ШТАММ БАКТЕРИЙ Proteus vulgaris № 25, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ИММУННЫХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2003 года по МПК C12N1/20 A61K39/02 C12N1/20 C12R1/37 

Предлагаемое изобретение относится к ветеринарной биотехнологии и может быть использовано в получении иммунных препаратов против возбудителей острых кишечных инфекций сельскохозяйственных животных.

Среди условно-патогенных энтеробактерий наиболее частыми возбудителями ОКИ (острых кишечных инфекций) являются Proteus mirabilis и Proteus vulgaris.

Условно-патогенные энтеробактерии являются естественными обитателями кишечника человека и многих животных, в том числе сельскохозяйственных.

Условно-патогенные энтеробактерии широко распространены в природе: доказано их постоянное пребывание в воде открытых водоемов, особенно протеев.

По восприимчивости можно выделить - группу риска - это новорожденные, ослабленные дети, лица с хроническими недугами, пациенты, подвергавшиеся антибактериальной терапии или хирургическим вмешательствам. Из вышесказанного становится очевидной проблема борьбы с энтеробактериями рода Proteus (1).

Известен штамм бактерий Proteus vulgaris 154, используемый в качестве тест-объекта для определения токсинообразующей способности бактерий рода Proteus.

Штамм бактерий Proteus vulgaris 154 характеризуется следующими свойствами.

Культурально-морфологические признаки. На среде Плоскирева образуются изолированные, полупрозрачные колонии желтоватого оттенка, с ровными краями, кремообразной консистенции. Диаметр колоний 2-3 мм.

На средах Левина, Эндо, Вильсон-Блера, кровяном агаре, слабощелочном МПА растет в виде нежного полупрозрачного налета (феномен роения).

На жидких средах дает гомогенное помутнение среды.

Полиморфная грамотрицательная подвижная палочка. Спор и капсул не образует.

Физико-биохимические свойства. Оптимум роста 37^oC, оптимум рН 7,2-7,4.

Ферментативные свойства. Окисляет и ферментирует глюкозу, расщепляет мочевину, образует индол и сероводород, не ферментирует лактозу и дульцит, не расщепляет малонат натрия, расщепляет мальтозу и сахарозу, не декарбоксилирует орнитин, не обладает цитохромоксидазной активностью. Дает положительную реакцию с метиловым красным и отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра, дезаминирует фенилаланин, не образует аргинингидролазу и лизиндекарбоксилазу.

Антигенная формула 047:Н1 (схема Кауфмана-Перч).

Биологические свойства.

Способен вызывать раннюю (через 6 часов) гибель белых мышей при интраназальном заражении в результате серозно-геморрагического отека легких.

ЛД₅₀ при внутрибрюшинном введении белым мышам в полужидком агаре составляет 625 тыс. микр. тел.

Штамм вызывает гемолиз бараньих эритроцитов в агаре с диаметром зоны гемолиза до 10 мм.

Хранение культуры - в толще 1%-ного голодного агара под слоем стерильного вазелинового масла или на среде Дорсе.

Биологические свойства полностью утрачиваются после прогревания в течение 30 мин при 56-60^oС.

Продуцирует термолабильные вещества типа холероподобного энтеротоксина (2).

В задачу наших исследований входило - получить штамм Proteus vulgaris, предназначенный для получения иммунных препаратов.

Предложен штамм бактерий Proteus vulgaris 25, возбудитель протейной инфекции, отнесен к семейству Enterobacteriaceae, к роду Proteus, выделен в НИЛ инфекционной патологии и биотехнологии МГАВМиБ им. К.И. Скрябина из органов новорожденного теленка в 1987 году.

Предложенный производственный штамм Proteus vulgaris 25 депонирован 27 апреля 2001 г. Регистрационный номер - "штамм Proteus vulgaris 25 МГАВМиБ - ДЕП" во Всероссийской государственной коллекции микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (123022, Россия, Москва, Звенигородское шоссе, 5, ВГНКИ).

Местом хранения производственного штамма Proteus vulgaris 25 возбудителя протейной инфекции определена коллекция НИЛ инфекционной патологии и биотехнологии МГАВМиБ им. К.И. Скрябина (109472, Москва, Скрябина, 23), дублирующее хранение НИИ микробиологии МО РФ (610024, Россия, г. Киров, Октябрьский пр-т, 121. в/ч 23527).

Предложенный производственный штамм бактерий Proteus vulgaris 25 обладает следующими свойствами.

Морфологические признаки. Грамотрицательные палочки, расположенные одиночно. Подвижны.

Культуральные свойства. На плотных питательных средах образует характерный рост. На МПА обладает свойством "роения", на Плоскирева - полупрозрачные колонии розоватого цвета с перламутровым оттенком. На МПБ равномерное помутнение с образованием надосадочной пленки. На 5%-ном кровяном агаре образует зоны гемолиза. Ферментативные свойства. Ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу, рамнозу, мальтозу, сахарозу, не ферментирует сорбит, инозит, маннит, гидролизует мочевину, образует индол и сероводород, реакция Фогес-Проскауэра - отрицательная.

Серологические свойства. Агглютинируется с адсорбированными протейными О и Н сыворотками производства НИИВС им. Мечникова как Proteus vulgaris O16 и Н6.

Патогенные свойства. ЛД₅₀ для белых мышей внутрибрюшинно 5,8•10⁸ живых микробных клеток.

Штамм Proteus vulgaris 25, патогенный для телят, при пероральном заражении 10 млрд. взвеси микробных клеток через 8-10 часов после инфицирования отмечали угнетение общего состояния, повышение температуры тела и на 2-3 сутки у животного наблюдали диарею различной степени, а у некоторых - профузный понос и на 4 сутки 40% инфицированных животных пало.

Лизируется колибактерийным бактериофагом.

Генетические особенности.

Устойчив: к тетрациклину, пенициллину, стрептомицину, полимиксину, левомицетину, гентамицину, эритромицину, пефлоксацину.

Чувствителен: к сизомицину, офлоксацину, пиперациллину, рокситромицину.

Применяемый способ хранения и поддержания штамма. В лиофилизированном состоянии под вакуумом в герметично запаянных ампулах при минус 18... минус 20^oС после пассажа через организм белых мышей.

Периодичность пересева на питательных средах 15-20 суток.

Условия транспортировки. В лиофилизированном состоянии под вакуумом в герметично запаянных ампулах.

Срок хранения 10 лет.

Пример. Приготовление посевной субкультуры проводят в два этапа. Сначала проводят выращивание на МПА в течение 48 часов при температуре 36...38^oС, затем пересевают на жидкую питательную среду на основе ферментативного гидролизата мяса в бутыли и культивируют при температуре 36...38^oС с аэрацией стерильным воздухом из расчета 4-6 объемов на объем питательной среды в течение 24-48 час.

Выход биомассы при этом составляет 20...30 млрд. микробных клеток.

В реакторах культивирование проводят в казеиновом бульоне (гидролизат казеина с содержанием 200-220 мг% аминного азота, пептона 0,2-0,4%).

Вакцина, изготовленная с использованием в ней штамма Proteus vulgaris 25, обеспечивает защитный эффект от заражения вирулентными эпизоотическими штаммами на 5-7 сутки.

Вакцина апробирована с положительным результатом с 1995-2001 г. на территории России: Ставропольский, Краснодарский края, Московская и Тульская области и странах СНГ: Беларусь, Кыргызстан, Узбекистан.

Сохранность поголовья составляет 95-99%.

Предложенный штамм Proteus vulgaris 25 обладает высокой иммуногенной активностью и может быть использован как один из антигенных компонентов в ассоциированной вакцине против острых кишечных инфекций молодняка сельскохозяйственных животных.

Источники информации
1. Кн. "Руководство по эпидемиологии инфекционных болезней", изд. "Медицина", т. 2, 1993, стр. 78-80.

2. МКИ⁴ А.С. РФ 1497210, С 12 N 1/20; С 12 R 1/37, 1989.

Изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии. Штамм бактерий Proteus vulgaris 25 обладает морфологическими и культуральными свойствами, присущими роду Proteus. Ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу, рамнозу, мальтозу, сахарозу, не ферментирует сорбит, инозит, маннит, гидролизует мочевину, образует индол и сероводород, реакция Фогес-Проскауэра - отрицательная. По серологическим свойствам штамм агглютинируется с адсорбированными протейными О и Н сыворотками как Proteus vulgaris О16 и Н6. ЛД₅₀ для белых мышей внутрибрюшинно 5,8•10⁸ живых микробных клеток. При пероральном введении новорожденным телятам в концентрации 10 млрд. микр. клеток на 2-3 сутки вызывает признаки диареи, а на 4 сутки наступает гибель 40% инфицированных животных. Лизируется колибактерийным бактериофагом. Штамм Proteus vulgaris 25 устойчив к тетрациклину, пенициллину, стрептомицину, полимиксину, левомицетину, гентамицину, эритромицину, пефлоксацину. Чувствителен к сизомицину, офлоксацину, пиперациллину, рокситромицину. Выход микробной массы составляет 25-30 млрд. микр. тел на 1 мл. Штамм пригоден при изготовлении иммунных препаратов против протейных инфекций сельскохозяйственных животных.

Штамм бактерий Proteus vulgaris ВГНКИ № 25 МГАВМ и Б-ДЕП, используемый для изготовления иммунных препаратов.