ШТАММ БАКТЕРИЙ BIFIDOBACTERIUM BREVE P2 ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ БАКТЕРИЙНЫХ ПРЕПАРАТОВ, НОРМАЛИЗУЮЩИХ МИКРОФЛОРУ ПРИ НАРУШЕНИЯХ МИКРОБИОЦЕНОЗА ВЛАГАЛИЩА Российский патент 2000 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 

Настоящее изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к акушерско-гинекологической практике, в частности может быть использовано при изготовлении лечебных препаратов для нормализации микрофлоры при нарушениях микробиоценоза влагалища.

Известно, что исследования в области нормализации нарушений микробиоценоза влагалища сконцентрированы прежде всего на разработке препаратов-пробиотиков на основе лактобацилл. Эти бактерии являются главной, но не единственной составляющей индигенной "протективной" микрофлоры урогенитального тракта, чем, вероятно, объясняется недостаточный клинический эффект от применения монопрепаратов лактобацилл (Baerheim A. et al. Vaginal application in the prophylaxis reccurent lower urinary tract in women. Scandinavian Journal of Primary Health Care. 1994. vol. 12. p. 239-243).

Известно также, что коммерчески доступные бактерийные препараты, используемые для коррекции микрофлоры влагалища, не отвечают требованиям, предъявляемым к эффективному препарату-пробиотику (Viki L. Hughes et al. Microbiologic Characteristics of Lactobacillus Products Used for Colonization of the Vagina. Obstetrics and Gynecology. 1990. vol. 75. p. 244-248), или требуют назначения длительных (до 1 года) курсов лечения для обеспечения клинического эффекта (Hilton Е. et al. Annals of Internal Medicine. American College of Physicians. 1992. 116: 353-357).

Известны также попытки некоторых отечественных исследователей использовать для санации полости влагалища у беременных и гинекологических больных коммерческие препараты. Очевидным недостатком промышленно выпускаемых препаратов, содержащих кишечные штаммы бифидобактерий, является их низкая адгезивность к эпителиоцитам влагалища, тогда как наличие данной способности рассматривается как необходимое условие для приживления бактерий в данной экологической нише (Reid G. et. al. Implantation of Lactobaccillus casei var rhamnosus into vagina. Lancet. 1994. p. 1229).

Данные о разработке и применении препаратов-пробиотиков на основе индигенных бифидобактерий влагалища при лечении неспецифических бактериальных вагинозов в доступной нам литературе отсутствуют.

Целью изобретения является получение штамма бифидобактерий, используемого в производстве бактерийного препарата для нормализации нарушений микробиоценоза влагалища.

Эта цель достигнута тем, что из влагалища здоровой женщины репродуктивного возраста был выделен штамм Bifidobacterium breve P2, обладающий повышенной адгезивной активностью по отношению к влагалищным эпителиоцитам, значительной антагонистической активностью и кислотообразующей функцией, естественной устойчивостью к ряду антибиотиков.

Штамм депонирован в Центральном музее промышленных микроорганизмов института "ВНИИ генетика" под номером Ас-1570 и характеризуется следующими свойствами.

Культурально-морфологические свойства.

При культивировании в столбике 0,75%-ного агара Блаурокка образует колонии в виде гречишных зерен или дисков размером до 0,5 - 1 мм в диаметре в течение 2 суток. При культивировании в жидкой среде Блаурокк в анаэробных условиях образует рыхлый осадок и равномерное помутнение через 24 часа. На плотной среде Блаурокк в анаэробных условиях растет в виде колоний S-типа, круглые с ровными краями, диаметром 2 - 3 мм, непрозрачные, блестящие, пигмента не образуют; профиль колоний выпуклый, легко снимаются петлей с поверхности плотной среды.

В мазках клетки расположены в форме "китайских иероглифов", имеют вид прямых или разветвленных палочек с У-образными раздвоениями на одном или обоих концах, иногда образуют утолщения на концах. Неподвижны, в мазке располагаются беспорядочно. Грамположительны, иногда внутри клеток выявляется зернистость. Спор не образуют.

Физиологические свойства.

Облигатный анаэроб; растет в высоком столбике агара в пробирке, в пробирках с жидкой средой и на чашках Петри с плотной средой в анаэробных условиях. При культивировании в жидкой среде в анаэробных условиях через 18-20 часов после посева в 1 мл среды вырастает 1,0 • 10⁸ - 5,0 • 10⁸ живых микробных клеток. Максимум роста при 37,5^oC.

Биохимические признаки.

Синтезирует фермент фруктозо-6-фосфатфосфокеталазу.

Сбраживает глюкозу, манитол, лактозу, сахарозу, мальтозу, салицин, манозу, рафинозу, сорбитол. Гидролиз эскулина.

Не сбраживает ксилозу, арабинозу, глицерол, целобиозу, мелизитозу, рамнозу, трегалозу.

Не образует индол и каталазу, не восстанавливают нитраты. Не разжижает желатин.

Кислотообразование при выращивании в среде Блаурокк через 72 часа - 66,9^o (по Тернеру).

Чувствительность к антибиотикам представлена в таблице 1.

Лабораторная проверка показала непатогенность штамма Bifidobacterium breve P2 для экспериментальных животных (мышей), а также для людей (в опытах на добровольцах).

Использование штамма иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Изучение адгезивной способности Bifidobacterium breve P2 на эпителиоцитах влагалища здоровых женщин.

Получали вагинальный эпителий от трех здоровых женщин, центрифугировали его при 420 g 10 мин, осадок ресуспензировали в McIvaine's буфере (pH 5,4), на основе 0,1 Н C₆H₈O₇ и 0,2 Н NaH₂PO₄, и вновь центрифугировали. Центрифугирование повторяли пять раз. Затем готовили суспензию эпителиоцитов с концентрацией 1,0 • 10⁵ клеток/мл.

16-Часовую культуру бифидобактерий центрифугировали два раза при 1700 g 10 минут в том же буфере, что и эпителиоциты. Готовили взвесь бактерий в концентрации 1,0 • 10⁸ м.т./мл. Суспензии бифидобактерий и эпителиоцитов смешивали в равных объемах (по 0,5 мл) в пробирках. Смесь инкубировали при +37^oC 2 часа (при постоянном легком горизонтальном помешивании). Затем смесь бифидобактерий и эпителиоцитов центрифугировали при 420 g 5 мин пять раз. Осадок ресуспензировали в 1 мл буфера, на предметном стекле готовили мазок, высушивали на воздухе, фиксировали в метаноле 15 мин и окрашивали по Граму. После чего подсчитывали общее количество бифидобактерий, прикрепившихся на поверхности 100 эпителиоцитов. В качестве контроля использовали штамм B. bifidum 791, выделенный из фекалий здорового взрослого человека и использующийся для приготовления препарата "Кисломолочный бифидумбактерин".

Адгезивная активность бифидобактерий оценивалась по среднему числу бактерий, прикрепившихся к одному эпителиоциту.

Установлено, что количество бифидобактерий штамма Bifidobacterium breve P2, адгезировавшихся на 1 эпителиоцит, составило 27,3 ± 1,2, а количество бифидобактерий штамма B.bifidum 791 кишечного происхождения - 2,6 ± 0,2 (см. табл. 2).

Таким образом, штамм Bifidobacterium breve Р2 обладает более высокой адгезивной способностью к вагинальным эпителиоцитам с возможностью более длительного и стойкого приживления в генитальном тракте женщины, чем штамм кишечного происхождения.

Пример 2. Изучение антагонистической активности штамма Bifidobacterium breve P2 in vitro.

Для определения антагонистической активности Bifidobacterium breve P2 по отношению к Escherichia coli, Klebsiella ozaenae, Staphylococcus aureus. Streptococcus faecalis использовали метод Muriana and Klaenhammer. В качестве питательной среды для роста бифидобактерий использовали Бактофок-агар (Гидробиоз, Москва) (1,5%), для индикаторных микроорганизмов - полужидкий (0,75%) Brain Heart Infusion агар (BBL, США).

При изучении антагонистической активности штаммов бифидобактерий к Pseudomonas aeruginosa на первом этапе на чашки с выросшими колониями бифидобактерий наносили 3,5 мл 1,5% агара, на основе среды Brain Heart Infusion. После застывания этого промежуточного слоя на его поверхность наносили 0,1 мл 12-часовой культуры индикаторного штамма из разведения 10^-1 и растирали на поверхности агара.

После 18-часовой инкубации в аэробных условиях при 37^oC измерялись радиусы зон задержки роста индикаторных штаммов вокруг колоний бифидобактерий.

Результаты эксперимента по изучению антагонистической активности in vitro показали, что Bifidobacterium breve P2 активно подавляет рост Escherichia coli (радиус зоны задержки роста равен 4,3 ± 0,1 мм), Klebsiella ozaenae (9,6 ± 0,2 мм). Staphylococcus aureus (3,9 ± 0,1 мм), Streptococcus faecalis (2,7 ± 0,1 мм) и Pseudomonas aeruginosa (3,2 ± 0,2 мм) (см. табл. 3).

Таким образом, штамм Bifidobacterium breve P2 активно ингибирует рост условно-патогенных микроорганизмов in vitro.

Пример 3. Изучение влияния штамма Bifidobacterium breve P2 на микрофлору генитального тракта женщины.

Лиофильно высушенный штамм Bifidobacterium breve P2 вводился на тампоне per vaginum женщине А., 27 лет, в течение 10 дней в дозе 10⁸ (перед применением лиофилизат разводился в 5 мл остуженной кипяченой воды). Бактериологическое исследование влагалищного отделяемого осуществлялось до и после применения микроорганизмов.

Анализ данных бактериологического исследования выявил увеличение уровня лактобацилл (с < 10² м.т./г до 4,0 • 10² м.т./г) и бифидобактерий (с < 10² м. т./г до 2,0 • 10² м.т./г). Одновременно отмечалось уменьшение уровня Bacteroides spp. (с 2,8 • 10⁸ м.т./г до 1,56 • 10⁷ м.т./г), гемолизинпродуцирующих Streptococcus spp. с 1,4 • 10³ м.т./г до < 10² м.т./г и гемолизинпродуцирующих Staphylococcus aureus с 2,36 • 10⁴ м.т./г до < 10² м.т./г.

Таким образом, применение штамма Bifidobacterium breve P2, выделенного из влагалища здоровой женщины репродуктивного возраста, вызывает позитивные изменения вагинальной микрофлоры in vivo, проявляющиеся повышением уровня бифидобактерий и одних из основных представителей микрофлоры генитального тракта - лактобацилл, и снижением уровня условно-патогенных микроорганизмов, что обеспечивает выраженную коррекцию дисбиотических нарушений вагинальной микрофлоры и восстановление доминирующего положения молочнокислых бактерий.

Несмотря на кажущуюся простоту, восстановление микрофлоры вагинального тракта за счет использования препаратов-пробиотиков представляет собой сложную микробиологическую и гинекологическую проблему. Выделение из влагалища здоровой женщины перспективного для производства штамма бифидобактерий и изучение его свойств является плодом длительной исследовательской работы, в результате которой впервые получен штамм Bifidobacterium breve P2, обладающий высокой адгезивной способностью к вагинальным эпителиоцитам, естественной резистентностью к ряду антимикробных препаратов, антагонистической активностью по отношению к условно-патогенным микроорганизмам не только in vitro, но и in vivo. Все эти свойства дают возможность использовать штамм Bifidobacterium breve P2 в качестве препарата-пробиотика в клинике для профилактики и лечения нарушений микрофлоры женского генитального тракта.

Штамм Bifidobacterium breve P2 полностью готов к использованию.

Изобретение относится к биотехнологии, медицинской микробиологии и может быть использовано для применения в качестве препарата-пробиотика для коррекции нарушений микробиоценоза генитального тракта женщин. Штамм выделен из влагалища здоровой женщины репродуктивного возраста, способен активно ингибировать условно-патогенные микроорганизмы in vitro и in vivo, является кислотообразователем и обладает выраженной адгезивностью к вагинальным эпителиоцитам. Штамм Bifidobacterium breve Р2 депонирован в ЦМПМ института "ВНИИгенетика" под Ас-1570. Непатогенен и апирогенен для людей и животных, нормализует микрофлору генитального тракта женщин. Штамм готов к применению в акушерско-гинекологической практике в качестве препарата-пробиотика. Обеспечивает выраженную коррекцию дисбиотических нарушений вагинальной микрофлоры, активно ингибирует рост условно-патогенных микроорганизмов in vitro. 3 табл.

Штамм бактерий Bifidobacterium breve P2 (Центральный музей промышленных микроорганизмов института "ВНИИ генетика" Ас-1570), используемый для приготовления бактерийных препаратов, нормализующих микрофлору при нарушениях микробиоценоза влагалища.