ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КИЛЛЕРНЫХ ДРОЖЖЕЙ Saccharomyces cerevisiae (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2003 года по МПК C12N1/18 C12N1/18 C12R1/865 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для промышленного получения биомассы киллерных дрожжей на питательных средах из недорогого и доступного сырья.

Биомасса киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae используется в микробиологической и фармацевтической промышленности для выделения двуспиральной РНК (дсРНК), которая является основным биологически активным компонентом для отечественного противовирусного иммуностимулирующего препарата "Ридостин" [1].

Стандартные питательные среды для выращивания дрожжей и микроорганизмов содержат источники углеводного и азотного питания, а также минеральные соли. При этом, как правило, источники азотного питания являются дорогостоящими и дефицитньми, часто из пищевого сырья (пептон, гидролизат казеина, гидролизат кильки, и т.д.) [2, 3, 4].

В состав питательной среды для культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae в качестве источника азота предлагается вводить жидкий гидролизат кормовых дрожжей - один из наиболее доступных органических источников аминного азота [5]. Однако в настоящее время предприятия по выпуску кормовых дрожжей работают нестабильно, кроме того, сами кормовые дрожжи не стандартизованы.

Известно использование в качестве дешевого источника азотного питания для культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae минеральных веществ, в частности сернокислого аммония [7, 8 - прототип]. Однако для выращивания штамма киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae необходимо присутствие органического источника азотного питания, поскольку генетически полученные штаммы-киллеры нуждаются в присутствии факторов роста - ряда аминокислот.

Технической задачей изобретения является удешевление питательной среды, содержащей органический источник азотного питания, и снижение себестоимости биомассы киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae при сохранении ее хорошего качества.

Поставленная задача решается путем введения в состав питательной среды для культивирования киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae в качестве источника азотного питания гидролизата или автолизата пекарских дрожжей, а также отходов производства препарата "Ридостин" - дезинтегрированной биомассы киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-448.

Пекарские дрожжи в данном случае представляют собой наиболее дешевое и стандартизованное органическое сырье для получения гидролизата и автолизата, которые, в свою очередь, и являются дешевым, доступным и хорошего качества органическим источником аминного азота для культивирования киллерных дрожжей.

Гидролизат пекарских дрожжей готовят из расчета 30 кг прессованных или 10 кг сушеных пекарских дрожжей на 1 м³ готовой питательной среды. Дрожжи разводят водопроводной водой, нагревают до 100^oС и кипятят в течение часа, затем охлаждают и осадок отделяют центрифугированием. Полученный гидролизат содержит не менее 50 мг% аминного азота.

Питательная среда на основе гидролизата из пекарских дрожжей (рН - 5,0±0,1) содержит, г/л:
Меласса - 50
Дрожжевой гидролизат - 0,5 л
Аммоний фосфорнокислый двузамещенный - 2,3
Аммоний сернокислый - 1,2
Калий хлористый - 1,7
Вода водопроводная - До 1 л
При этом 1 кг прессованных дрожжей стоит 10 руб., а 1 кг сушеных дрожжей - 28 руб., что примерно в 40 раз дешевле, чем 1 кг пептона.

Культивирование штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-448 проводят в 8 м³ ферментере с объемом среды 4 м³ в периодическом режиме при постоянном перемешивании и аэрации 300 м³/час. Выход биомассы составляет 10 г/л. Содержание дсРНК составляет 80-90 мг/кг биомассы, что удовлетворяет нормам и регламенту (технологии) получения препарата "Ридостин".

Автолизат пекарских дрожжей готовят из расчета 5 кг сушеных дрожжей на 1 м^э готовой питательной среды. Дрожжи разводят водопроводной водой из расчета 4 л воды на 1 кг сушеных пекарских дрожжей, добавляют 25 кг повареной соли на 1 кг дрожжей, выдерживают при температуре 55^oС в течение 18-20 часов, нагревают до 100^oС и выдерживают 1 час; суспензию охлаждают и осадок отделяют центрифугированием. Полученный автолизат содержит 700-1000 мг% аминного азота, что обеспечивает 120-140 мг% последнего в готовой питательной среде.

Питательная среда на основе автолизата пекарских дрожжей (рН 5,0±0,1) содержит, г/л:
Меласса - 50
Автолизат пекарских дрожжей - 0,003 л
Аммоний фосфорнокислый двузамещенный - 2,3
Аммоний сернокислый - 1,2
Калий хлористый - 1,7
Вода водопроводная - До 1 л
Выход биомассы киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae при стандартных условиях культивирования на описанной питательной среде составляет около 10 г/л, что позволяет получить дсРНК в количестве 90-120 мг на кг биомассы.

Отходы производства препарата "Ридостин" представляют собой депротеинизированную суспензию биомассы киллерных дрожжей, из которой извлечены нуклеиновые кислоты, но сохранившую остатки клеточных стенок, аминокислоты, полисахариды клеточных стенок и другие ростовые вещества. 60 кг такого рода отходов используют для приготовления 1 м³ питательной среды, которая в готовом виде содержит не менее 120-150 мг% аминного азота. Для этого указанное выше количество отходов растворяют в полукубе водопроводной воды, перемешивают в течение 20-30 мин, центрифугируют и супернатант используют для приготовления питательной среды.

Питательная среда на основе отходов производства препарата "Ридостин" (рН 5,0±0,1) содержит, г/л:
Меласса - 50
Гидролизат отходов производства препарата "Ридостин" - 0,5 л
Аммоний фосфорнокислый двузамещенный - 2,3
Аммоний сернокислый - 1,2
Калий хлористый - 1,7
Вода водопроводная - До 1 л
Выход биомассы киллерных дрожжей при культивировании в тех же условиях на предложенной питательной среде составляет 10 г/л, а выход дсРНК по-прежнему достаточно высок - 90-100 мг/кг биомассы.

Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его осуществления.

Пример 1. Приготовление питательной среды для культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae на основе гидролизата пекарских дрожжей.

Гидролизат пекарских дрожжей готовят из расчета 30 кг прессованных или 10 кг сушеных дрожжей на 1 м³ готовой питательной среды. Дрожжи разводят водопроводной водой, нагревают до 100^oС и кипятят в течение часа, затем охлаждают и осадок отделяют центрифугированием. В ферментер объемом 4 м заливают 2 м водопроводной воды, затем загружают 2 м полученного ранее гидролизата, 200 кг мелассы и навески солей - 6,8 кг хлористого калия, 4,8 кг сернокислого аммония и 9,2 кг фосфорнокислого двузамещенного аммония. Всю массу перемешивают, стерилизуют нагреванием до 130^oС и выдерживают в течение 40 мин.

Культивирование штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-448 (на 1 л приготовленной среды вносят 100 мл культуры дрожжей с оптической плотностью 0,5-0,6 при λ 550 нм) проводят в 8 м³ ферментере с объемом среды 4 м³ в периодическом режиме при постоянном перемешивании и аэрации 300 м³/час. Выход биомассы составляет 10 г/л. Содержание дсРНК составляет 80-90 мг/кг биомассы, что удовлетворяет нормам и регламенту (технологии) получения препарата "Ридостин".

Пример 2. Приготовление питательной среды для культивирования киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae на основе автолизата пекарских дрожжей.

Автолизат пекарских дрожжей готовят из расчета 5 кг сушеных дрожжей на 1 м³ готовой питательной среды. Дрожжи разводят водопроводной водой из расчета 4 л воды на 1 кг сушеных пекарских дрожжей, добавляют 25 кг повареной соли на 1 кг дрожжей, выдерживают при температуре 55^oС в течение 18-20 часов, нагревают до 100^oС и выдерживают 1 час; суспензию охлаждают и осадок отделяют центрифугированием. В ферментер объемом 1,7 м³ заливают водопроводную воду и 6 л полученного автолизата, загружают 85 кг мелассы и навески солей - 2,89 кг хлористого калия, 2,04 кг сернокислого аммония и 3,91 кг фосфорнокислого двузамещенного аммония. Всю массу перемешивают, доводят объем воды до 1,7 м³, стерилизуют в аппарате нагреванием до 130^oС и выдерживают в течение 40 мин.

Выход биомассы киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae при стандартных условиях культивирования на описанной питательной среде составляет около 10 г/л, что позволяет получить дсРНК в количестве 90-120 мг на кг биомассы.

Пример 3. Приготовление питательной среды для культивирования киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae на основе отходов производства препарата "Ридостин".

Депротеинизированную суспензию биомассы киллерных дрожжей в количестве 90 г (расчет проведен для культивирования дрожжей в ферментере объемом 3 л) разводят и перемешивают в 500 мл водопроводной воды в течение 20-30 мин, далее центрифугируют и 500 мл супернатанта используют для приготовления питательной среды. В ферментер заливают 2 л воды, вносят 150 г мелассы, 500 мл супернатанта и навески солей - 5,1 г, хлористого калия, 3,6 г сернокислого аммония и 6,9 г фосфорнокислого двузамещенного аммония. Всю массу перемешивают, доводят объем воды до 3 л, стерилизуют в аппарате нагреванием до 130^oС и выдерживают в течение 40 мин.

Выход биомассы киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae при стандартных условиях культивирования на описанной питательной среде составляет около 10 г/л, что позволяет получить дсРНК в количестве 90-100 мг на кг биомассы.

Как видно из приведенных данных предлагаемые среды для культивирования киллерных дрожжей, содержащие в качестве источников азотного питания гидролизат пекарских дрожжей, автолизат пекарских дрожжей или отходы производства препарата "Ридостин", позволяют получать выход дрожжевой биомассы не ниже, чем на существующей регламентной среде. Выход дсРНК (биологически активная субстанция для препаратов-индукторов интерферона) также не ниже, а в двух последних примерах и выше, чем при использовании среды с пептоном в качестве источника азотного питания.

Источники информации
1. Патент РФ 2083221, кл. А 61 К 38/29, 1993.

2. Семенов С.М. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов. - Справочник. М., 1990.

3. Захаров И.А., Кожин С.А., Кожина Т.Н., Федорова И.В. Сборник методик по генетике дрожжей сахаромицетов. Л.: Наука, 1984.

4. Новиковская С.С., Шишацкий Ю.И. Производство хлебопекарных дрожжей - Справочник. М.: Агропромиздат, 1990.

5. Авторское свидетельство СССР 1310425, кл. С 12 N 1/16, 1983.

6. Авторское свидетельство СССР 1730140, кл. С 12 N 1/18,1990.

7. Авторское свидетельство СССР 952956, кл. С 12 N 1/16,1980.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для промышленного получения биомассы киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae на питательных средах из недорогого и доступного сырья. Предлагаемые питательные среды для культивирования киллерных дрожжей содержат в качестве источника азотного питания гидролизат пекарских дрожжей, автолизат пекарских дрожжей или отходы производства препарата "Ридостин". Изобретение позволяет снизить себестоимость биомассы киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae, удешевить используемые питательные среды и сохранить хорошее качество биомассы дрожжей. 3 с.п.ф-лы.

1. Питательная среда для культивирования киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae, содержащая источник углеводного питания, источник азотного питания и минеральные соли, отличающаяся тем, что в качестве источника азотного питания она содержит гидролизат прессованных или сушеных пекарских дрожжей при следующем соотношении компонентов, г/л:
Меласса - 50
Гидролизат пекарских дрожжей - 0,5 л
Аммоний фосфорнокислый двузамещенный - 2,3
Аммоний сернокислый - 1,2
Калий хлористый - 1,7
Вода водопроводная - До 1 л
рН5,0±0,1. 2. Питательная среда для культивирования киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae, содержащая источник углеродного питания, источник азотного питания и минеральные соли, отличающаяся тем, что в качестве источника азотного питания она содержит автолизат пекарских дрожжей при следующем соотношении компонентов, г/л:
Меласса - 50
Автолизат пекарских дрожжей - 0,325 л
Аммоний фосфорнокислый двузамещенный - 2,3
Аммоний сернокислый - 1,2
Калий хлористый - 1,7
Вода водопроводная - До 1 л
рН 5,0±0,1. 3. Питательная среда для культивирования киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae, содержащая источник углеродного питания, источник азотного питания и минеральные соли, отличающаяся тем, что в качестве источника азотного питания она содержит гидролизат отходов производства препарата "Ридостин" при следующем соотношении компонентов, г/л:
Меласса - 50
Гидролизат отходов производства препарата "Ридостин" - 0,5 л
Аммоний фосфорнокислый двузамещенный - 2,3
Аммоний сернокислый - 1,2
Калий хлористый - 1,7
Вода водопроводная - До 1 л
рН 5,0±0,1.