ШТАММ БАКТЕРИЙ Salmonella dublin №19, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИН И ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2003 года по МПК A61K39/112 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/42 

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, в частности к получению штамма Salmonella dublin, пригодного для использования в вакцинах и диагностических препаратах против сальмонеллеза сельскохозяйственных животных.

Сальмонеллез крупного рогатого скота - инфекционная болезнь, характеризующаяся явлениями бактериемии, токсемии, абортами или рождением нежизнеспособного молодняка. Наиболее подвержен молодняк в возрасте 10-30 дней. При остром течении у молодняка проявляется - угнетение, отказ от корма, повышение температуры до 41^oС, затем парезы передних конечностей и, при несвоевременном лечении, через 36-48 ч наступает смерть. При затяжном течении болезни на 2-3 сутки у телят появляется диарея.

Заболевание распространяется по типу энзоотии, нарастает постепенно и длительное время держится на высоком уровне. Нередко переболевают до 80-90% телят при уровне летальности 20-80%.

Ущерб складывается из затрат на лечение, гибели молодняка.

Заболевание регистрируется во всех регионах страны, в связи с этим становится очевидным актуальность борьбы с данным заболеванием.

Известен аттенуированный штамм Salmonella dublin ВГНКИ 9-16/2, обладающей стабильной низкой остаточной вирулентностью, высокой иммуногенностью и используемый для приготовления моно- и бивалентной вакцины против сальмонеллеза телят.

Особенностью штамма является наличие в его геноме двух мутаций (в гене Su-Str и стрептомициновом локусе), независимо одна от другой снижающих вирулентность и обеспечивающих стабильность низкой остаточной вирулентности.

Аттенуированный штамм Salmonella dublin ВГНКИ 9-16/2 характеризуется следующими свойствами:
Морфологические признаки. Микроб представляет собой мелкие грамотрицательные палочки без спор и капсул, длиною 1,5-2 мкм, шириною 0,3-0,5 мкм. Клетки подвижные с перетрихиально расположенными жгутиками.

Культуральные свойства. На МПБ образует равномерное помутнение через 8-10 ч роста при 37^oС; на МПА через 24-26 ч роста при 37^oС образует колонии диаметром 1-2 мм в S-форме: прозрачные, круглые, гладкие, мелкозернистые, выпуклые. Штамм растет на питательных средах, содержащих 500 ед./см³ стрептомицина.

Ферментативные свойства. Сбраживает с образованием кислоты и газа глюкозу, мальтозу, маннит, арабинозу, сорбит, ксилозу, образует сероводород; не сбраживает сахарозу, лактозу, раффинозу, не свертывает молоко, не разжижает желатин, не образует индол.

Антигенная сруктура. Агглютинируется монорецепторными 0-сыворотками: 1, 9, 12 и Н-сывороткой первой фазы - qp.

Вирулентные свойства. Остаточная вирулентность аттенуированного штамма, выраженная в ЛД₅₀ при подкожном заражении белых мышей массой 14-16 г составляет (2,4±0,2)•10⁷ клеток.

Иммуногенные свойства. Иммуногенность аттенуированного штамма изучали в сравнении с иммуногенностью гретых клеток вирулентного штамма. Иммуногенность аттенуированного штамма была в среднем выше в 12 раз иммуногенности инактивированных клеток (индекс эффективности соответственно 199 и 16) [1].

Известен также штамм Salmonella dublin 1449, используемый в качестве антигена серовара Salmonella dublin в инактивированной эмульсин-вакцине против сальмонеллеза телят.

Штамм Salmonella dublin 1449 обладает следующими свойствами.

Культурально-морфологические признаки. Грамотрицательные мелкие палочки с закругленными концами, длиной 1-6 мкм, шириной 0,4-0,6 мкм, подвижные. Хорошо растет на обычных питательных средах, на бульоне образует осадок, равномерное помутнение среды, пленку и пристеночное кольцо. На полужидком агаре растет по всему столбику среды.

Физико-биологические свойства. Аэроб, способный расти в микроанаэробных условиях. Оптимум рН 7,2 при температуре 37^oС.

Ферментативные свойства. Не расщепляет мочевину, индол не образует, выделяет сероводород, ферментирует глюкозу, сорбит, арабинозу, мальтозу, утилизирует цитрат, малонат натрия, цитрат натрия с глюкозой; имеет ферменты лизиндекарбоксилазу и орнитиндекарболазу.

Серологические свойства. Агглютинируется сальмонеллезными 0-сыворотками: 1, 9, 12; H-g, p-.

Патогенные свойства. Патогенен для белых мышей: ЛД₅₀ равна 5•10³ клеток при внутрибрюшинном заражении [2].

В задачу наших исследований входило - получить штамм Salmonella dublin, обладающий стабильно низкой остаточной вирулентностью, высокой иммуногенностью и используемый для приготовления вакцин против сальмонеллеза телят и пушных зверей, а также в диагностических препаратах.

Предложенный штамм Salmonella dublin 19, возбудитель сальмонеллеза отнесен к семейству Enterobacteriaceae к роду Salmonella, выделен в НИЛ инфекционной патологии и биотехнологии МГАВМиБ из фекалий теленка, животноводческое хозяйство Нижегородской обл. в 1987 г.

Предложенный штамм депонирован 27 апреля 2001 г., регистрационный номер -"штамм Salmonella dublin 19 - МГАВМиБ - ДЕП" во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (123022, Россия, Москва, Звенигородское шоссе, 5, ВГНКИ).

Местом хранения производственного штамма Salmonella dublin 19 возбудителя сальмонеллеза определена коллекция НИЛ инфекционной патологии и биотехнологии МГАВМиБ им. К. И. Скрябина 109472, Москва, ул. Ак. Скрябина, 23), дублирующее хранение НИИ микробиологии МО РФ (610024, Россия, г. Киров, Октябрьский пр., 121, в/ч 23527).

Предложенный производственный штамм Salmonella dublin 19 обладает следующими свойствами.

Морфологические признаки. Микроб представляет собой мелкие грамотрицательные палочки, не образует спор и капсул. Клетки подвижны.

Культуральные свойства. На плотной питательной среде через 18-24 ч роста при температуре 37^oС образует полупрозрачные с ровными краями, выпуклые колонии в S-форме. На МПБ образует равномерное помутнение среды.

Ферментативная активность. Ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу, рамнозу, сорбит, маниит, не ферментирует лактозу, сахарозу, мальтозу, инозит, не гидролизует мочевину, образует сероводород, не образует индол и ацетилметилкарбинол в реакции Фогес-Проскауэра.

Серологические свойства. Агглютинируется с сальмонеллезной монорецепторной сывороткой 09 и Н-сыворотками Р.G.

Токсигенность, Sаlmonella dublin является продуцентом эндотоксинов.

Белковая структура
Нуклеотидный состав ДНК (% ГЦ) - 52,9.

Лизируется сальмонеллезным поливалентным бактериофагом.

Вирулентные свойства. При внутрибрюшинном введении белым мышам ЛД₅₀ составляет 3,2•10⁶ живых микробных клеток (м.к.).

Патогенен для телят. При пероральном заражении телят в концентрации 10 млрд м.к. на 2 сутки отмечают профузный понос. Гибель наступает на 3-4 сутки с характерными паталогоанатомическими поражениями, свойственными сальмонеллезу.

Применяемый способ хранения и поддержания штамма. В лиофилизированном состоянии под вакуумом в герметично запаянных ампулах при минус 18-20^oС после пассажа через организм белых мышей.

Периодичность пересева на питательных средах 15-20 суток.

Условия транспортировки. В лиофилизированном состоянии под вакуумом в герметично запаянных ампулах.

Срок хранения 10 лет.

Пример. Штамм Salmonella dublin 19 выращивают в реакторах в казеиновом бульоне. Плотность посева составляет 100-300 млн м.к. на 1 см³ питательной среды.

Культивирование проводят при температуре 36-38^oС при интенсивном механическом перемешивании и аэрации стерильным воздухом из расчета - объем стерильного воздуха на объем среды в минуту (в соотношении 1:2).

Концентрация микробных клеток через 16-18 ч составляет 40-50 млрд м.к. по оптическому стандарту мутности ГИСК им. К.А. Тарасевича, что дало возможность применить штамм для изготовления вакцины против сальмонеллеза сельскохозяйственных животных и пушных зверей.

Вакцина, изготовленная с использованием предложенного штамма обеспечивает защитный эффект от заражения вирулентными эпизоотическими штаммами на 5-7 сутки.

Вакцина из производственного штамма Salmonella dublin 19 апробирована с положительным результатом с 1995 по 2001 гг. на территории России и стран СНГ (Беларусь, Кыргызстан, Узбекистан и др.) на стельных коровах (11550), супоросных свиноматках (7290), овцематках (4270), пушных зверях (2290).

Сохранность поголовья составляет 96-99%.

Предложенный штамм может быть использован для производства вакцин и диагностикумов, а также для получения гипериммунных лечебных сывороток и глобулинов.

Источники информации
1. Патент РФ 1197186, кл. А 61 К 39/112, С 12 N 1/00, 1994.

2. Патент РФ 2154495, кл. А 61 К 39/112, С 12 N 1/20, 2000.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии. Штамм бактерий Salmonella dublin 19 обладает морфологическими, культуральными и ферментативными свойствами, присущими роду Salmonella. По серологическим свойствам предложенный штамм агглютинируется с сыворотками: монорецепторной 09 и Н-сыворотками P.G. Штамм является продуцентом эндотоксинов. Имеет белковую структуру. Нуклеотидный состав ДНК (% ГЦ) - 52,9. Лизируется сальмонеллезным поливалентным бактериофагом. При внутрибрюшинном введении белым мышам ЛД₅₀ составляет 3,2•10⁶ живых микробных клеток (м.к.). Патогенен для телят, при заражении в концентрации 10 млрд м.к. на 2 сутки отмечают профузный понос, а на 3-4 сутки - гибель животного. Концентрация микробных клеток при выращивании штамма составляет 40-50 млрд м.к. по оптическому стандарту мутности, защитный эффект от заражения вирулентными штаммами наступает на 5-7 сутки. Штамм пригоден для изготовления вакцин, диагностических препаратов по сальмонеллезу животных, а также для получения гипериммунных лечебных сывороток и глобулинов.

Штамм бактерий Salmonella dublin ВГНКИ №19 - МГАВМ и Б-ДЕП, используемый для изготовления вакцин и диагностических препаратов.