterium infantis 37 В. Отмечалось повышение уровня бифидобактерий с 5,1•10⁹ колониеобразующих единиц на грамм исследуемого материала (КОЕ/г) до 9,9•10¹⁰ КОЕ/г и лактобактерий с 7,9•10⁷ до 3,6•10⁸ КОЕ/г.

У добровольца, принимавшего препарат "Бифидумбактерин", отмечалось повышение уровня бифидобактерий с 2,6•10⁹ КОЕ/г до 1,1•10¹⁰ КОЕ/г. При этом уровень лактобактерий существенно не менялся.

Несмотря на кажущуюся простоту, восстановление микрофлоры кишечника у детей раннего возраста представляет собой сложную микробиологическую и педиатрическую проблему. Выделение из кишечника клинически здорового ребенка первого года жизни перспективного для производства штамма бифидобактерий, наиболее характерного в отличие от уже известных штаммов для микрофлоры кишечника детей данной возрастной группы, и изучение его свойств является плодом длительной исследовательской работы. В результате этого впервые получен штамм Bifidobacterium infantis 37 В, обладающий высокой антагонистической активностью по отношению к условно-патогенным микроорганизмам, значительной кислотообразующей функцией и устойчивостью к ряду антибиотиков. Штамм проверен на непатогенность и апирогенность для животных и человека.

Все эти свойства дают возможность использовать штамм Bifidobacterium infantis 37 В для производства биологически активных добавок для регуляции микрофлоры желудочно-кишечного тракта у детей раннего возраста.

Штамм Bifidobacterium infantis 37 В полностью готов к использованию.

Изобретение относится к биотехнологии, медицинской микробиологии и может быть использовано для применения в качестве биологически активных добавок для коррекции нарушений микробиоценоза желудочно-кишечного тракта у детей. Штамм Bifidobacterium infantis 37 В (ВКПМ Ас-1636) выделен из кишечника здорового ребенка первого года жизни, способен активно ингибировать условно-патогенные микроорганизмы, является хорошим кислотообразователем, обладает естественной устойчивостью к ряду антибиотиков. Непатогенен и апирогенен для людей и животных, нормализует микрофлору желудочно-кишечного тракта у детей. Штамм готов к применению в педиатрической практике в качестве биологически активных добавок. 3 табл.

Штамм бактерий Bifidobacterium infantis ВКПМ Ас-1636 для приготовления биологически активных добавок, регулирующих микрофлору кишечника у детей раннего возраста.