ШТАММ БАКТЕРИЙ PROTEUS MIRABILIS № 26, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ИММУННЫХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2003 года по МПК C12N1/20 A61K39/02 C12N1/20 C12R1/37 

Предлагаемое изобретение относится к ветеринарной биотехнологии и может быть использовано в получении иммунных препаратов против возбудителей острых кишечных инфекций сельскохозяйственных животных.

Среди условно-патогенных энтеробактерий наиболее частыми возбудителями ОКИ (острых кишечных инфекций) служат Proteus mirabilis и Proteus vulgaris.

Условно-патогенные энтеробактерии являются естественными обитателями кишечника человека и многих животных, в том числе сельскохозяйственных.

Условно-патогенные энтеробактерии широко распространены в природе: доказано их постоянное пребывание в воде открытых водоемов, особенно протеев.

По восприимчивости можно выделить группу риска - это новорожденные, ослабленные дети, лица с хроническими недугами, пациенты, подвергавшиеся антибактериальной терапии или хирургическим вмешательствам. Из вышесказанного становится очевидной проблема борьбы с энтеробактериями рода Proteus [1].

Известен штамм бактерий Proteus mirabilis 236 ГИСК, обладающий следующими свойствами:
Морфологические признаки. Грамотрицательные палочки располагаются в мазке отдельно или попарно. В нативном препарате подвижные.

Культуральные свойства. При выращивании на 1,6%-ном МПА (рН 7,2-7,4), содержащем 50 эритроцитов кролика, при температуре 35-36^oС штамм на поверхности питательной среды дает характерный стелющийся рост в виде вуали с зоной лизиса, при выращивании в бульоне Хоттингера (рН 7,2-7,4) температура 35-36^oС в течение 20 ч дает диффузное помутнение и нежную пленку на поверхности среды.

Ферментативные свойства. Образует фенилаланиндезаминазу индол, не ферментирует лактозу и ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу, ксилозу, салицин, мальтозу, сахарозу, расщепляет мочевину, не продуцирует оритиндекарбоксилазу.

Серологические свойства. 20-часовая агаровая культура дает агглютинацию только с НА 4 поливалентной диагностической протейной сухой кроличьей сывороткой.

Условия хранения культуры после лиофильной сушки при выращенной в 0,3%-ном МПА (рН 7,2-7,4), залитом стерильном вазелиновым маслом, при температуре 4^oС.

Среды для размножения бульон Хоттингера (рН 7,2-7,4), содержащий 5% эритроцитов кролика при температуре 35-36^oС в течение 20 ч.

Генетические особенности: Hiy⁺, Ent⁺, Hag⁺ (MS⁺/MR⁺), устойчив к пенициллину, неомицину, полимиксину, тетрациклину, линкомицину, эритромицину, ристомицину, оксациллину, левомицетину.

Штамм может быть использован для получения термолабильного энтеротоксина (ЛТ - энтеротоксина) и анатоксина Proteus mirabilis при производстве вакцин [2].

Известен также штамм бактерий Proteus mirabilis 238, кoторый характеризуется следующими свойствами:
Морфологические признаки. При окраске по Граму - грамотрицательные палочки располагаются в мазке отдельно или попарно. В нативном препарате подвижные.

Культуральные признаки. При выращивании на 1,5%-ном МПА (рН 7,2-7,4), содержащем 50 эритроцитов кролика, при 35-36^oС штамм на поверхности питательной среды дает характерный стелящийся рост в виде вуали с зоной гемолиза. При выращивании в бульоне Хоттингера (рН 7,2-7,4), температура 35-36^oС, в течение 20 ч дает диффузное помутнение и нежную пленку на поверхности среды.

Ферментативные свойства. Образует фенилаланиндезаменозу и индол, не ферментирует лактозу и ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу, ксилозу, салицин, мальтозу, сахарозу, расщепляет мочевину, не продуцирует оритиндекарбоксилазу.

Серологические свойства. ОА 26: 20-часовая агаровая культура дает агглютинацию только с НА 4 поливалентной диагностической протейной сухой кроличьей сывороткой.

Условия хранения культуры после лиофильной сушки при выращивании в 0,3%-ном МПА (рН 7,2-7,4), залитом стерильным вазелиновым маслом, при 4^oС.

Среды для размножения - бульон Хоттингера (рН 7,2-7,4), содержащий 5% эритроцитов кролика при 35-36^oС в течение 20 ч.

Генетические особенности. Hiy^+, реn^R, Ent⁺, Hag⁺ (MS⁺/MR⁺) устойчив к пенициллину, мономицину, неомицину, полимиксину, тетрациклину, линкомицину, ристомицину, оксациллину, левомицетину.

Штамм обладает повышенной токсинопродуцирующей способностью и может быть использован для получения термолабильного энтеротоксина (ЛТ-энтеротоксина) и анатоксина Proteus mirabilis при производстве вакцин [3].

В задачу наших исследований входило получить штамм Proteus mirabilis, предназначенный для получения иммунных препаратов.

Предложен штамм бактерий Proteus mirabilis 26, возбудитель протейной инфекции, отнесен к семейству Enterobacteriaceae, к роду Proteus, выделен в НИЛ инфекционной патологии и биотехнологии МГАВМ и Б им. К.И. Скрябина из органов новорожденного теленка в 1987 году.

Предложенный производственный штамм Proteus mirabilis 26 депонирован 27 апреля 2001 г. регистрационный номер "штамм Proteus mirabilis МГАВМ и Б-ДЕП" во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (123022, Россия, Москва, Звенигородское шоссе, 5, ВГНКИ).

Местом хранения производственного штамма Proteus mirabilis 26 возбудителя протейной инфекции определена коллекция НИЛ инфекционной патологии и биотехнологии МГАВМ и Б им. К.И. Скрябина, 109472, Москва, ул. Ак. Скрябина, 23, дублирующее хранение НИИ микробиологии МО РФ (610024, Россия, г. Киров, Октябрьский пр-т 121, в/ч 23527).

Предложенный штамм Proteus mirabilis обладает следующими свойствами:
Морфологические признаки: грамотрицательные прямые палочки, в мазках располагаются отдельно или попарно. Подвижные. На полужидком агаре (ПЖА) дает диффузный рост.

Культуральные свойства. Хорошо растет на обычных питательных средах, выделяет специфический гнилостный запах. На МПБ образует равномерное помутнение с образованием осадка. На МПА обладает свойством "роения" (ползучего роста).

На 5%-ном кровяном агаре вызывает гемолиз. На Плоскирева образует крупные колонии розового цвета с перламутровым оттенком.

Ферментативные свойства. Ферментирует глюкозу, сахарозу, рамнозу, мальтозу с выделением кислоты и газа, не утилизирует сорбит, индол, цитрат и молонат натрия, гидролизует мочевину, образует сероводород, не образует индол и ацетилметилкарбинол. В реакции Фогес-Проскауэра дезаминирует фенилаланин.

Серологические свойства. Агглютинируется с протейными адсорбированными О и Н сывортками производства НИВС им. И.И. Мечникова как штамм Proteus mirabilis О 13 и Н 2.

Патогенные свойства. ЛД₅₀ Для белых мышей внутрибрюшинно 1,6х10⁷ живых микробных клеток.

При пероральном введении новорожденным телятам в концентрации 10 млрд микр. клеток на 2-3 сутки вызывает признаки диареи, а гибель животных наступает на 5-6 сутки.

Лизируется колипротейным бактериофагом.

Антибиотикоустойчивость. Штамм Proteus mirabilis 26 устойчив к пенициллину, стрептомицину, левомицетину, эритромицину, тетрациклину.

Чувствителен: к офлоксацину, пиперациллину, рокситромицину и гентамицину.

Применяемый способ хранения и поддержания штамма. В лиофилизированном состоянии под вакуумом в герметично запаянных ампулах при минус 18-20^oС после пассажа через организм белых мышей.

Периодичность пересева на питательных средах. 15-20 суток.

Условия транспортировки. В лиофилизированном состоянии под вакуумом в герметично запаянных ампулах.

Срок хранения 10 лет.

Пример. Штамм Proteus mirabilis 26 вскрывают в асептических условиях и вносят 2,0-3,0 см³ мясопептонного бульона. Полученную взвесь переносят во флакон с МПБ, перекачивают в 20-литровую бутыль с казеиновым бульоном при помощи слабого разряжения, создаваемого в бутыли. Выращивают микробную культуру при температуре З6-38^oС в течение 16-20 ч при аэрации стерильным воздухом в количестве 4-5 объемов на объем среды в минуту. Затем через специальный сифон перекачивают в посевной материал в реактор. Плотность посева 150-300 млн микробных тел по оптическому стандарту мутности и выращивают 10-15 ч. Выращивание прекращают через 2-3 ч после стабилизации активной реакции среды в пределах 7,6-8,0 ед. рН.

Выход при этом микробной массы составляет 25-30 млрд микробных тел на 1 мл питательной среды, что дало возможность использовать штамм для изготовления иммунных препаратов в качестве антигена.

Вакцина, изготовленная с использованием в ней штамма Proteus mirabilis 26, обеспечивает защитный эффект от заражения вирулентными эпизоотическими штаммами на 5-7 сутки.

Вакцина апробирована с положительным результатом с 1995-2001 гг. на территории России: Ставропольский, Краснодарский края, Московской и Тульской областях и странах СНГ: Беларусь, Кыргыстан, Узбекистан.

Сохранность поголовья составляет 95-99%.

Предложенный штамм найдет применение как антиген в ассоциированной инактивированной вакцине против острых кишечных инфекций молодняка сельскохозяйственных животных.

Источники информации
1. Кн. "Руководство по эпидемиологии инфекционных болезней", изд. Медицина, т.2, 1993 г., стр. 78-80.

2. Патент РФ 2072689, кл. МКИ⁶ С 12 N 1/20, 1997 г.

3. Патент РФ 2113472, кл. МКИ⁶ С 12 N 1/20, 1998 г.

Изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии. Штамм бактерий Proteus mirabilis 26 обладает морфологическими и культуральными свойствами, присущими роду Proteus. Ферментативные свойства: ферментирует глюкозу, сахарозу, рамнозу, мальтозу с выделением кислоты и газа, не утилизирует сорбит, индол, цитрат и молонат натрия, гидролизует мочевину, образует сероводород, не образует индол и ацетилметилкарбинол. В реакции Фогес-Проскауэра дезаминирует фенилаланин. По серологическим свойствам штамм агглютирируется с протейными адсорбированными O и Н сыворотками как штамм Proteus mirabilis O 13 и Н 2. Патогенные свойства: ЛД 50 для белых мышей внутрибрюшинно 1,6•10⁷ живых микробных клеток. При пероральном введении новорожденным телятам в концентрации 10 млрд микр. кл. на 2-3-е сутки вызывает признаки диареи, а на 5-6-е сутки наступает гибель животных. Лизируется колибактерийный бактериофагом. Штамм Proteus mirabilis 26 устойчив к пенициллину, стрептомицину, левомицитину, эритромицину, тетрациклину. Чувствителен: к офлоксалину, пиперацилину, рокситромицину и гентамицину. Выход микробной массы составляет 25-30 млрд микр. тел на 1 мл. Штамм пригоден для изготовления иммунных препаратов против протейных инфекций сельскохозяйственных животных.

Штамм бактерий Proteus mirabilis ВГНКИ № 26 МГАВМ и Б-ДЕП, используемый для изготовления иммунных препаратов.