СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХИРАЛЬНОГО АМИНА Российский патент 2003 года по МПК C12P13/00 C12P13/04 C12P41/00 

Изобретение относится к усовершенствованиям ферментативного синтеза хиральных соединений, содержащих аминогруппу, например,хиральных аминов.

В патентах США 4950606, 5169780, 5300437 и 5360724, раскрытие информации о которых включено в данный текст для сведения, описано энантиомерное обогащение хиральных аминов с помощью использования трансаминазы аминокислоты. Трансаминазы аминокислот являются известными зависимыми от пиридоксальфосфата ферментами, найденными в различных микроорганизмах, включая Pseudomonas, Escherichia, Bacillus, Saccharomyces, Hansenula, Candida, Streptomyces, Aspergillus и Neurospora. Две трансаминазы аминокислот ЕС 2.6.1.18 и ЕС 2.6.1.19 кристаллизованы и охарактеризованы авторами Yonaha et al., Agric. Biol. Chem., 47(10), 2257-2265 (1983).

В патентах США 4950606, 5169780 и 5300437 описывается, что индивидуальные штаммы организмов, содержащих трансаминазу, могут быть выделены с помощью культивирования в хемостате, т.е. культивирования в постоянном, но ограниченном химическом окружении, с акцептором аминогруппы и амином в качестве единственного источника азота. Типичный штамм, выделенный таким образом в вышеуказанных патентах, охарактеризован (в Американской коллекции типов культур) как Bacullis megaterium. Обычно трансаминазы омега-аминокислот метаболизируют аминокислоты, в которых аминогруппа находится на концевом, ахиральном (нехиральном) углеродном атоме, и амин, используемый в качестве источника азота в подобной хемостатной культуре, может быть того же самого типа, а именно ахиральным амином, таким как н-октиламин, циклогексиламин, 1,4-бутандиамин, 1,6-гександиамин, 6-аминогексановая кислота, 4-аминомасляная кислота, тирамин и бензиламин. В тех патентах также сообщается, однако, что амин, используемый в качестве источника азота в таких хемостатных культурах, может быть хиральным амином, таким как 2-аминобутан, α-фенэтиламин и 2-амино-4-фенилбутан. Могут использоваться хиральные аминокислоты, такие как L-лизин, L-орнитин, β-аланин и таурин.

Помимо энантиомерного обогащения в патентах США 4950606, 5169780 и 5300437 описан стереоселективный синтез одной хиральной формы амина с помощью действия трансаминазы аминокислоты на кетон формулы R¹COR², в которой R¹ и R² являются различными алкильными или арильными группами, в присутствии донора аминогруппы. Описанные доноры аминогруппы подобны аминам, используемым в качестве источника азота в хемостатных культурах; например, ахиральным аминам, в которых аминогруппа находится на концевом углеродном атоме, таким как пропиламин и бензиламин, хиральным аминам, в которых аминогруппа находится на концевом углеродном атоме, таким как (S)-2-аминобутан, и хиральным аминокислотам, таким как L-аланин и L-аспарагиновая кислота.

Настоящее изобретение основано на обнаружении того, что ахиральный амин 2-аминопропан неожиданно является лучшим в качестве донора амина в таком трансаминазном синтезе аминов по сравнению с ахиральными аминами, в которых аминогруппа находится на концевом углеродном атоме, или хиральными аминами, в которых аминогруппа находится на неконцевом углеродном атоме. Таким образом, изобретение представляет собой усовершенствование известного стереоселективного синтеза хирального амина, в процессе которого кетон приводится в контакт с трансаминазой в присутствии донора аминогруппы, с использованием в качестве донора аминогруппы 2-аминопропана.

Термин "хиральный амин" применяется здесь в самом широком смысле. Как описано в вышеперечисленным патентах, известный стереоспецифический синтез может применяться для получения широкого разнообразия алифатических и алициклических соединений различных и смешанных функциональных типов, характеризующихся только присутствием первичной аминогруппы, связанной со вторичным углеродным атомом, который помимо атома водорода, несет либо (i) двухвалентную группу, образующую хиральную циклическую структуру, либо (ii) два заместителя (отличных от водорода), отличающихся друг от друга по структуре или хиральности.

Двухвалентные группы, образующие хиральную циклическую структуру, включают, например, 2-метилбутан-1,4-диил, пентан-1,4-диил, гексан-1,4-диил, гексан-1,5-диил, 2-метилпентан-1,5-диил. Таким образом, настоящее усовершенствование, состоящее в использовании 2-аминопропана в качестве донора амина, может использоваться в стереоспецифическом синтезе 1-амино-2-метилциклопентана из 2-метилциклопентанона, 1-амино-3-метилциклопентана из 3-метилциклопентанона, 1-амино-2-метилциклогексана из 2-метилциклогексанона и т. д.

Два различных заместителя у вторичного углеродного атома (R¹ и R², приведенные выше) также могут варьировать в широких пределах и включают алкил, аралкил, арил, галоген, гидрокси, низший алкил, низший алкокси, низший алкилтио, циклоалкил, карбокси, карбалкокси, карбамоил, моно- и ди-(низший алкил)замещенный карбамоил, трифторметил, фенил, нитро, амино, моно- и ди-(низший алкил)замещенный амино, алкилсульфонил, арилсульфонил, алкилкарбоксамидо, арилкарбоксамидо и т.д., а также алкил, аралкил или арил, замещенный вышеприведенными заместителями.

Таким образом, настоящее усовершенствование, заключающееся в использовании 2-аминопропана в качестве донора амина, может применяться в стереоспецифическом синтезе 2-аминобутана из бутанона, 2-амино-1-бутанола из 1-гидроксибутан-2-она, аланина из пировиноградной кислоты, 1-амино-1-фенилэтана из ацетофенона, 1-амино-1-(2-метокси-5-фторфенил)этана из 2-метокси-5-фторацетофенона, γ-аминовалериановой кислоты из левулиновой кислоты, 1-амино-1-фенилпропана из 1-фенилпропан-1-она, 1-амино-1-(4-бромфенил)пропана из 1-(4-бромфенил)пропан-1-она, 1-амино-1-(4-нитрофенил)пропана из 1-(4-нитрофенил)пропан-1-она, 1-фенил-2-аминопропана из 1-фенилпропан-2-она, валина из 2-оксо-3-метилмасляной кислоты, 1-(3-трифторметилфенил)-2-аминопропана из 1-(3-трифторметилфенил)пропан-1-она, 2-аминопропанола из гидроксипропанона, 1-метокси-2-аминопропана из метоксиоксипропанона, 1-амино-1-фенилбутана из 1-фенилбутан-1-она, 1-фенил-2-аминобутана из 1-фенилбутан-2-она, 1-(2,5-диметокси-4-метилфенил)-2-аминобутана из 1-(2,5-диметокси-4-метилфенил)бутан-2-она, 1-(4-гидроксифенил)-3-аминобутана из 1-(4-гидроксифенил)бутан-3-она, 1-амино-1-(2-нафтил)этана из 2-ацетилнафталина, фенилаланина из фенилпировиноградной кислоты, глутаминовой кислоты из 2-кетоглутаровой кислоты, аспарагиновой кислоты из 2-кетоянтарной кислоты и т.д.

В противоположность донорам амина, сообщаемым в предшествующем уровне техники, и действительно большинству ами-ноалкановых доноров аминогрупп, которые являются теоретически доступными, 2-аминопропан обладает относительно уникальным сочетанием, а именно: (i) является ахиральным и (ii) имеет аминогруппу на неконцевом алифатическом углеродном атоме. Таким образом, несмотря на использование трансаминазы омега-аминокислоты, которая по природе действует на аминогруппу в концевом или ω-положении аминокислоты, было найдено, что использование в качестве донора аминогруппы соединения, имеющего аминогруппу на неконцевом алифатическом углеродном атоме, дает термодинамическое преимущество. Не желая привязываться к какой-либо теории, считаем, что это усовершенствование является следствием побочного продукта ферментативной реакции, в данном случае являющегося кетоном, в противоположность использованию донора амина, имеющего аминогруппу на концевом углеродном атоме, такого как этиламин, н-пропиламин, н-октиламин, 1,4-бутандиамин, 1,6-гександиамин, 6-аминогексановая кислота, 4-аминомасляная кислота, тирамин или бензиламин, который образует альдегид при реакции в присутствии трансаминазы аминокислоты. В реакциях, в которых образуются аминокислоты из кетокислот, термодинамическое преимущество использования изопропиламина в качестве донора аминогруппы приводит в результате к константе равновесия, равной приблизительно 1000. Поскольку данное термодинамическое преимущество является следствием химической окружающей среды реагирующей карбонильной группы, это в равной степени применимо и к синтезу всех хиральных α-аминокислот из их кетокислот, природных или неприродных.

Несмотря на данное термодинамическое преимущество, присутствие аминогруппы на концевом алифатическом углеродном атоме приводит в основном к хиральности в сравнении с замещением на концевом углеродном атоме, который, обязательно имея два водородных атома, предотвращает хиральность. Поскольку трансаминаза является стереоселективной, использование хирального донора амина означает, что только половина такого амина является доступной в качестве донора. С промышленной точки зрения это является неприемлемым для донора аминогруппы.

К сожалению, огромное большинство амино(низших)алканов, удовлетворяющих первому требованию наличия аминогруппы на неконцевом углеродном атоме, являются сами по себе хиральными. Таким образом, ограничивая внимание аминоалканами, имеющими не более 8 углеродных атомов, определили, что теоретически существует, по крайней мере, 130 возможных гомологических и изомерных аминов, в которых аминогруппа не находится на тризамещенном углеродном атоме (чтобы быть донором аминогруппы, соединение должно также нести, по крайней мере, один доступный атом водорода на углеродном атоме, к которому присоединяется аминогруппа). Из этих 130 возможных доноров аминогруппы менее половины (54) имеют аминогруппу на неконцевом углеродном атоме и из них 93% (50) являются хиральными. Только 4 из алкиламинов, имеющих аминогруппу на неконцевом углеродном атоме, являются ахиральными и из них 3 являются непригодными с точки зрения стоимости и доступности и, кроме того, неподходящими в качестве доноров аминогруппы: 3-аминопентан, 2,2-диметил-3-аминопентан и 4-аминогептан. Таким образом, из всех амино(низших)алканов, теоретически подходящих в качестве донора аминогруппы, только 2-аминопропан (i) имеет аминогруппу на концевом углеродном атоме и, таким образом, является термодинамически более благоприятным среди аминоалканов, в которых аминогруппа находится на концевом углеродном атоме, (ii) является ахиральным так, чтобы быть полностью доступным для реакции и (iii) является приемлемым с точки зрения стоимости и доступности. В качестве дальнейшего преимущества, 2-аминопропан также дает побочный продукт, ацетон, который может легко выделяться и сам по себе является статьей торговли.

Ферментативное превращение может проводиться с помощью обычных приемов культивирования с изолированными, но нерастущими клетками или с препаратом растворимой трансаминазы аминокислоты. Трансаминаза аминокислоты может быть в свободной форме или в виде свободного от клеток экстракта или препарата целых клеток или может быть иммобилизованной на подходящей подложке или подходящей матрице, такой как поперечно-сшитый декстран или агароза, кремнезем, полиамид или целлюлоза. Она также может быть инкапсулированной в полиакриламиде, альгинатах, волокнах или аналогичных. Способы такой иммобилизации описаны в литературе (см., например, Methods of Enzymology, 44, 1976).

Хотя это и не является необходимым, обычно целесообразно добавлять источник пиридоксамина, такой как пиридоксальфосфат.

ПРИМЕР 1.

Изобретение может быть проиллюстрировано примером получения (S)-1-метокси-2-аминопропана, промежуточного соединения для синтеза сельскохозяйственных химических веществ, в котором метоксиацетон вводится в контакт с трансаминазой в присутствии 2-аминопропана в качестве донора амина, дают возможность реакции продолжаться до тех пор, пока существенное количество метоксиацетона не превратится в (S)-1-метокси-2-аминопропан (и 2-аминопропан одновременно превращается в ацетон), и образовавшийся таким образом (S)-1-метокси-2-аминопропан выделяют. Общее превращение с помощью фермента может быть представлено следующим образом

Пять миллимолей первичного кислого фосфата натрия и 250 мл концентрированной соляной кислоты добавлялось к 1000 мл воды. Смесь охлаждалась до 5-10^oС в бане со льдом и добавлялось 258 мл 2-аминопропана с последующим добавлением 206 мл метоксиацетона (98%). Данную смесь перемешивали и рН доводили до 7,5 либо с помощью гидроокиси натрия, либо соляной кислоты по необходимости. Смесь переносили в 3-литровый круглодонный реактор с регулируемой температурой и аппаратом для перемешивания. После того как температура смеси становилась стабильной 30±1^oС, добавляли 0,2 мМ пиридоксаль-5'-фосфата. При необходимости рН доводили снова до 7,5 и добавляли небольшое количество воды, чтобы довести объем смеси до 1800 мл.

Отдельно приготовляли раствор фермента. К 200 мл 5 мМ раствора фосфата натрия (рН 7,5), 0,2 мМ пиридоксаль-5'-фосфата и добавляли 2 г (сухой вес) клеток Bacillus, содержащих (S)-трансаминазу. Когда клетки полностью суспендировались, ферментный раствор добавляли к реакционной смеси, описанной выше.

Конечная реакционная среда содержала 1,5 М 2-аминопропа-2 на и 1,0 М метоксиацетона. Реакция протекала в течение 8 часов при 30±1^oС и рН 7,5, после чего (S)-1-метокси-2-аминопропан присутствовал в реакционной смеси, имел концентрацию 0,6 М и чистоту выше 99%.

Реакцию прекращали добавлением 5 мл концентрированной соляной кислоты с последующей флеш-перегонкой для удаления непрореагировавшего метоксиацетона и побочного продукта, ацетона, в единственной фракции. Впоследствии может проводиться разделительная колоночная перегонка этого дистиллята для разделения метоксиацетона и ацетона. К реакционной смеси добавляли 270 мл 50%-ного водного раствора гидроокиси натрия для депротонирования аминов. Затем амины удаляли из смеси путем перегонки в виде единственной фракции и (S)-1-метокси-2-аминопропан отделяли от остаточного 2-аминопропана путем разделительной перегонки, получая 125 г (S)-1-метокси-2-аминопропана, содержащего 50% воды. Анализ с помощью газовой хроматографии показал, что продукт был более чем на 99% химически и энантиомерно чистым.

ПРИМЕР 2.

Далее изобретение можно проиллюстрировать примером синтеза L-аланина, полезной аминокислоты, в котором пировиноградную кислоту вводят в контакт с трансаминазой в присутствии 2-аминопропана в качестве донора аминогруппы, давая реакции продолжаться до тех пор, пока существенное количество пировиноградной кислоты не превратиться в L-аланин и одновременно 2-аминопропан не превратится в ацетон. Общее превращение с помощью фермента может быть изображено следующим образом

Пируват натрия (50 мМ, 165 г) и хлоргидрат изопропиламина (50 мМ, 0,23 мл 6,5 молярного раствора) растворяли в 29,0 мл 50 мМ первичного кислого фосфата натрия и рН доводили до 7,5. Добавляли пиридоксальфосфат (1,0 мМ, 8,0 мг) с последующим добавлением 8 мг клеток E.coli, содержащих (S)-трансаминазу, и, таким образом, конечный объем достигал 30 мл и конечный показатель рН был 7,5. После инкубации при 30^oС в течение 24 часов измеряли концентрации изопропиламина, ацетона и L-аланина с помощью ВЭЖХ и газовой хроматографии, и по данным определения концентрация L-аланина была 45,6 мМ, что эквивалентно K_eq для вышеприведенной реакции свыше 100.

Когда аналогичную реакцию выполняли, используя клетки E.coli (0,3 г), содержащие (R)-трансаминазу, превращение происходило до D-аланина с концентрацией 46 мМ.

ПРИМЕР 3. Синтез L-аланина
В отдельном примере синтеза L-аланина пируват натрия (1 М, 110,0 г) и хлоргидрат изопропиламина (1 М, 153 мл 6,5 молярного раствора) растворяли в 800 мл 50 мМ буфера на основе первичного кислого фосфата натрия, и рН доводили до 7,5. Затем добавляли пиридоксальфосфат (1 мМ, 265 мг) с последующим добавлением 5 г клеток E.coli, содержащих (S)-трансаминазу, так, чтобы конечный объем был 1 л и конечное значение рН было 7,5. После инкубации при 30^oС в течение 24 часов определяли концентрации изопропиламина и L-аланина с помощью ВЭЖХ и концентрацию ацетона определяли с помощью газовой хроматографии. Концентрация полученного L-аланина составляла 970 мМ, что эквивалентно константе равновесия для реакции приблизительно 1000.

ПРИМЕР 4. Синтез L-2-аминомасляной кислоты
Натриевую соль кетомасляной кислоты (50 мМ, 186 мг) и изопропиламин (50 мМ, 0,23 мл 6,5 молярного раствора) растворяли в 29 мл 50 мМ буфера на основе первичного кислого фосфата натрия, и рН доводили до 7,5. Добавляли пиридоксальфосфат (1 мМ, 8,0 мг) с последующим добавлением 100 мг клеток E.coli, содержащих (S)-трансаминазу, так, чтобы конечный объем достигал 30 мл и конечное значение рН было 7,5. После инкубации при 30^oС в течение 24 часов определяли концентрации изопропиламина и L-2-аминомасляной кислоты с помощью ВЭЖХ и концентрацию ацетона - с помощью газовой хроматографии. Было определено, что концентрация полученной L-аминомасляной кислоты была 48 мМ, что эквивалентно константе равновесия для реакции свыше 500.

ПРИМЕР 5. Синтез дополнительных аминокислот
Следуя в основном описанным в примере 4 процедурам, осуществляли синтез L-глутамата, L-метионина и L-норвалина из натриевых солей соответствующих кетокислот: 2-кетоглутаровой кислоты (50 мМ, 252 мг), 4-метилтио-2-оксомасляной кислоты (50 мМ, 255 мг) и 2-кетовалериановой кислоты (50 мМ, 207 мг) соответственно. Во всех случаях (S)-трансаминаза давала исключительно L-изомер аминокислоты при концентрациях 45, 47 и 46 мМ соответственно.

Способ предусматривает применение 2-аминопропана в качестве донора аминогруппы в стереоселективном синтезе хирального амина из кетона с помощью трансаминазы, в частности (S)-1-метокси-2-аминопропан получают путем контактирования метоксиацетона с трансаминазой в присутствии 2-аминопропана, реакцию проводят до тех пор, пока существенное количество метоксиацетона не превратится в (S)-1-метокси-2-аминопропан и 2-аминопропан не превратится в ацетон. Затем выделяют (S)-1-метокси-2-аминопропан. Способ обеспечивает снижение энерго- и трудозатрат и повышение выхода хирального амина. 2 с. и 1 з. п.ф-лы.

1. Способ получения хирального амина, согласно которому кетон вводят в контакт с трансаминазой в присутствии донора аминогруппы, отличающийся тем, что в качестве донора аминогруппы используют 2-аминопропан. 2. Способ по п. 1, в котором хиральным амином является хиральная аминокислота. 3. Способ получения (S)-1-метокси-2-аминопропана, который включает введение метоксиацетона в контакт с трансаминазой в присутствии 2-аминопропана в качестве донора аминогруппы до тех пор, пока существенное количество метоксиацетона не превратится в (S)-1-метокси-2-аминопропан и 2-аминопропан не превратится в ацетон, и выделение (S)-1-метокси-2-аминопропана.