ШТАММ БАКТЕРИЙ Lactobacillus acidophilus 27L ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК, РЕГУЛИРУЮЩИХ МИКРОФЛОРУ КИШЕЧНИКА У ДЕТЕЙ РАННЕГО ВОЗРАСТА Российский патент 2003 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 A23L1/29 

Настоящее изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к педиатрической практике, в частности может быть использовано при изготовлении биологически активных добавок для нормализации микрофлоры при нарушениях микробиоценоза кишечника у детей раннего возраста.

Использование биологически активных добавок, включающих в себя бифидобактерии, лактобактерии и их комбинации может служить одним из способов коррекции микрофлоры кишечника (Elmer G.W., Mс Farland L.W., Surawicz C.M. Biotherapeutic Agents and Infection Diseases. Human Press. - 1999. - 316 p.). Однако комплексных препаратов, созданных с учетом особенностей видового состава бифидофлоры и лактофлоры детей, в настоящее время не имеется.

В нашей стране традиционно для коррекции дисбиотических изменений желудочно-кишечного тракта применяют существующий биопрепарат "Лактобактерин" (Тарасова Н.Б., Соколова К.Я. Новый препарат лактобактерин для профилактики и лечения дисбактериозов кишечника.// Всесоюзный съезд эпидемиологов, микробиологов и инфекционистов, 11-й: Тезисы докладов. -Тбилиси. - 1970. - 40 с. ), который включает в себя лиофилизированные штаммы бактерий-представителей нормальной микрофлоры кишечника (Ефимов Б.А., Коршунов В.М., Кафарская Л.И., Тарабрина Н.П., Гладько И.А. Диагностика профилактика и лечение дисбактериозов кишечника. Методические рекомендации. - М.: МЗ РФ. - 1991. - С.9). Но эти штаммы микроорганизмов выделены от взрослых людей и поэтому недостаточно эффективны для регуляции микрофлоры у детей раннего возраста. Комплексных препаратов, включающих в себя штаммы микроорганизмов, наиболее характерные для детей этой возрастной группы, в настоящее время в России не имеется.

Целью изобретения является получение штамма лактобактерий, наиболее типичного для микрофлоры кишечника детей раннего возраста, используемого в производстве биологически активных добавок для регуляции дисбиотических нарушений.

Эта цель достигнута тем, что из кишечника клинически здорового ребенка первого года жизни был выделен штамм Lactobacillus acidophilus 27L, относящийся к виду, наиболее характерному для детей данной возрастной группы, обладающий значительной кислотообразующей функцией, хорошей антагонистической активностью по отношению к условно-патогенным микроорганизмам и естественной устойчивостью к ряду антибиотиков.

Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов "ГосНИИГенетика" и характеризуется следующими свойствами.

Культурально-морфологические свойства. При культивировании в жидкой селективной среде MRS (бульон Мана, Рогоза и Шарпа) образует рыхлый осадок и равномерное помутнение через 24 часа. На плотной среде MRS образует круглые колонии с неровными краями, гомогенные, непрозрачные, пигмента не образуют, профиль колоний плоский, без блеска, легко снимаются петлей с поверхности плотной питательной среды.

В мазках клетки имеют вид коротких и длинных прямых палочек, расположенных параллельно, образующих цепочки. Окрашиваются грамположительно. Неподвижны, спор не образуют.

Физиологические свойства. Микроаэрофил, рост на твердых питательных средах обычно усиливается в анаэробиозе или при пониженном давлении кислорода. Оптимум роста при температуре 37,5^o. Хорошо растет при температуре 45^oС. Оптимум рН 6,2-6,4.

Биохимические признаки. Каталазы не образует. Сбраживает целлобиозу, фруктозу, галактозу, глюкозу, лактозу, маннозу, сахарозу, трегалозу, рибозу, раффинозу, мальтозу, салицин. Не сбраживает арабинозу, мелезитозу, мелибиозу, рамнозу, ксилозу, сорбитол, маннитол, адонитол, дульцитол, инозитол, инулин. Желатин не разжижает. Индол не продуцирует.

Кислотообразование при выращивании в среде MRS - 256,4^o (по Тернеру).

Лабораторная проверка показала непатогенность штамма Lactobacillus acidophilus 27L для экспериментальных животных (мышей), а также для людей (в опытах на добровольцах).

Чувствительность к антибиотикам представлена в таблице 1.

Антагонистическая активность по отношению к условно-патогенным микроорганизмам представлена в таблице 2.

Использование штамма иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Изучение кислотообразующей активности штамма Lactobacillus acidophilus 27L.

Активность кислотообразования определяли титрометрическим методом. С этой целью по 1 мл 1-миллиардной взвеси суточной культуры лактобактерий вносили в пробирки с 9 мл жидкой среды МРС и культивировали при 37,5^oС в анаэростатах, продутых газовой смесью. Через 48-72-168 часов от начала культивирования вынимали по две пробирки, из которых отбирали по 5 мл культуральной жидкости и титровали ее 0,1 н. раствором щелочи. Количество щелочи, пошедшей на титрование, соответствует количеству образуемой 0,1 н. кислоты в 5 мл культуральной жидкости. Окончательный результат выражали в градусах Тернера: Т^o=А•К•20, где А - количество 0,1 н. щелочи, пошедшее на титрование 5 мл исследуемой жидкости, К - поправка к титру, определяемая при титровании 0,1 н. раствора щелочи 0,1 н. янтарной кислотой, Т^o - величина, выражающая количество 0,1 н. щелочи, пошедшей на титрование 100 мл исследуемого образца.

В результате проведенных исследований установлено, что к 48 часам происходило значительное закисление культуральной жидкости (кислотность составила 174,7^oТ). В последующие часы наблюдалось более медленное нарастание до максимума к 168 часам (кислотность составила 256,4^oТ).

Штамм лактобактерий Lactobacillus acidophilus 27L обладает высокой кислотообразующей активностью.

Пример 2. Изучение непатогенности, апирогенности и антагонистической активности штамма Lactobacillus acidophilus 27L в кишечнике добровольцев.

Штамм Lactobacillus acidophilus 27L получал доброволец 27 лет в течение 10 дней в дозе 1,0•10⁹ клеток в сутки. Производили оценку общего состояния, температуры утром и вечером в течение всего периода приема суспензии микроорганизмов. Кроме того, провели бактериологическое исследование содержимого толстой кишки перед началом и на второй день после окончания приема взвеси лактобактерий.

Другой доброволец 24 лет для контроля получал препарат "Лактобактерин". У него также было проведено бактериологическое исследование микрофлоры толстой кишки перед началом и на вторые сутки после окончания приема препарата.

В течение всего периода наблюдений штамм Lactobacillus acidophilus 27L не вызывал никаких побочных действий, жалоб обследуемый не предъявлял, температура тела оставалась нормальной, сон и аппетит не нарушались, диспептических расстройств не было.

Анализ данных бактериологического исследования выявил позитивные сдвиги в количественном составе микроорганизмов, присутствующих в кишечнике добровольца. Отмечалось повышение уровня бифидобактерий с 2,4•10⁸ колониеобразующих единиц на грамм исследуемого материала (КОЕ/г) до 9,3•10⁹ КОЕ/г и лактобактерий с <10⁴ до 6,0•10⁶ КОЕ/г, а также снижение уровня энтерококков с 1,1•10⁶ КОЕ/г до 5,0•10⁴ КОЕ/г и стафилококков с 1,0•10⁴ КОЕ/г до 2,2•10³ КОЕ/г.

У добровольца, принимавшего препарат "Лактобактерин", отмечалось повышение уровня лактобактерий с 3,0•10⁶ КОЕ/г до 1,5•10⁷ КОЕ/г. Но при этом уровень условно-патогенных микроорганизмов существенно не менялся.

Штамм Lactobacillus acidophilus 27L является непатогенным и апирогенным для человека и обладает антагонистической активностью по отношению к условно-патогенным микроорганизмам не только in vitro, но и in vivo.

Пример 3. Изучение влияния штамма Lactobacillus acidophilus 27L на микрофлору кишечника ребенка.

Штамм Lactobacillus acidophilus 27L получал ребенок 3 лет в течение 10 дней в дозе 1,0•10⁹ клеток в сутки. Проводили бактериологическое исследование содержимого толстой кишки перед началом и на второй день после окончания приема взвеси лактобактерий.

Другой ребенок для контроля получал препарат "Лактобактерин". У него также было проведено бактериологическое исследование микрофлоры толстой кишки перед началом и на вторые сутки после окончания приема препарата.

Анализ данных бактериологического исследования выявил позитивные сдвиги в количественном составе микроорганизмов, присутствующих в кишечнике ребенка, принимавшего штамм Lactobacillus acidophilus 27L. Отмечалось повышение уровня бифидобактерий с 9,5•10⁹ колониеобразующих единиц на грамм исследуемого материала (КОЕ/г) до 8,1•10¹⁰ КОЕ/г и лактобактерий с 5,2•10⁵ КОЕ/г до 1,3•10⁷ КОЕ/г.

У добровольца, принимавшего препарат "Лактобактерин", отмечалось повышение уровня лактобактерий с <10⁴ КОЕ/г до 2,4•10⁵ КОЕ/г. При этом уровень бифидобактерий существенно не менялся.

Несмотря на кажущуюся простоту, восстановление микрофлоры кишечника у детей раннего возраста за счет использования биологически активных добавок представляет собой сложную микробиологическую и педиатрическую проблему. Выделение из кишечника клинически здорового ребенка первого года жизни перспективного для производства штамма лактобактерий, наиболее характерного в отличие от уже известных штаммов для микрофлоры кишечника детей данной возрастной группы, и изучение его свойств является плодом длительной исследовательской работы. В результате этого впервые получен штамм Lactobacillus acidophilus 27L, обладающий значительной кислотообразующей функцией, высокой антагонистической активностью по отношению к условно-патогенным микроорганизмам и естественной устойчивостью к ряду антибиотиков.

Все эти свойства дают возможность использовать штамм Lactobacillus acidophilus 27L в качестве биологически активных добавок для регуляции микрофлоры желудочно-кишечного тракта у детей раннего возраста.

Штамм Lactobacillus acidophilus 27L полностью готов к использованию.

Изобретение относится к биотехнологии, медицинской микробиологии и может быть использовано для применения в качестве биологически активных добавок для коррекции нарушений микробиоценоза желудочно-кишечного тракта у детей. Штамм Lactobacillus acidophilus 27L выделен из кишечника здорового ребенка первого года жизни, является хорошим кислотообразователем, способен ингибировать условно-патогенные микроорганизмы, обладает устойчивостью к ряду антибиотиков. Непатогенен и апирогенен для людей и животных, нормализует микрофлору желудочно-кишечного тракта у детей. Депонирован в ВКПМ под В-8237. Штамм готов к применению в педиатрической практике в качестве биологически активных добавок. 2 табл.

Штамм бактерий Lactobacillus acidophilus ВКПМ В-8237 для приготовления биологически активных добавок, регулирующих микрофлору кишечника у детей раннего возраста.