БАКТЕРИАЛЬНАЯ АССОЦИАЦИЯ GORDONIA PARAFFINIVORANS И RHODOCOCCUS RUBER - АКТИВНЫЙ БИОАККУМУЛЯТОР ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ Российский патент 2024 года по МПК C12N11/02 C12N1/20 B01J20/22 C02F3/34 C02F1/28 A62D3/02 C02F101/20 C12R1/01 

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии, в частности к очистке сточных вод промышленных предприятий от тяжелых металлов с помощью иммобилизованного на твердый носитель консорциума непатогенных актиномицетов.

Загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами (ТМ) является одной из наиболее серьезных экологических проблем во всех экосистемах: морских, пресноводных и наземных. Большинство ТМ относится к 1 классу опасности [ГОСТ Р 70281-2022 от 5.10.2022 г. "Охрана окружающей среды. Почвы. Классификация химических веществ для контроля загрязнения"]. ТМ из сточных вод промышленных предприятий впоследствии накапливаются в почве, где они связываются с минеральными компонентами, могут переходить в почвенный раствор и далее в растения и почвенные организмы, влияя на их жизнедеятельность и развитие [Фрумин П.Т. Экологическая химия и экологическая токсикология // СПб.: РГГМУ. 2013. С.33-51]. Наиболее часто в загрязненных объектах встречаются такие ТМ, как Cd, Со, Cr, Cu, Ni, Mo, Pb и Zn [Авакян З.А. Сравнительная токсичность тяжелых металлов для некоторых микроорганизмов. Микробиология. 1967. 36(6): 446 450; Li D. Soil heavy metal contamination related to roasted stone coal slag: a study based on geostatistical and multivariate analyses. Environ. Sci. Pollut. Res. 2016. 23(14): 14405 14413]. Попадающие в среду ионы ТМ недеградабельны, высоко токсичны, легко аккумулируются в клетках, в том числе по системам транспорта щелочных и щелочноземельных металлов, занимая их место в процессах метаболизма, и после трудно выводятся из живых организмов [Lu Н. et at. Alkaline amendments improve the health of soils degraded by metal contamination and acidification: Crop performance and soil bacterial community responses. Chemosphere. 2020. 257: 1-10; Shen Z. et at. Ecological and health risks of heavy metal on farmland soils of mining areas around Tongling City, Anhui, China. Environ. Sci. Pollut. Res. 2019. 26(15): 15698-15709].

Из металлов наиболее токсичными для живых организмов являются кадмий, кобальт, марганец, медь, никель, ртуть, свинец, серебро, хром и цинк [Алексеев Ю.В. Тяжелые металлы в почвах и растениях. Л.: Агропромиздат.1987. С. 44-54]. По имеющимся данным, наиболее часто и в наибольших концентрациях в поверхностных и сточных водах Российской Федерации обнаруживаются кадмий, марганец, медь, никель, ртуть, хром и цинк [Ефимов В.И., Рыбак Л.В. Производство и окружающая среда. М.: МГГУ. 2012. 336 с.; Основные показатели охраны окружающей среды. Статистический бюллетень. М.: Федеральная служба государственной статистики. 2021. С. 24-33]. По статистическим данным за 2021 г., фоновое содержание ТМ, принадлежащих к 1 классу опасности, в частности кадмия, ртути и свинца, в поверхностных водах Российской Федерации соответствовало диапазонам значений 0,02-3,0 мкг/л по кадмию (ПДК 0,001 мг/л), 0,21-0,67 мкг/л по ртути (ПДК 0,5 мкг/л) и 0,28-1,62 мкг/л по свинцу (ПДК 0,03 мг/л) [ГОСТ Р 70281-2022 от 5.10.2022 г. "Охрана окружающей среды. Почвы. Классификация химических веществ для контроля загрязнения"; Черногаева Г.М. Обзор состояния и загрязнения окружающей среды в Российской Федерации за 2021 год. М.: Росгидромет. 2022. 220 с.].

До недавнего времени повсеместно применялись химические и физические технологии удаления ТМ из промышленных стоков: химическое осаждение, окисление или восстановление, ионный обмен, электрохимическая обработка, мембранная фильтрация и обратный осмос [АН Н., Khanb Е., Sajad A.M. Phytoremediation of heavy metals-Concepts and applications. Chemosphere. 2013. 91: 869-881; Abdel-Ghani N., El-Chagbaby G. Biosorption for metal ions removal from aqueous solutions: A review of recent studies, hit. J. Latest Res. Sci. Technol. 2014. 3: 24-42; Xia Z. et al. Heavy metal ion removal by thiol functionalized aluminum oxide hydroxide nanowhiskers. Appl. Surf. Sci. 2017. 416: 567-570]. По последним данным, эти процессы являются неэффективными и экономически невыгодными по сравнению с биологическими методами очистки [Литвиненко Л.В. Способность актинобактерий родов Dietzia, Gordonia и Rhodococcus аккумулировать ионы никеля. Микробиология. 2019. 88(2): 207-215; Mortula М., Ahmad A. Leaching of antimony from bottle water. ACSEE. 2013: 85-88]. На сегодняшний день актуальными признаются процессы с использованием микроорганизмов, такие как био аккумуляция и биосорбция [Gadd G.M. Metals, minerals and microbes: geomicrobiology and bioremediation. Microbiology. 2010. 156(3): 629 230; Baz S.E. et al. Resistance to and accumulation of heavy metals by actinobacteria isolated from abandoned mining areas. Sci. World J. 2015. 1: 34-48]. Разрабатываемые пути биоремедиации представляют собой многообещающие экологически безопасные, экономически выгодные, эффективные и избирательные методы для борьбы с поллютантами, включающие использование устойчивых к ТМ микроорганизмов [Alvarez A. et al. Actinobacteria: Current research and perspectives for bioremediation of pesticides and heavy metals. Chemosphere. 2017. 166: 41-62; Oyetibo G.O. et al. Biotechnological remedies for the estuarine environment polluted with heavy metals and persistent organic pollutions. International Bio deterioration and Biodegradation. 2016. 119: 615-620], которые развили определенные метаболические процессы и механизмы адаптации, связанные с их выживанием в различных стрессовых условиях [Gadd G.M. et al. Microbial control of heavy metal pollution. In microbial control of heavy metal pollution. Cambridge University Press: Cambridge, UK. 1992. P. 59-88].

В связи с этим необходимо изучение возможности удаления ТМ из загрязненных сред микроорганизмами, играющими роль первичной системы реагирования на потенциально опасные изменения среды их обитания и запускающие механизмы реакции детоксикации и разложения ксенобиотиков на самых ранних стадиях.

Среди микроорганизмов, участвующих в первичных процессах самоочищения природных экосистем, важную роль в детоксикации загрязненных объектов могут играть водные и почвенные актиномицеты - устойчивые обитатели загрязненных почв, водоемов, сточных вод. Они характеризуются высокой активностью оксидоредуктаз; способностью к синтезу флокулянтов, аминокислот, полимеров; богатыми адаптивными возможностями в отношении различных токсических соединений, а также высоким потенциалом для биоремедиации загрязненных объектов [Ivshina I.B., Kuyukina M.S., Krivoruchko A.V. Hydrocarbon-oxidizing bacteria and their potential in eco-biotechnology and bioremediation. In: I. Kurtboke (Ed.), Microbial Resources: From Functional Existence in Nature to Industrial Applications, Academic Press, Cambridge. 2017. P. 121-148]. Актиномицеты крайне широко распространены, населяют разнообразные эколого-географические регионы и адаптированы к экстремальным условиям среды [Ventura М. et al. Genomics of Actinobacteria: Tracing the evolutionary history of an ancient phylum. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2007. 71: 495-548]. Непатогенные представители актиномицетов - одна из наиболее перспективных групп микроорганизмов для использования в биотехнологических процессах очистки сточных вод, загрязненных ТМ.

В настоящее время интенсивно разрабатываются биотехнологии на основе микроорганизмов, иммобилизованных на поверхности или в матрице различных носителей. Такие биокатализаторы интенсивно применяются для получения целевых метаболитов, очистки промышленных сточных вод от избытка биогенных элементов, нефтепродуктов или ТМ. Иммобилизация процесс закрепления клеток на носителе либо заключение их в объеме носителя [Lopez A., Lazaro N., Marques A.M. The interphase technique: a simple method of cell immobilization in gel beads. J. Microbiol. Methods. 1997. 30(3): 231 234]. Эффективные условия иммобилизации и использованные носители обеспечивают минимальное повреждение клеток и препятствуют свободной диффузии. Преимущества иммобилизованных клеток по сравнению с планктонными: упрощение сбора необходимой биомассы, повышение устойчивости клеток к воздействию неблагоприятных факторов (температура, кислотность, токсические соединения) [Eroglu Е., Smith S.M., Raston C.L. Application of various immobilization techniques for algal bioprocesses. Biomass and biofuels from microalgae, Berlin: Springer. 2015. P. 19 44]. Известно, что иммобилизованные бактериальные клетки имеют повышенную устойчивость к неблагоприятным условиям внешней среды, а также обладают высоким потенциалом к биодеструкции поллютантов [Подорожко Е.А. и др. Композиция для получения носителя иммобилизованных микроорганизмов, расщепляющих углеводороды, и способ получения носителя. Патент РФ 2298033]. Преимуществами применения в качестве носителей природных материалов являются гидрофильность, биосовместимость и простота утилизации. Носитель для иммобилизации должен обладать высокой механической, химической и биологической стойкостью. Кроме того, он должен быть незатратным, надежно удерживать клетки и обладать высокой степенью гидрофильности, что способствует прохождению реакции с ТМ в водных средах [de-Bashan L.E., Bashan Y. Immobilized microalgae for removing pollutants: review of practical aspects // Biores. Technol. 2010. 101(6): 1611-1627].

Ранее была подтверждена способность актиномицетов рода Rhodococcus эффективно и одновременно извлекать Cd, Zn, Pb из пресных водоемов [Соловых Г.Н. и др. Способ микробиологической очистки сточных вод промышленных предприятий от ионов тяжелых металлов: цинка, кадмия и свинца. Патент РФ 2216525], решены задачи по подбору оптимальных условий эффективного извлечения цезия с учетом температуры, рН, источника углерода и соотношения ионов К⁺ и Cs⁺ в среде культивирования [Пешкур Т.А., Ившина И.Б., Коробов В.П. Эффективное извлечение цезия клетками бактерий рода Rhodococcus. Микробиология. 2002. 71(3): 418-423].

Ранее был произведен подбор оптимального носителя для иммобилизации бактериальных клеток [Подорожко Е.А. и др. Композиция для получения носителя иммобилизованных микроорганизмов, расщепляющих углеводороды, и способ получения носителя. Патент РФ 2298033]. Задачей предлагаемого изобретения является разработка композиции для получения носителя (отходы деревообрабатывающей промышленности - древесные опилки) иммобилизованных клеток углеводородокисляющих микроорганизмов и способа получения указанного носителя. Задача данного изобретения оценка возможности использования иммобилизованных на твердый носитель актиномицетов родов Gordonia и Rhodococcus в качестве активных биоаккумуляторов железа, кадмия, меди, никеля, свинца, хрома и цинка.

Технической задачей описываемого изобретения является изыскание средства, обеспечивающего эффективную и экологически безопасную аккумуляцию поллютантов - тяжелых металлов. Для этого авторами изобретения был осуществлен поиск активных штаммов-аккумуляторов ТМ (Cd, Cr, Cu, Fe, Ni, Pb, Zn) и проведены эксперименты по изучению закономерностей процесса извлечения ионов ТМ иммобилизованным консорциумом непатогенных актиномицетов в зависимости от условий эксперимента.

Техническим результатом изобретения является эффективное извлечение ТМ иммобилизованном на древесных опилках консорциумом актиномицетов Gordonia paraffinivorans ИЭГМ 735 и Rhodococcus ruber ИЭГМ 560. На 7 сут эксперимента аккумуляция ТМ в условиях культивирования в биореакторе с перемешиванием достигает 100% в отношении цинка и свинца, в колоночном биореакторе иммобилизованный консорциум извлекает 100% кадмия, свинца и цинка в зависимости от условий эксперимента.

Предлагаемые в качестве эффективных аккумуляторов ТМ штаммы выделены в естественных условиях из пены станции аэрации сточных вод Gordonia paraffinivorans ИЭГМ 735; из песчаной породы с глубины 6 м - Rhodococcus ruber ИЭГМ 560.

Штаммы депонированы в Национальный биоресурсный центр Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика под регистрационными номерами ВКПМ Ас-2214 (R. ruber ИЭГМ 560) и ВКПМ Ас-2215 (G. paraffinivorans ИЭГМ 735).

Данные штаммы характеризуются следующими признаками.

Культуральные и морфологические признаки

Штамм G. paraffinivorans ИЭГМ 735 - грамположительные неспорообразующие неподвижные плеоморфные одиночные короткие палочки с закругленными концами размером 0,5-1,0 × 4,0-6,0 мкм. Хорошо растет на богатых питательных средах на основе мясного экстракта и пептонов. Колонии, выращенные на мясопептонном агаре, округлые, выпуклые, с не ровным краем, непрозрачные, хрупкой консистенции, без воздушного мицелия с оранжево-красным недиффундирующим пигментом размером 2-3 мм через 48 часов (через семь суток 3-4 мм). Рост возможен при температуре 5-28°С. Значение рН, оптимальное для роста клеток, составляет 5,5-9,5.

Штамм R. ruber ИЭГМ 560 - грамположительные неспорообразующие неподвижные плеоморфные одиночные короткие палочки с закругленными концами размером 0,5-1,0 × 6,0-10,0 мкм. Хорошо растет на богатых питательных средах на основе мясного экстракта и пептонов. Колонии, выращенные на мясопептонном агаре, округлые, выпуклые, с ровным краем, непрозрачные, маслянистой консистенции и блестящей гладкой поверхностью, без воздушного мицелия с оранжево-красным недиффундирующим пигментом размером 1-2 мм через 48 часов (через семь суток 1-3 мм). Рост возможен при температуре 5-28°С. Значение рН, оптимальное для роста клеток, составляет 6,8-7,0.

Физиолого-биохимические признаки

Штамм G. paraffinivorans ИЭГМ 735 имеет выраженную каталазную активность, характеризуется хемоорганотрофным и окислительным типом обмена веществ. В качестве единственного источника азота использует нитраты или соли аммония. Не образует кислоту из D-галактозы, D-глюкозы, D-маннозы, сахарозы и глицерина. Усваивает в качестве единственного источника D-маннозу, D-фруктозу, L-аланин, декстрин, галактозу, глюкозу, глутамат, глицерин, лейцин, мальтозу, сахарозу, инулин, олеиновую кислоту, но не усваивает арабинозу, цитрат, лактат, рибозу, яблочную и янтарную кислоты. Использует в качестве единственного источника углерода такие углеводороды, как н-додекан (С 12), н-гексадекан (С 16). Штамм характеризуется высокой устойчивостью к солям ТМ, а именно As⁵⁺ 12,01* г/л; Cd²⁺ 17,90 г/л; Со³⁺ 37,71 г/л; Cr⁶⁺ 16,61 г/л; Cu²⁺ 0,32 г/л; Hg²⁺ 0,02 г/л; Мо⁶⁺ 3,36 г/л; Mn²⁺ 70,56* г/л; Mn⁴⁺ 70,37* г/л; Ni²⁺ 75,14 г/л; Pb²⁺ 8,29 г/л; Sn²⁺ 2,37 г/л; Zn²⁺ 10,46 г/л. * - Выше пределов растворимости соли.

Штамм R. ruber ИЭГМ 560 имеет выраженную каталазную активность, характеризуется хемоорганотрофным и окислительным типом обмена веществ. В качестве единственного источника азота использует нитраты или соли аммония. Образует кислоту из D-фруктозы, D-глюкозы, D-маннозы, сахарозы. Усваивает в качестве единственного источника D-маннозу, D-фруктозу, глюкозу, сахарозу, этанол, маннит, сорбит, уксусную, масляную, капроновую, пропионовую, янтарную, лимонную и пировиноградную кислоты, но не усваивает метанол, пальмитиновую, фенилуксусную кислоты. Использует в качестве единственного источника углерода такие углеводороды, как н-пропан (С3), н-бутан (С4), н-додекан (С 12), н-гексадекан (С16), нафталин и фенол. Штамм характеризуется высокой устойчивостью к солям ТМ, а именно As⁵⁺ 12,01* г/л; Cd²⁺ 8,95 г/л; Со³⁺ 75,40 г/л; Cr⁶⁺ 4,15 г/л; Cu²⁺ 0,64 г/л; Hg²⁺ 0,02 г/л; Мо⁶⁺ 6,72 г/л; Mn²⁺ 70,56* г/л; Mn⁴⁺ 70,37* г/л; Ni²⁺ 75,14 г/л; Pb²⁺ 33,16* г/л; Sn²⁺ 2,37 г/л; Zn²⁺ 5,23 г/л. * - Выше пределов растворимости соли.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Повышение степени устойчивости актиномицетов к ТМ посредством иммобилизации клеток на твердый носитель.

По результатам определения минимальных подавляющих концентраций (МПК) ТМ микропланшетным методом [Ившина И.Б., Куюкина М.С., Костина Л.В. Адаптационные механизмы неспецифической устойчивости алканотрофных актинобактерий к ионам тяжелых металлов. Экология. 2013. 2: 115-123] выявлена выраженная устойчивость штаммов в отношении большинства распространенных в сточных водах ТМ, которая представлена в разделе физиолого-биохимических признаков.

Процедуру иммобилизации проводили в стеклянных пробирках. В пробирки вносили 20 мг древесных опилок, закрывали ватно-марлевыми пробками и автоклавировали при температуре 105°С в течение 15 мин. Актиномицеты G. paraffinivorans ИЭГМ 735 и R. ruber ИЭГМ 560 предварительно выращивали на мясопептонном агаре. После этого вносили по 1 мл готовой бактериальной суспензии в пробирки с носителем, которые помещали на орбитальный шейкер (120 об./мин) для культивирования при температуре 28°С в течение 7 сут.

Степень адсорбции бактериальных клеток на носителе (Табл. 1) оценивали с помощью спектрофотометра Lambda EZ201 UV/Vis (Perkin-Elmer, США) по показателю оптической плотности (λ=600 нм) клеточной суспензии, для этого отбирали жидкую фазу без частиц носителя.

Из пробирок с помощью автоматического дозатора удаляли жидкую фазу, носитель дважды отмывали натрий-фосфатным буфером (рН 7,0) следующего состава (г/л): Na₂HPO₄ - 3,53; KH₂PO₄ - 3,39.

Соли ТМ растворяли в мясопептонном бульоне (МПБ) в определенной концентрации (Табл. 2), автоклавировали при температуре 105°С в течение 15 мин, после готовили серию двукратных разведений в МПБ. Растворы солей ТМ вносили по 1 мл в пробирки с иммобилизованными культурами. В качестве абиотического контроля использовали неинокулированный носитель. В качестве биотического контроля использовали иммобилизованные клетки актиномицетов, культивируемые в МПБ без солей ТМ. Пробирки инкубировали при температуре 28°С в течение 7 сут.

О жизнеспособности бактериальных клеток судили по появлению мутности в питательной среде, а также по специфическому окрашиванию хлорида йодонитротетразолия (ИНТ) через 7 сут эксперимента. Для окрашивания в пробирки вносили 250 мкл 0,2%-ного водного раствора ИНТ и через 2 ч инкубирования при комнатной температуре фиксировали появление окрашивания.

Эксперименты показали, что иммобилизованные на носителе актиномицеты имеют устойчивость в отношении некоторых ТМ выше (Табл. 3), чем планктонные клетки. Так у Gordonia paraffinivorans ИЭГМ 735 в 4 раза повышалась устойчивость к молибдену и ртути, в 2 раза - к свинцу, хрому и цинку. У Rhodococcus ruber ИЭГМ 560 в 15,6 раз повышалась устойчивость к ртути и в 2 раза - к кадмию, молибдену, хрому и цинку. В отношении остальных ТМ устойчивость оставалась неизменной.

Пример 2. Аккумуляция ТМ из модельной сточной воды №1 иммобилизованным на носитель консорциумом актиномицетов Gordonia paraffinivorans ИЭГМ 735 и Rhodococcus ruber ИЭГМ 560 в модели биореактора с перемешиванием и колоночном биореакторе.

Для оценки способности клеток актиномицетов к адсорбции и их окисляющей активности были проведены эксперименты по очистке модельной сточной воды, состав которой идентичен составу сточных вод предприятия ОАО «ВОЛГОЦЕММАШ», Тольятти (сточная вода №1) и содержит распространенные в сточной воде ТМ [Харитонов М.К., Загорская Е.П., Четаева М.А. Применение локальных очистных установок на предприятии ОАО "ВОЛГОЦЕММАШ". Изд-во Тольятт. гос. ун-та. Тольятти. 2018. С. 11-13]. Состав модельной сточной воды представлен в Табл. 4. Начальное содержание ТМ в сточной воде принято за 100%.

Актиномицеты G. paraffinivorans ИЭГМ 735 и R. ruber ИЭГМ 560 предварительно выращивали в МПБ. Через 48 ч культивирования в МПБ клеточную суспензию центрифугировали при 3500 об./мин в течение 15 мин для удаления остаточного субстрата. Осажденную биомассу дважды отмывали натрий-фосфатным буфером, ресуспендировали до значения ОП_{600 нм} 1,0.

Для очистки модельной сточной воды использовали лабораторный колоночный биореактор - стеклянную колонку, заполненную носителем с иммобилизованными клетками G. paraffinivorans ИЭГМ 735 и R. ruber ИЭГМ 560. Носителем для иммобилизации служили отходы деревообрабатывающей промышленности - 2 г древесных опилок с размером частиц 0,1-0,3 см. Перед использованием носитель автоклавировали (105°С, 15 мин, 1,0 атм.). Степень адсорбции бактериальных клеток на носителе оценивали с помощью спектрофотометра по показателю оптической плотности (λ=600 нм) клеточной суспензии, для этого отбирали жидкую фазу без частиц носителя. В качестве контроля использовали неинокулированный носитель. Через 96 часов носитель с иммобилизованными клетками дважды отмывали от непрочно прикрепленных и отмерших клеток натрий-фосфатным буфером.

Стеклянная колонка соединялась с колбой, содержащей модельную сточную воду. Оптимальная скорость для циркуляции жидкости по системе составляла 1,6 мл/мин за счет работы перистальтического насоса. Жидкость из колбы подавалась в колонку через нижнее входное отверстие и проходила через слой опилок с иммобилизованными клетками, выходила через верхнее отверстие и возвращалась в колбу со сточной водой. Эксперимент проводили в течение 7 сут. Измерение концентрации кислоторастворимых форм элементов (Cd, Cr, Cu, Fe, Ni, Pb, Zn) проводили с помощью атомно-абсорбционного спектрометра "Квант-2м1" по стандартной методике М-МВИ-80-2008 "Методика выполнения измерений массовой доли в пробах почв, грунтов и донных отложений методами атомно-эмиссионной и атомно-абсорбционной спектрометрии", Санкт-Петербург, 2008 г.

Параллельно проводили очистку сточной воды иммобилизованными клетками и их ассоциацией в биореакторе с перемешиванием. В качестве модели биореактора с перемешиванием использовали колбу Эрленмейера с объемом 250 мл, помещенную на орбитальный шейкер с режимом постоянного перемешивания 120 об./мин при температуре 28°С. Адсорбцию клеток на опилках проводили в таком биореакторе, содержащем 100 мл бактериальной суспензии и 2 г носителя. После адсорбции и промывки добавляли модельную сточную воду №1, состав которой представлен в Табл. 4. Эксперимент проводили в течение 7 сут. Измерение концентрации кислоторастворимых форм элементов проводили с помощью атомно-абсорбционного спектрометра. Способность к очистке сточной воды исследовали у каждого штамма в отдельности и при совместном их действии. Эксперименты по очистке модельных сточных вод проводили в трех повторностях.

По нашим данным, иммобилизованные на носителе актиномицеты способны к аккумуляции ТМ из модельных сточных вод. Условия проводимых экспериментов (состав сточных вод, начальная концентрация ТМ, варианты очистки) влияли на процесс аккумуляции ТМ.

При проведении процесса биоочистки сточной воды №1 с использованием иммобилизованного консорциума актиномицетов (Табл. 5, Табл. 7, Фиг. 1) в условиях лабораторного биореактора с перемешиванием наблюдали полное (100%) извлечение свинца и цинка. Извлечение никеля составляло 98,9%, кадмия - 94,0%, меди - 72,5%, хрома - 67,7%, железа - 45,0%. При раздельном действии иммобилизованных актиномицетов, при использовании закрепленных клеток G. paraffinivorans ИЭГМ 735 в биореакторе с перемешиванием (Табл. 5, Табл. 7, Фиг. 1) наблюдали аккумуляцию ионов цинка и свинца до 100%. Хуже всего аккумулировались ионы железа до 4,4%. Остальные металлы аккумулировались в диапазоне 61,8 99,1%.

При использовании иммобилизованных клеток R. ruber ИЭГМ 560 в биореакторе с перемешиванием (Табл. 5, Табл. 7, Фиг. 1) лучше всего аккумулировались ионы цинка и свинца до 100%, хуже ионы железа (1%) и хрома (4,5%). Остальные металлы аккумулировались в диапазоне от 76,3 до 98,5%.

Контрольная очистка воды в биореакторе с перемешиванием с помощью неинокулированного носителя (Табл. 5, Табл. 7, Фиг. 1) не показала статистически достоверного изменения остаточного содержания ТМ в составе сточной воды.

Очистка сточной воды №1 с использованием ассоциации иммобилизованных клеток в колоночном биореакторе (Табл. 5, Табл. 7, Фиг. 1) от ионов цинка, кадмия и свинца составляла 100%, никеля - 99,4%, меди - 63,5%, хрома - 54,6% и железа - 38,6%.

Пример 3. Аккумуляция ТМ из модельной сточной воды №2 иммобилизованным консорциумом актиномицетов Gordonia paraffinivorans ИЭГМ 735 и Rhodococcus ruber ИЭГМ 560 в модели биореактора с перемешиванием и колоночном биореакторе.

Для оценки способности клеток актиномицетов к адсорбции и их окисляющей активности были проведены эксперименты по очистке модельной сточной воды, состав которой идентичен составу сточных вод гальванического цеха ОАО «Уральский оптико-механический завод» имени Э.С. Яламова, Екатеринбург (сточная вода №2) и содержит распространенные в сточной воде ТМ. Состав модельной сточной воды представлен в Табл. 4. Начальное содержание ТМ в сточной воде принято за 100%.

При проведении процесса биоочистки сточной воды №2 иммобилизованном консорциумом актиномицетов (Табл. 6, Табл. 8, Фиг. 2) в условиях лабораторного биореактора с перемешиванием наблюдали практически полное (99,9%) извлечение хрома. Медь извлекалась на 99,2%, никель - 97,5%, цинк - 96,8%, железо - 90,3%.

При использовании иммобилизованных клеток G. paraffinivorans ИЭГМ 735 в биореакторе с перемешиванием (Табл. 6, Табл. 8, Фиг. 2) лучше всего аккумулировались ионы меди 99,9%, никеля - 99,6% и хрома - 99,4%, железа 91,6%, хуже - ионы цинка - 85,4%.

При использовании иммобилизованных клеток R. ruber ИЭГМ 560 в биореакторе с перемешиванием (Табл. 6, Табл. 8, Фиг. 2) лучше всего аккумулировались ионы меди - до 98,3% и хрома - до 98,8%, хуже - ионы цинка 88,2%. Аккумуляция ионов железа составляла 90,8%.

Очистка воды в биореакторе с перемешиванием неинокулированным носителем (Табл. 6, Табл. 8, Фиг. 2) не показала статистически достоверного изменения остаточного содержания ТМ в составе сточной воды.

Очистка сточной воды №2 с использованием ассоциации иммобилизованных клеток в колоночном биореакторе (Табл. 6, Табл. 8, Фиг. 2) от ионов меди, никеля, цинка и хрома составила 100%, железа - 96,7%.

Следует отметить, что выявленные достоверные различия в полученных данных связаны с различными способами очистки модельной сточной воды: раздельное или сочетанное использование иммобилизованных актиномицетов, колоночный биореактор или биореактор с перемешиванием.

Для полной очистки сточной воды от ТМ нужно либо увеличить время очистки до 10-14 дней, либо количество использованного биокатализатора (носителя с иммобилизованными на поверхности клетками актиномицетов) в 5 раз (10 г).

Таким образом, заявленный способ возможного использования иммобилизованных на носитель актиномицетов может рассматриваться как эффективный биоаккумулятор тяжелых металлов из сточных вод промышленных предприятий.

Изобретение поясняется нижеследующими табличными материалами.

Табл. 1. Эффективность иммобилизации актиномицетов на носитель по данным ультрафиолетовой спектрофотометрии (ОП₆₀₀).

Табл. 2. Расчет навески солей ТМ определенной концентрации (г/л).

Табл. 3. Устойчивость к ТМ планктонных и иммобилизованных актиномицетов.

Табл. 4. Элементный состав модельных сточных вод промышленного предприятия ОАО "ВОЛГОЦЕММАШ", Тольятти (сточная вода №1) и гальванического цеха ОАО "Уральский оптико-механический завод" имени Э.С. Яламова, Екатеринбург (сточная вода №2).

Табл. 5. Извлечение ТМ из модельной сточной воды №1. Приведены средние значения.

Табл. 6. Извлечение ТМ из модельной сточной воды №2. Приведены средние значения.

Табл. 7. Остаточное содержание ТМ в модельной сточной воде №1. Приведены средние значения.

Табл. 8. Остаточное содержание ТМ в модельной сточной воде №2. Приведены средние значения.

Изобретение поясняется нижеследующими графическими материалами.

на Фиг. 1. Результаты очистки сточной воды №1 от ТМ иммобилизованными клетками G. paraffinivorans ИЭГМ 735 и R. ruber ИЭГМ 560. 1 - исходная концентрация ТМ; 2 - очистка иммобилизованными G. paraffinivorans ИЭГМ 735 в биореакторе с перемешиванием; 3 - очистка иммобилизованными клетками R. ruber ИЭГМ 560 в биореакторе с перемешиванием; 4 - очистка иммобилизованным консорциумом G. paraffinivorans ИЭГМ 735 и R. ruber ИЭГМ 560 в биореакторе с перемешиванием; 5 очистка с помощью неинокулированного носителя (абиотический контроль); 6 - очистка иммобилизованным консорциумом G. paraffinivorans ИЭГМ 735 и R. ruber ИЭГМ 560 в колоночном биореакторе.

на Фиг. 2. Результаты очистки сточной воды №2 от ТМ иммобилизованными клетками G. paraffinivorans ИЭГМ 735 и R. ruber ИЭГМ 560. 1 - исходная концентрация ТМ; 2 - очистка иммобилизованными клетками G. paraffinivorans ИЭГМ 735 в биореакторе с перемешиванием; 3 - очистка иммобилизованными клетками R. ruber ИЭГМ 560 в биореакторе с перемешиванием; 4 очистка иммобилизованным консорциумом G. paraffinivorans ИЭГМ 735 и R. ruber ИЭГМ 560 в биореакторе с перемешиванием; 5 - очистка с помощью неинокулированного носителя (абиотический контроль); 6 - очистка иммобилизованным консорциумом G. paraffinivorans ИЭГМ 735 и R. ruber ИЭГМ 560 в колоночном биореакторе.

Таблица 1. Эффективность иммобилизации актиномицетов на носитель по данным ультрафиолетовой спектрофотометрии (ОП600)

Род, вид, штамм Оптическая плотность до процесса иммобилизации, е.о.п Оптическая плотность после процесса иммобилизации, е.о.п Осевшие на носитель клетки, % Gordonia paraffinivorans ИЭГМ 735 1,417 0,256 81,9 Rhodococcus ruber ИЭГМ 560 1,069 0,121 88,7

Таблица 2. Рсчет навески солей ТМ определенной концентрации (г/л)

Соли ТМ Навеска соли, г/л Pb(NO3)2 105,92 NiSO4 х 7H2O 719,40 CuSO4 х 5H2O 20,00 ZnSO4 х 7H2O 183,68 (NH4)6Mo7O24 х 4H2O 197,60 Cd(CH3COO)2 х 2H2O 85,12 K2CrO4 124,16 HgCl2 1,36 Co(NO3)3 x 6H2O 745,00 MnO2 222,72 MnSO4 х 7H2O 616,96 SnCl2 60,48 Na3AsO4 x12H2O 99,80

Таблица 3. Устойчивость планктонных и иммобилизованных актиномицетов

МПК, г/л Планктонные клетки Иммобилизованные клетки Gordonia paraffinivorans ИЭГМ 735 Cd2+ 17,90 г/л
Cr6+ 16,61 г/л
Cu2+ 0,32 г/л
Hg2+ 0,02 г/л
Mo6+ 3,36 г/л
Ni2+ 75,14 г/л
Pb2+ 8,29 г/л
Zn2+ 10,46 г/л Cd2+ 17,90 г/л
Cr6+ 33,22 г/л
Cu2+ 0,32 г/л
Hg2+ 0,08 г/л
Mo6+ 13,44 г/л
Ni2+ 75,14 г/л
Pb2+ 16,58 г/л
Zn2+ 20,92 г/л Rhodococcus ruber ИЭГМ 560 Cd2+ 8,95 г/л
Cr6+ 4,15 г/л
Cu2+ 0,64 г/л
Hg2+ 0,02 г/л
Mo6+ 6,72 г/л
Ni2+ 75,14 г/л Pb2+ 33,16* г/л Zn2+ 5,23 г/л Cd2+ 17,90 г/л
Cr6+ 8,30 г/л
Cu2+ 0,64 г/л
Hg2+ 0,32 г/л
Mo6+ 26,88 г/л
Ni2+ 75,14 г/л Pb2+ 33,16* г/л Zn2+ 10,46 г/л

Примечание - * – выше пределов растворимости соли.

Таблица 4. Элементный состав модельных сточных вод промышленного предприятия ОАО “ВОЛГОЦЕММАШ”, Тольятти (сточная вода № 1) и гальванического цеха ОАО “Уральский оптико-механический завод” имени Э.С. Яламова, Екатеринбург (сточная вода № 2)

ТМ Концентрация ТМ, мг/л Сточная вода №1 Сточная вода №2 Cd <0,005 –* Cu 0,008 0,200 Ni 0,270 0,200 Zn 0,653 0,050 Cr (+6) 0,022 4,500 Feобщ. <0,050 0,600 Pb 0,005 –*

Примечание - * - ТМ не входит в состав сточной воды.

Таблица 5. Извлечение ТМ из модельной сточной воды № 1

ТМ Концентрация ТМ, мг/л Биореактор с перемешиванием Консорциум, колоночный биореактор ИЭГМ 735 ИЭГМ 560 Консорциум Носитель (контроль) Cd 96,0 96,0 94,0 20,0 100,0 Cu 87,5 76,3 72,5 25,0 63,5 Ni 99,1 98,5 98,9 3,6 99,4 Zn 100,0 100,0 100,0 8,6 100,0 Cr+6 61,8 4,5 67,7 4,5 54,6 Feобщ. 4,4 1,0 45,0 0 38,6 Pb 100,0 100,0 100,0 20,0 100,0

Примечание - Приведены средние значения.

Таблица 6. Извлечение ТМ из модельной сточной воды № 2

ТМ Концентрация ТМ, % Биореактор с перемешиванием Консорциум, колоночный биореактор ИЭГМ 735 ИЭГМ 560 Консорциум Носитель (контроль) Cu 99,9 98,3 99,2 10,0 100,0 Ni 99,6 95,5 97,5 5,0 100,0 Zn 85,4 88,2 96,8 20,0 100,0 Cr+6 99,4 98,8 99,9 9,2 100,0 Feобщ. 91,6 90,8 90,3 6,7 96,7

Примечание - Приведены средние значения.

Таблица 7. Остаточное содержание ТМ в модельной сточной воде №1

ТМ Концентрация ТМ, % Биореактор с перемешиванием Консорциум, колоночный биореактор ИЭГМ 735 ИЭГМ 560 Консорциум Носитель (контроль) Cd 4,0 4,0 6,0 80,0 0 Cu 12,5 23,7 27,5 75,0 37,5 Ni 0,9 1,5 1,1 96,4 0,6 Zn 0 0 0 91,4 0 Cr+6 38,2 95,5 32,2 95,5 45,4 Feобщ. 95,6 99,0 55,0 100,0 61,4 Pb 0 0 0 80,0 0

Примечание - Приведены средние значения.

Таблица 8. Остаточное содержание ТМ в модельной сточной воде № 2

ТМ Концентрация ТМ, % Биореактор с перемешиванием Консорциум, колоночный биореактор ИЭГМ 735 ИЭГМ 560 Консорциум Носитель (контроль) Cu 0,1 1,7 0,8 90,0 0 Ni 0,4 4,5 2,5 95,0 0 Zn 14,6 11,8 3,2 80,0 0 Cr+6 0,6 1,2 0,1 90,8 0 Feобщ. 8,4 9,2 9,7 93,3 3,3

Примечание - Приведены средние значения.

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии, в частности к очистке сточных вод промышленных предприятий от тяжелых металлов. Предложена ассоциация иммобилизованных на твердом носителе бактерий Gordonia paraffinivorans ВКПМ Ас-2215 и Rhodococcus ruber ВКПМ Ас-2214. Изобретение позволяет извлекать 90-100% тяжелых металлов, таких как кадмий, кобальт, медь, молибден, никель, свинец, хром, цинк, из сточных вод промышленных предприятий. 2 ил., 8 табл., 3 пр.

Микробная ассоциация иммобилизованных на твердом носителе актиномицетов Gordonia paraffinivorans ВКПМ Ас-2215 и Rhodococcus ruber ВКПМ Ас-2214 для извлечения тяжелых металлов из сточных вод промышленных предприятий.