ШТАММ БАКТЕРИЙ LACTOBACILLUS RHAMNOSUS 12L ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК, РЕГУЛИРУЮЩИХ МИКРОФЛОРУ КИШЕЧНИКА У ДЕТЕЙ РАННЕГО ВОЗРАСТА Российский патент 2003 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 A23L1/29 

Настоящее изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к педиатрической практике, в частности может быть использовано при изготовлении биологически активных добавок для регуляции микрофлоры при нарушениях микробиоценоза кишечника у детей раннего возраста.

Проблема коррекции микрофлоры кишечника у детей раннего возраста является очень актуальной в педиатрии. Одним из решений этой проблемы может служить использование биологически активных добавок, включающих в себя бифидобактерии, лактобактерии и их комбинации (Elmer G.W., Me Farland L.W., Surawicz C.M. Biotherapeutic Agents and Infection Diseases. Human Press. 1999. - 316 P.; Fuller R. A review: Probiotics in man and animals. J. Appl. Bacteriol. l989. - 66. P. 365-378).

Традиционно для коррекции дисбиотических изменений желудочно-кишечного тракта применяют существующий в настоящее время биопрепарат "Лактобактерин" (Тарасова Н.Б., Соколова К.Я. Новый препарат лактобактерин для профилактики и лечения дисбактериозов кишечника. // Всесоюзный съезд эпидемиологов, микробиологов и инфекционистов, 11-й: Тезисы докладов. - Тбилиси, 1970. - 40 с. ), который включает в себя представителей нормальной микрофлоры кишечника. Однако штамм микроорганизмов, входящий в состав этого препарата, выделен от взрослых людей и поэтому данный препарат является недостаточно эффективным для профилактики и коррекции дисбактериозов у детей раннего возраста. Каких-либо препаратов, специально разработанных для коррекции микрофлоры у детей раннего возраста, в настоящее время в нашей стране не существует.

Целью изобретения является получение штамма лактобактерий, используемого в производстве биологически активных добавок для регуляции микрофлоры кишечника у детей раннего возраста.

Эта цель достигнута тем, что из кишечника клинически здорового ребенка первого года жизни был выделен штамм Lactobacillus rhamnosus 12L, относящийся к виду, характерному для детей данной возрастной группы, обладающий антагонистической активностью по отношению к условно-патогенным микроорганизмам, хорошей кислотообразующей функцией и естественной устойчивостью к ряду антибиотиков. Штамм оказывает положительное влияние на микрофлору кишечника ребенка.

Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов "ГосНИИГенетика" и характеризуется следующими свойствами.

Культурально-морфологические свойства. При культивировании в жидкой селективной среде MRS (бульон Мана, Рогоза и Шарпа) образует рыхлый осадок и равномерное помутнение через 24 ч. На плотной среде MRS образует колонии S-типа, круглые, с ровными краями, гомогенные, непрозрачные, пигмента не образуют, профиль колоний выпуклый, блестящие, легко снимаются петлей с поверхности плотной питательной среды.

В мазках клетки имеют вид коротких прямых палочек, расположенных параллельно. Окрашиваются грамположительно. Спор не образуют.

Физиологические свойства. Микроаэрофил, рост на твердых питательных средах обычно усиливается в анаэробиозе или при пониженном давлении кислорода. Оптимум роста при температуре 37,5^oC. Хорошо растет при температуре 45^oC. Оптимум рН 6,2-6,4.

Биохимические признаки. Каталазы не образует. Сбраживает целлобиозу, фруктозу, галактозу, глюкозу, лактозу, маннозу, мелезитозу, рамнозу, рибозу, трегалозу, маннитол, сорбитол, салицин. Не сбраживает арабинозу, ксилозу, мальтозу, мелибиозу, раффинозу, сахарозу, амигдалин, адонитол, дульцитол, инозитол, инулин. Желатин не разжижает. Индол не продуцирует.

Кислотообразование при выращивании в среде MRS-250,5 (по Тернеру).

Чувствительность к антибиотикам представлена в табл. 1.

Лабораторная проверка показала непатогенность штамма Lactobacillus rhamnosus 12L для экспериментальных животных (мышей), а также для людей (в опытах на добровольцах).

Использование штамма иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Изучение антагонистической активности штамма Lactobacillus rhamnosus 12L in vitro.

Определение антагонистической активности проводилось по отношению к условно-патогенным микроорганизмам: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Clostridium perfringens. В качестве питательной среды для роста лактобактерий использовали MRS-arap (HiMedia, Индия), для индикаторных микроорганизмов - полужидкий (0,75%) Brain Heart Infusion агар (BBL, США).

При изучении антагонистической активности штамма Lactobacillus rhamnosus 12L на чашки с выросшими колониями лактобактерий наносили 3,5 мл 0,75% BHI-агара, в который предварительно вносили 0,1 мл суточной культуры индикаторного штамма.

После 18-часовой инкубации при 37^oС в анаэробных условиях для клостридий и в аэробных условиях для остальных индикаторных микроорганизмов измерялись радиусы зон задержки роста индикаторных штаммов вокруг колоний лактобактерий.

Результаты эксперимента показали, что Lactobacillus rhamnosus 12L подавляет рост Escherichia coli (радиус зоны задержки роста равен 16,3 мм), Klebsiella pneumoniae (16,6 мм), Staphylococcus aureus (16,4 мм), Streptococcus faecalis (10,7 мм), Clostridium perfringens (10,5 мм) (см. табл. 2).

Штамм Lactobacillus rhamnosus 12L активно ингибирует рост условно-патогенных микроорганизмов in vitro.

Пример 2. Изучение непатогенности, апирогенности и антагонистической активности штамма Lactobacillus rhamnosus 12L в кишечнике добровольцев.

Штамм Lactobacillus rhamnosus 12L получал доброволец 25 лет в течение 10 дней в дозе 1,0•10⁹ клеток в сутки. Производили оценку общего состояния, температуры утром и вечером в течение всего периода приема суспензии микроорганизмов. Кроме того, провели бактериологическое исследование содержимого толстой кишки перед началом и на второй день после окончания приема взвеси лактобактерий.

Другой доброволец 24 лет для контроля получал препарат "Лактобактерин". У него также было проведено бактериологическое исследование микрофлоры толстой кишки перед началом и на вторые сутки после окончания приема препарата.

В течение всего периода наблюдений штамм Lactobacillus rhamnosus 12L не вызывал никаких побочных действий, жалоб обследуемый не предъявлял, температура тела оставалась нормальной, сон и аппетит не нарушались, диспептических расстройств не было.

Анализ данных бактериологического исследования выявил позитивные сдвиги в количественном составе микроорганизмов, присутствующих в кишечнике добровольца. Отмечалось повышение уровня бифидобактерий с 7,4•10⁹ колониеобразующих единиц на грамм исследуемого материала (КОЕ/г) до 3,3•10¹⁰ КОЕ/г и лактобактерий с 1,6•10⁵ КОЕ/г до 7,7•10⁷ КОЕ/г, а также снижение уровня H₂S(-) клостридий с 3,0•10⁹ КОЕ/г до <10⁸ КОЕ/г, энтерококков с 8,1•10⁸ КОЕ/г до 3,0•10⁶ КОЕ/г, стафилококков с 2,4•10⁴ КОЕ/г до 1,5•10³ КОЕ/г, дрожжеподобных грибов рода Candida с 2,3•10⁴ КОЕ/г до 1,1•10³ КОЕ/г.

У добровольца, принимавшего препарат "Лактобактерин", отмечалось повышение уровня лактобактерий с 3,0•10⁶ КОЕ/г до 1,5•10⁷ КОЕ/г. Но при этом уровень условно-патогенных микроорганизмов существенно не менялся.

Штамм Lactobacillus rhamnosus 12L является непатогенным и апирогенным для человека и обладает антагонистической активностью по отношению к условно-патогенным микроорганизмам не только in vitro, но и in vivo.

Пример 3. Изучение влияния штамма Lactobacillus rhamnosus 12L на микрофлору кишечника ребенка.

Штамм Lactobacillus rhamnosus 12L получал ребенок 3 лет в течение 10 дней в дозе 1,0•10⁹ клеток в сутки. Проводили бактериологическое исследование содержимого толстой кишки перед началом и на второй день после окончания приема взвеси лактобактерий.

Другой ребенок для контроля получал препарат "Лактобактерин". У него также было проведено бактериологическое исследование микрофлоры толстой кишки перед началом и на вторые сутки после окончания приема препарата.

Анализ данных бактериологического исследования выявил позитивные сдвиги в количественном составе микроорганизмов, присутствующих в кишечнике ребенка, принимавшего штамм Lactobacillus rhanmosus 12L. Отмечалось повышение уровня бифидобактерий с 3,1•10⁹ колониеобразующих единиц на грамм исследуемого материала (КОЕ/г) до 9,2•10¹⁰ КОЕ/г и лактобактерий с 1,0•10⁴ до 2,6•10⁶ КОЕ/г.

У добровольца, принимавшего препарат "Лактобактерин", отмечалось повышение уровня лактобактерий с <10⁴ КОЕ/г до 2,4•10⁵ КОЕ/г. При этом уровень бифидобактерий существенно не менялся.

Несмотря на кажущуюся простоту, восстановление микрофлоры кишечника у детей раннего возраста за счет использования биологически активных добавок представляет собой сложную микробиологическую и педиатрическую проблему. Выделение из кишечника клинически здорового ребенка первого года жизни перспективного для производства штамма лактобактерий, характерного в отличие от уже известных штаммов для микрофлоры кишечника детей данной возрастной группы, и изучение его свойств является плодом длительной исследовательской работы. В результате этого впервые получен штамм Lactobacillus rhanmosus 12L, обладающий значительной антагонистической активностью по отношению к условно-патогенным микроорганизмам и высокой кислотообразующей функцией.

Все эти свойства дают возможность использовать штамм Lactobacillus rhanmosus 12L в качестве биологически активных добавок для регуляции микрофлоры желудочно-кишечного тракта у детей раннего возраста.

Штамм Lactobacillus rhamnosus 12L полностью готов к использованию.

Изобретение относится к биотехнологии, медицинской микробиологии и может быть использовано для применения в качестве биологически активных добавок для коррекции нарушений микробиоценоза желудочно-кишечного тракта у детей. Штамм L. rhamnosus 12L (ВКПМ В-8238) выделен из кишечника здорового ребенка первого года жизни, способен активно ингибировать условно-патогенные микроорганизмы, является хорошим кислотообразователем, обладает устойчивостью к ряду антибиотиков. Непатогенен и апирогенен для людей и животных, нормализует микрофлору желудочно-кишечного тракта у детей. Штамм готов к применению в педиатрической практике в качестве биологически активных добавок. 2 табл.

Штамм бактерий Lactobacillus rhamnosus ВКПМ В-8238 для приготовления биологически активных добавок, регулирующих микрофлору кишечника у детей раннего возраста.