ШТАММ БАКТЕРИЙ PROTEUS MIRABILIS - ПРОДУЦЕНТ ТЕРМОЛАБИЛЬНОГО ЭНТЕРОТОКСИНА Российский патент 1998 года по МПК C12N1/20 A61K39/02 C12N1/20 C12R1/37 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения термолабильного энтеротоксина /ЛТ-энтеротоксина/ и анатоксина Proteus mirabilis при производстве вакцин.

Целью изобретения является штамм Proteus mirabilis 3106, обладающий повышенной тексинопродуцирующей способностью.

Штамм P.mirabilis N 3106 выделен от больного с урологической инфекцией в 1992 г., депонирован в коллекции Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича и имеет регистрационный номер 238.

Штамм P. mirabilis ГИСК 238 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки: при окраске по Граму грамотрицательные палочки располагаются в мазке отдельно или попарно. В нативном препарате подвижные.

Культурные признаки: при вращении на 1,5%-ном мясопентонном агаре /pH 7,2-7,4/, содержащем 50 эритроцитов кролика, при 35-36^oC штамм на поверхности питательной среды дает характерный стелящийся рост в виде вуали с зоной гемолиза. При выращивании в бульоне Хоттингера /pH 7,2-7,4/, температура 35-36^oC, в течение 20 ч дает диффузное помутнение и нежную пленку на поверхности среды.

Образует фенилаланиндезаменозу и онол, не ферментирует лактозу и ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу, ксилозу, салицин, мальтозу, сахарозу, расщепляет мочевину, не продуцирует оритиндекарбоксилазу.

Серологические свойства OA 26: 20-часовая агаровая культура дает агглютинацию только с НА 4 поливалентной диагностической протейной сухой кроличьей сывороткой.

Способы определения активности ЛТ-энтеротоксина:
- субплантарное введение мышам весом 15-16 г 0,05 центрифугата 20-40 часовой бульонной культуры вызывает отек лапки не менее 120 мг. (Аксенова Е. В. 1980 г.)
- интраназальное введение 0,05 мг 20-40 часовой бульонной культуры вызывает гибель 95% мышей-самцов весом 15-16 г в течение 20 мин при явлениях тонических судорог и асфиксии (Войно-Ясенецкая Н.К. 1957 г);
- внутримышечное введение 300 млн микробных клеток к 20-часовой бульонной культуры вызывает некроз кожи кролика диаметром более 3,5 см;
- в опыте петля тонкой кишки кролика при введении 500 млн. м.т. 20-часовой бульонной культуры дает положительный результат;
- гретый при 56^oC в течение 45 мин центрифугат 20-часовой бульонной культуры вызывает "отек лапки" мышей до 30 мг, не вызывает некрозы кожи кролика. Гретая при 100^oC 20-часовая бульонная культура не вызывает накопления жидкости в изолированной петле тонкого кишечника кролика /v/l 0,3/.

Условия хранения культуры после леофильной сушки при выращенной в 0,3%-ном МПА /pH 7,2-7,4/, залитом стерильным вазелиновым маслом, при 4^oC.

Среды для размножения - бульон Хоттингера /pH 7,2-7,4/, содержащий 5% эритроцитов кролика при 35-36^oC в течение 20 ч.

Генетические особенности: Hly + : pen^R: Ent⁺; Hag(MS⁺/MR⁺) устойчив к пенициллину, мономицину, неомицину, полимиксину, тетрациклину, линкомицину, эритромицину, ристомицину, оксациллину, левомицетину.

Пример 1. 0,1 мл 1 млрд. суспензии суточной агаровой культуры в физиологическом растворе сеют в стерильный бульон Хоттингера /5 мл pH 7,2-7,4/ инкубируют в термостате при 36^oC в течение 20 ч., центирифугируют при 6000 об/мин в течение 7 мин. Полученную надосадочную жидкость /центрифугат/ в объеме 0,05 мл вводят субплантарно в заднюю левую лапку мышей-самцов весом 15-16 г. Через 24 ч животных умерщвляют эфиром и ампутированные по голеностопному суставу лапки взвешивают на торсионных весах. При этом центрифугат штамма P. mirabilis ГИСК N 238 давал разницу между левой и правой лапками не менее 120 мл, остальные 20 штаммов, способные продуцировать ЛТ-энтеротоксин от 65 до 90 мг. Контроленативный стерильный бульон Хоттингера /pH 7,2-7,4/ и гретый при 56^oC центрифугат 20-часовой бульонной культуры 30-35 мг соответственно.

Результаты приведены в таблице.

Пример 2. 0,1 мл 1 млрд. суспензии суточной агаровой культуры сеют в бульон Хоттингера /pH 7,2- 7,4/, инкубируют в термостате при 36^oC в течение 20 ч и 500 млн м.т суспензию в объеме 1 мл вводят в сегмент изолированной петли тонкого кишечника кролика. Через 16 ч животных умерщвляют воздушной эмболией и рассчитывают отношение объема эксудата к длине сегмента /v/l/. При этом 20-часовая бульонная культура штамма Proteus mirabilis ГИСК 238 оказалась способной давать накопления жидкости в большом количестве и показатель v/l составил 1,3. У остальных 20 штаммов, способных продуцировать ЛТ-энтеротоксин, показатель v/l колебался в пределах от 0,9 - 1,0. При введении стерильного бульона Хоттингера и гретой при 100^oC 20-часовой бульонной культуры отношение объема накопленной жидкости и длине сегмента v/l составило 0,25 и 0,3 соответственно.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения термолабильного энтеротоксина и анатоксина Proteus mirabilis при производстве вакцин. Штамм P.mirabilis 3106 выделен от больного с урологической инфекцией в 1992 г., депонирован в коллекции Государственного научно-исследовательского института стандартизация и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича и имеет регистрационный номер 238. Генетические особенности штамма: Hly⁺ : Pen^R : Ent⁺ : Hag(MS⁺(MR⁺) устойчив к пенициллину, неомицину, мономицину, полимиксину, тетрациклину, линкомицину, зритромицину, ристомицину, оксациллину, левомицетину. Штамм P.mirabilis ГИСК 238 обладает повышенной токсинопродукцирующей способностью. 1 табл.

Штамм бактерий Proteus mirabilis ГИСК 238 - продуцент термолабильного энтеротоксина.